裴智鵬，鄭雪艷，何冰芳，儲(chǔ)建林

(1.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211800；2.常州市第一人民醫(yī)院，江蘇 常州 213003；3. 南京工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 211800)

雙向發(fā)酵是運(yùn)用現(xiàn)代微生物學(xué)技術(shù)將某種藥食兼用真菌作為發(fā)酵菌種，接種于含有一定比例中草藥成分的藥性基質(zhì)上進(jìn)行發(fā)酵的技術(shù)[1]。藥用真菌以添加了中草藥的藥性基質(zhì)為培養(yǎng)基，吸收中草藥中的活性成分，經(jīng)過藥用真菌豐富的酶系以及代謝的作用，會(huì)產(chǎn)生新的代謝產(chǎn)物。真菌多糖是從真菌子實(shí)體、菌絲體及其發(fā)酵產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物中提取得到，大多為具有不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)與特性的雜多糖。研究表明許多藥用真菌來源的水提活性多糖具有免疫增強(qiáng)、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、降血脂以及抗氧化等廣泛的生物活性[2]。因此，一般采用離子交換色譜、葡聚糖凝膠色譜等多種方法組合使用進(jìn)行分離多糖。

靈芝是中國傳統(tǒng)的藥用真菌之一，已被證明具有保護(hù)肝臟、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等作用[2-4]，靈芝的水提多糖組分是其中重要的生物活性物質(zhì)之一。在對(duì)靈芝-黃芪雙向發(fā)酵菌質(zhì)水提多糖分離的過程中，筆者發(fā)現(xiàn)靈芝-黃芪雙向發(fā)酵體系對(duì)靈芝菌發(fā)酵分泌多糖的含量有明顯的提升作用。因此，筆者對(duì)添加黃芪后多糖含量顯著增加的靈芝多糖組分PG-1和相對(duì)應(yīng)的未添加黃芪的靈芝多糖組分PG-2進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定以及免疫活性、抗腫瘤活性等生物活性研究，以期為傳統(tǒng)中藥的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與細(xì)胞系

靈芝-黃芪雙向發(fā)酵菌質(zhì)是由本實(shí)驗(yàn)室成員自制。

巨噬細(xì)胞系RAW 264.7來自中國科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所，人肺腺癌A549細(xì)胞和人肝癌細(xì)胞系Hep-G2來自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。

1.1.2 主要試劑

苯酚、H2SO4、乙醇、NaOH、剛果紅均為國產(chǎn)分析純；標(biāo)準(zhǔn)糖為中國藥品生物制品檢定。

1.2 發(fā)酵菌質(zhì)多糖的提取、分離和純化方法

1.2.1 多糖的含量測(cè)定

多糖的含量測(cè)定采用苯酚-硫酸法[5]。

1.2.2 多糖的提取

發(fā)酵菌質(zhì)水提多糖的提取條件為液料比30∶ 1，提取時(shí)間3 h，提取溫度91 ℃。提取后過濾，多糖粗提液使用大孔樹脂脫色，Sevage法脫蛋白[6]，透析除去無機(jī)鹽和小分子后，濃縮，終體積分?jǐn)?shù)75%乙醇沉淀，無水乙醇洗滌，烘干。

1.2.3 多糖的分離純化

分別將處理好的添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%黃芪未發(fā)酵的全性基質(zhì)的水提多糖、未添加黃芪發(fā)酵的菌質(zhì)多糖和添加12%黃芪發(fā)酵的菌質(zhì)多糖使用DEAE-Sepharose FF進(jìn)行離子交換層析，蒸餾水洗脫至洗脫液無糖，再利用NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫得到添加12%黃芪發(fā)酵的菌質(zhì)多糖組分PG-1和未添加黃芪發(fā)酵的菌質(zhì)多糖組分PG-2。

使用Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱對(duì)PG-1和PG-2組分進(jìn)行分離，使用去離子水洗脫，進(jìn)行純度鑒定。

多糖得率計(jì)算見式(1)。

(1)

1.3 分子量及初級(jí)結(jié)構(gòu)鑒定方法

1.3.1 分子量測(cè)定方法

Waters-1525型高效液相色譜儀，TOSOH公司的TSK-gei G-5000型排阻色譜柱，示差檢測(cè)器，柱溫為30 ℃，去離子水為流動(dòng)相，流速為0.5 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL。

1.3.2 單糖組成分析

高效凝膠滲透色譜法：色譜柱為Bio-Rad Aminex HPX-87H(300 mm×7.8 mm)，示差折光檢測(cè)器，檢測(cè)器溫度為35 ℃，柱溫為55 ℃，以5 mmol的稀H2SO4為流動(dòng)相，流速為0.6 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL。

1.3.3 紫外吸收光譜分析

將PG-1和PG-2配制成溶液，置于紫外-可見光分光光度計(jì)中，在190 ～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波段掃描。

1.3.4 紅外吸收光譜分析

取PG-1和PG-2干燥樣品1 mg，置于Thermo ScientificTMNicoletTMiSTM5 FT-IR 光譜儀中，在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行紅外掃描。

1.3.5 糖苷鍵分析

分別稱取PG-1、PG-2樣品5 mg，溶解于5 mL NaOH溶液(0.2 mol/L)中，置于恒溫水浴鍋，45 ℃反應(yīng)3 h。將反應(yīng)后的溶液置于紫外-可見光分光光度計(jì)中，在190～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波段掃描[7]。

同時(shí)稱取PG-1、PG-2樣品5 mg，溶解于5 mL去離子水中，置于恒溫水浴鍋中，45 ℃反應(yīng)3 h。將反應(yīng)后的溶液置于紫外-可見光分光光度計(jì)中，在190～400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波段掃描。

1.3.6 三螺旋結(jié)構(gòu)分析

配制40 μmol/L的剛果紅溶液，分別稱取PG-1、PG-2樣品5 mg，溶解于4 mL溶液中。在溶液中滴加1 mol/L NaOH溶液，使溶液的NaOH濃度從0梯度提升至0.5 mol/L，將各堿性梯度的溶液置于紫外-可見光分光光度計(jì)中，進(jìn)行全波段掃描，測(cè)定各NaOH濃度下的最大吸收值[8]。

1.4 多糖生物活性

1.4.1 多糖對(duì)巨噬細(xì)胞的增殖作用

采用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法(MTT法)考察多糖對(duì)RAW264.7增殖的影響。將RAW264.7細(xì)胞在96孔板中以5×104個(gè)/mL的密度培養(yǎng)在37 ℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中24 h。棄培養(yǎng)基，用培養(yǎng)基配制不同質(zhì)量濃度的多糖溶液(0、6.25、12.5、25、50和100 μg/mL)，100 μL/孔加入細(xì)胞，在37 ℃培養(yǎng)箱孵育24 h。每組設(shè)6個(gè)平行組，同時(shí)設(shè)置空白調(diào)零孔。24 h后，在每孔細(xì)胞中加入20 μL現(xiàn)配MTT(5 mg/mL)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h以形成紫色晶體。4 h后將培養(yǎng)基吸出，每孔加入150 μL二甲基亞砜溶解晶體，靜置20 min后，用酶標(biāo)儀在595 nm處測(cè)量吸光度。

細(xì)胞增殖率按照公式(2)計(jì)算[9]。

細(xì)胞增殖率=(樣品組平行實(shí)驗(yàn)的吸光值-正常對(duì)照組平行實(shí)驗(yàn)的吸光值)/正常對(duì)照組平行實(shí)驗(yàn)的吸光值×100%

(2)

1.4.2 多糖對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬作用的影響

通過巨噬細(xì)胞對(duì)中性紅的吞噬量估計(jì)巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞的吞噬能力。每孔100 μL RAW264.7巨噬細(xì)胞(5×104個(gè)/mL)加入96孔板，在37 ℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。用培養(yǎng)基配制不同濃度多糖(0、6.25、12.5、25、50和100 μg/mL)和LPS(1 μg/mL)溶液，吸出培養(yǎng)基，每孔100 μL，加入多糖溶液和LPS對(duì)照，再加入生理鹽水配制的0.075%中性紅100 μL/孔，在37 ℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h。每組設(shè)6個(gè)平行組，同時(shí)設(shè)置空白調(diào)零孔。棄去培養(yǎng)基，用PBS(pH 7.2～7.4)洗滌巨噬細(xì)胞2次。然后加入細(xì)胞裂解液100 μL/孔，在常溫下輕微振蕩10 min。使用酶標(biāo)儀測(cè)量570 nm處的吸光度[10]。

按照式(2)計(jì)算巨噬細(xì)胞吞噬中性紅的增長率。

增長率=(樣品組平行實(shí)驗(yàn)的吸光值-正常對(duì)照組平行實(shí)驗(yàn)的吸光值)/正常對(duì)照組平行實(shí)驗(yàn)的吸光值×100%

(3)

1.4.3 多糖對(duì)巨噬細(xì)胞的保護(hù)作用

采用MTT法考察多糖對(duì)RAW264.7的保護(hù)作用。將RAW 264.7細(xì)胞在96孔板中以5×104個(gè)/mL的菌密度在37 ℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。然后將100 μL/孔多柔比星(DOX)(5×10-3μmol/mL)加入含有不同濃度多糖和LPS的細(xì)胞中，37 ℃孵育24 h，每組設(shè)6個(gè)平行組，同時(shí)設(shè)置空白調(diào)零孔。24 h后，在細(xì)胞中加入20 μL MTT(5 mg/mL)培養(yǎng)4 h以形成紫色晶體。吸去培養(yǎng)基，每孔加入150 μL二甲基亞砜溶解晶體，靜置20 min后用酶標(biāo)儀在595 nm處測(cè)量吸光度[9]。

1.4.4 多糖對(duì)人肺腺癌細(xì)胞A549和人肝癌細(xì)胞Hep-G2腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用

采用MTT法考察多糖對(duì)人肺腺癌細(xì)胞A549和人肝癌細(xì)胞Hep-G2腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用。用DMEM培養(yǎng)基將HepG-2和A549細(xì)胞稀釋至5×104個(gè)/mL，按100 μL/孔將細(xì)胞加入96孔板，在37 ℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，24 h之后吸去培養(yǎng)基，加入不同濃度的多糖，分別培養(yǎng)24、48和72 h。每組設(shè)6個(gè)平行組，同時(shí)設(shè)置空白調(diào)零孔。24、48和72 h后在細(xì)胞中加入20 μL MTT(5 mg/mL)溫育4 h以形成紫色晶體。吸去培養(yǎng)基，每孔加入150 μL二甲基亞砜溶解晶體，靜置20 min后用酶標(biāo)儀在595 nm處測(cè)量吸光度[9,11]。

按照式(4)計(jì)算多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制率。

抑制率=(對(duì)照組平行實(shí)驗(yàn)的吸光值-樣品組平行實(shí)驗(yàn)的吸光值)/對(duì)照組平行實(shí)驗(yàn)的吸光值×100%

(4)

2 結(jié)果與討論

2.1 靈芝-黃芪雙向發(fā)酵菌質(zhì)多糖的提取、分離和純化

2.1.1 多糖的DEAE離子交換柱層析分離結(jié)果

收集全性基質(zhì)水提多糖、未添加黃芪發(fā)酵的菌質(zhì)水提多糖和添加12%黃芪發(fā)酵的菌質(zhì)水提多糖各級(jí)分洗脫液，經(jīng)過旋蒸濃縮，透析除鹽后冷凍干燥，各級(jí)分得率如表1所示。

表1 樣品各洗脫級(jí)分多糖得率

圖1～3為3種菌質(zhì)水提多糖梯度洗脫曲線。由圖1～3結(jié)果比較，發(fā)現(xiàn)0.50 mol/L NaCl濃度洗脫組分峰(45～50管)僅添加黃芪后才出現(xiàn)，因此推測(cè)為黃芪本身含有的多糖組分；圖2中的0.35 mol/L(32～35管)NaCl濃度洗脫組分峰PG-2，圖3中的0.35～0.40 mol/L(31～41管)NaCl濃度洗脫組分峰PG-1為靈芝菌發(fā)酵后才出現(xiàn)，因此推測(cè)PG-1和PG-2為靈芝菌發(fā)酵產(chǎn)生的多糖；根據(jù)各級(jí)分得率可知，添加12%黃芪發(fā)酵的菌質(zhì)比未添加黃芪發(fā)酵的菌質(zhì)在各多糖組分含量上均有增加，說明添加黃芪對(duì)于靈芝菌發(fā)酵分泌多糖有促進(jìn)作用。尤其是推測(cè)為靈芝菌發(fā)酵產(chǎn)生的多糖組分，添加12%黃芪發(fā)酵的菌質(zhì)多糖中的PG-1組分相較于未添加黃芪發(fā)酵的菌質(zhì)多糖中的PG-2組分增加了325%的產(chǎn)量。選擇多糖PG-1和PG-2，進(jìn)一步使用Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱色譜進(jìn)行純化。

圖1 全性基質(zhì)水提多糖梯度洗脫曲線Fig.1 Elution curves of polysaccharide of fermentation medium

圖2 未添加黃芪發(fā)酵的菌質(zhì)多糖梯度洗脫曲線Fig.2 Elution curves of polysaccharide without Astragalus

圖3 添加12%黃芪發(fā)酵的菌質(zhì)多糖梯度洗脫曲線Fig.3 Elution curves of polysaccharide with 12% Astragalus

2.1.2 多糖的葡聚糖凝膠柱層析分離結(jié)果

將PG-1組分和PG-2組分透析脫鹽、冷凍干燥后，通過進(jìn)樣器加到Sephadex G-100葡聚糖凝膠柱色譜進(jìn)行純化，使用去離子水作洗脫液，洗脫曲線為單一的對(duì)稱的洗脫峰，證明PG-1和PG-2為分子量相對(duì)均一的多糖。

2.2 分子量測(cè)定及初級(jí)結(jié)構(gòu)鑒定

2.2.1 分子量測(cè)定

根據(jù)樣品洗脫峰的保留時(shí)間和標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=7.090 3x2-148.64x+786.74，可以得到PG-1組分的分子量約為9.2×104，PG-2組分的分子量約為8.9×104。

2.2.2 單糖組成分析

圖4為葡萄糖醛酸、巖藻糖、葡萄糖、木糖和阿拉伯糖5種單糖混合標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖。圖5為多糖PG-1和PG-2水解后的HPLC圖。由圖4～5可知，PG-1組分和PG-2組分的單糖組成成分都由葡萄糖醛酸、葡萄糖、木糖和阿拉伯糖4種組成。

各單糖組成比例如表2所示。

圖4 葡萄糖醛酸、巖藻糖、葡萄糖、木糖和阿拉伯糖5種單糖混合標(biāo)準(zhǔn)品HPLC圖Fig.4 HPLC of glucuronic acid,fucose,glucose,xylose and arabinose

圖5 多糖PG-1和PG-2水解的HPLC圖Fig.5 HPLC of PG-1 and PG-2

表2 PG-1和PG-2水解單糖組分所占比例

2.2.3 紫外吸收光譜

PG-1和PG-2的紫外吸收光譜如圖6、圖7所示。由圖6和7可知，在260或280 nm波長附近無明顯吸收峰，因此推斷純化后的PG-1和PG-2基本不含蛋白質(zhì)或核酸。

圖6 多糖PG-1水溶液的紫外-可見光譜圖Fig.6 UV-vis spectrum of PG-1

2.2.4 紅外吸收光譜

圖7 多糖PG-2水溶液的紫外-可見光譜圖Fig.7 UV-Vis spectrum of PG-2

圖8 多糖PG-1的紅外光譜圖Fig.8 Infrared spectrum of PG-1

圖9 多糖PG-2的紅外光譜圖Fig.9 Infrared spectrum of PG-2

2.2.5 糖苷鍵分析

根據(jù)1.3.5節(jié)的分析方法，經(jīng)過0.2 mol/L NaOH處理后的PG-1、PG-2與其水溶液紫外吸收光譜相比，在240 nm處均有吸收增強(qiáng)，說明PG-1和PG-2糖鏈間都含有—O—糖苷鍵[8]。

2.2.6 三螺旋結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)1.3.6節(jié)的分析方法，對(duì)PG-1和PG-2進(jìn)行糖苷鍵分析，結(jié)果如圖10所示。由圖10可知：在一定NaOH濃度范圍內(nèi)，PG-1和PG-2與剛果紅形成絡(luò)合物的最大吸收波長緩慢減小，而當(dāng)NaOH濃度增加至一定濃度，高濃度的NaOH破壞分子間的作用力，三螺旋結(jié)構(gòu)間的氫鍵等作用力被破壞，造成最高吸收波長的急劇下降。因此推斷PG-1和PG-2均具有三螺旋構(gòu)象的三級(jí)結(jié)構(gòu)。PG-2組分在0.25 mol/L NaOH濃度處三螺旋結(jié)構(gòu)解體，而PG-1組分則在0.3 mol/L NaOH濃度處三螺旋結(jié)構(gòu)才解體，因此，添加黃芪發(fā)酵的菌質(zhì)多糖中的PG-1組分的三螺旋結(jié)構(gòu)比未添加黃芪發(fā)酵的菌質(zhì)多糖中的PG-2組分更加穩(wěn)定。

圖10 NaOH對(duì)PG-1、PG-2與剛果紅形成絡(luò)合物的最大吸收波長的影響Fig.10 Effects of NaOH on the maximum absorption wavelength of PG-1， PG-2 and Congo red complexes

2.3 多糖生物活性

2.3.1 多糖對(duì)巨噬細(xì)胞的增殖作用

采用MTT法考察PG-1和PG-2對(duì)RAW 264.7巨噬細(xì)胞的細(xì)胞增殖能力的影響，結(jié)果如圖11所示。

圖11 多糖PG-1和PG-2對(duì)巨噬細(xì)胞增殖作用的影響Fig.11 Effects of PG-1 and PG-2 on proliferation of RAW264.7

由圖11可知：以未添加樣品的對(duì)照組細(xì)胞的活力為對(duì)照，PG-1和PG -2的加入在6.25～100 μg/mL范圍內(nèi)無細(xì)胞毒性，并可表現(xiàn)為促RAW 264.7細(xì)胞增殖的作用。在6.25～25 μg/mL范圍內(nèi)，RAW264.7細(xì)胞的增長趨勢(shì)呈劑量依賴性。質(zhì)量濃度為25 μg/mL時(shí)，PG-1和PG-2的增殖率均最高，相對(duì)于Control組，PG-1對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖率提升了103%，PG-2對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖率提升了81%。隨著劑量的增加，增殖比逐漸下降。推測(cè)該趨勢(shì)與滲透壓有關(guān)。低濃度的多糖可以提供巨噬細(xì)胞營養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)其增殖，但隨著濃度的提升，增加的滲透壓會(huì)減緩巨噬細(xì)胞的增殖效果?？傮w而言，添加黃芪發(fā)酵的菌質(zhì)多糖中的PG-1組分作用在巨噬細(xì)胞RAW 264.7中表現(xiàn)出比未添加黃芪發(fā)酵的菌質(zhì)多糖中的PG-2組分更強(qiáng)的增殖能力。

2.3.2 多糖對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬作用的影響

PG-1組分和PG-2組分對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬中性紅能力的影響結(jié)果見圖12。從圖12可以看出，陽性對(duì)照LPS顯示了巨噬細(xì)胞吞噬中性紅能力的增強(qiáng)作用，相對(duì)于Control組，其吞噬中性紅的量增加了193%。筆者同時(shí)觀察到PG- 1和PG-2對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響存在劑量依賴性的增長趨勢(shì)，在PG-1和PG-2質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí)，PG- 1和PG-2對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響與陽性對(duì)照LPS相近，相對(duì)于Control組，其吞噬中性紅的量分別增加了173%和156%。結(jié)果表明，PG-1組分和PG-2組分可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬病原體或腫瘤細(xì)胞等外來物質(zhì)的功能，而添加黃芪發(fā)酵的菌質(zhì)多糖中的PG-1組分在促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞巨噬細(xì)胞吞噬功能上顯示出比未添加黃芪發(fā)酵的菌質(zhì)多糖中的PG-2組分更強(qiáng)的增強(qiáng)效果。

圖12 多糖PG-1和PG-2對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬中性紅作用效果比較Fig.12 Effects of PG-1 and PG-2 polysaccharides on macrophage phagocytic neutral red

2.3.3 多糖對(duì)巨噬細(xì)胞的保護(hù)作用

多糖對(duì)巨噬細(xì)胞的保護(hù)作用結(jié)果如圖13所示，不同濃度的多糖作用在被DOX處理過的細(xì)胞時(shí)，均對(duì)巨噬細(xì)胞有保護(hù)作用。從圖13可以看出：PG-1和PG-2在25 μg/mL時(shí)對(duì)巨噬細(xì)胞的保護(hù)作用顯著增強(qiáng)，在50 μg/mL時(shí)達(dá)到最大活性，此時(shí)PG-1組分作用的巨噬細(xì)胞存活率為92.0%，相較于DOX組，存活率增長了56%；PG-2組分作用的巨噬細(xì)胞存活率為89.6%，相較于DOX組，存活率增長了53.6%。已報(bào)道抗腫瘤化療藥物DOX具有促氧化劑活性的副作用，會(huì)降低巨噬細(xì)胞的存活率[12]，筆者推測(cè)純化后的多糖能夠通過降低巨噬細(xì)胞活性氧水平，減弱DOX對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞的促氧化劑活性，從而提升巨噬細(xì)胞的存活率。

圖13 多糖PG-1和PG-2對(duì)巨噬細(xì)胞保護(hù)作用效果比較Fig.13 Comparison of protective effects of polysaccharides PG-1 and PG-2 on macrophage

2.3.4 多糖對(duì)人肺腺癌細(xì)胞A549和人肝癌細(xì)胞Hep-G2腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用

多糖對(duì)人肺腺癌細(xì)胞A549和人肝癌細(xì)胞Hep-G2腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用結(jié)果測(cè)定如圖14～15所示。由圖14～15可知，PG-1和PG-2對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞和人肝癌細(xì)胞系Hep-G2有類似的抑制作用。在6.25～50 μg/mL范圍內(nèi)，抑制作用呈劑量依賴性，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，抑制作用減弱。這與Li等[9]用羊肚桿菌發(fā)酵大豆殘?jiān)蛛x的多糖對(duì)HEP-G2細(xì)胞增殖的抑制效果相似。

圖14 PG-1和PG-2在不同時(shí)間和劑量下對(duì)A549細(xì)胞的抑制作用Fig.14 Inhibitory effect of PG-1 and PG-2 on A549 cells at different times and doses

圖15 PG-1和PG-2在不同時(shí)間和劑量下對(duì)HepG-2細(xì)胞的抑制作用Fig.15 Inhibitory effect of PG-1 and PG-2 on HepG-2 cells at different times and doses

在培養(yǎng)24 h實(shí)驗(yàn)組，質(zhì)量濃度為50 μg/mL的PG-1和PG-2對(duì)A549的抑制率分別為31%和26%。相同條件下，PG-1和PG-2對(duì)于Hep-G2抑制率分別為42%和35%，因此，PG-1和PG-2對(duì)這兩株腫瘤細(xì)胞的增殖都表現(xiàn)出了明顯的抑制效果；而48 h和72 h后，PG-1和PG-2對(duì)A549的抑制率分別下降到23%、19%和20%、13%；PG-1和PG-2對(duì)Hep-G2的抑制率分別下降到36%、33%和23%、22%，這種多糖不同濃度，不同治療持續(xù)時(shí)間作用于腫瘤細(xì)胞而產(chǎn)生不同抑制效果的現(xiàn)象與Zhang等[13]液體發(fā)酵的靈芝多糖的抗腫瘤效果類似。

從整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果看來，PG-1對(duì)A549和Hep-G2細(xì)胞增殖的抑制作用較PG-2更強(qiáng)。

3 結(jié)論

靈芝黃芪雙向發(fā)酵菌質(zhì)靈芝多糖組分PG-1和未添加黃芪的靈芝菌發(fā)酵菌質(zhì)靈芝多糖組分PG-2都由葡萄糖醛酸、葡萄糖、木糖和阿拉伯糖4種組成，單糖組分摩爾比分別為12∶ 58∶ 21∶ 9和16∶ 41∶ 32∶ 11，分子量分別為9.2×104和8.9×104，由β-糖苷鍵連接，存在有O-糖苷鍵，含有三螺旋分子鏈鏈型的分子量相對(duì)均一的多糖。多糖PG-1和PG-2的單糖組分比例和分子量存在差異，說明靈芝黃芪雙向發(fā)酵體系對(duì)靈芝菌質(zhì)多糖的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定的影響。添加12%黃芪發(fā)酵的菌質(zhì)多糖中的PG-1組分相較于未添加黃芪發(fā)酵的菌質(zhì)多糖中的PG-2組分在多糖得率上增加325%，說明添加黃芪可以促進(jìn)靈芝菌多糖的分泌。

體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示PG-1和PG-2對(duì)巨噬細(xì)胞增殖作用、巨噬細(xì)胞對(duì)中性紅的吞噬作用、巨噬細(xì)胞的保護(hù)作用和對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用都具有明顯的促進(jìn)作用。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，添加黃芪的雙向發(fā)酵菌質(zhì)多糖組分PG-1顯示出比未添加黃芪的靈芝多糖組分PG-2更強(qiáng)的免疫增強(qiáng)活性和對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用，說明添加黃芪可以增強(qiáng)菌質(zhì)多糖的免疫活性和抗腫瘤活性。

靈芝中的活性物質(zhì)除了靈芝多糖外，還包括靈芝三萜、靈芝酸等其他化合物，黃芪中也含有黃芪皂苷等活性物質(zhì)，這些物質(zhì)在雙向發(fā)酵體系中，都可能被靈芝菌豐富的酶系統(tǒng)和代謝網(wǎng)絡(luò)所作用，改變其原有的組成成分，擴(kuò)大本身的藥效，如抗氧化能力、免疫調(diào)節(jié)能力等。筆者對(duì)靈芝黃芪雙向發(fā)酵產(chǎn)物僅限于對(duì)其中菌質(zhì)多糖的研究，在今后的實(shí)驗(yàn)中將會(huì)著重研究雙向發(fā)酵體系對(duì)三萜類、皂苷類等活性物質(zhì)的影響。