冀頤之，趙有璽，彭雪菲，李思宇，杜 軍,2

(1. 北京聯(lián)合大學 生物化學工程學院 生物質(zhì)廢棄物資源化利用北京市重點實驗室，北京 100023；2. 中國生物發(fā)酵產(chǎn)業(yè)協(xié)會，北京 100833)

水果是人類營養(yǎng)物質(zhì)的重要來源，也是食品工業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)原料之一。我國是世界最大的水果生產(chǎn)國，總面積和總產(chǎn)量均居世界第一。根據(jù)國家統(tǒng)計局公布的數(shù)據(jù)，至2015年，全國水果總產(chǎn)量達到2.74億 t[1]。但在果業(yè)規(guī)模化、集約化發(fā)展的同時，水果副產(chǎn)物產(chǎn)量也隨之加大，數(shù)量高達上億噸[2]。若不加以合理利用，形成農(nóng)業(yè)固體廢棄物，不僅會造成資源浪費，還會引起環(huán)境污染。因此，對水果副產(chǎn)物進行綜合利用，使其變廢為寶，消除環(huán)境污染，對我國農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展有著重要意義。

黃腐酸(fulvic acid，F(xiàn)A) 是一種溶于水的灰黑色粉末狀物質(zhì)，是腐植酸的一種，根據(jù)來源可分為礦源腐植酸和生化黃腐酸[3]。生化黃腐酸(biochemical fulvic acid，BFA)是以有機廢棄物為原料，經(jīng)多種微生物多級發(fā)酵轉(zhuǎn)化而成，具有分子量小、功能團含量多和水溶性好等特點[4]，易被生物吸收利用，在改良土壤[5]、促進植物生長[6]、飼料添加[7]、環(huán)境治理[8-10]等領(lǐng)域具有重要發(fā)展?jié)摿Α?/p>

水果副產(chǎn)物包括落果、殘次果和加工后剩余的果皮、果渣、果核、種子、葉、莖、根等下腳料以及加工廢水等[2]。近些年來，水果副產(chǎn)品的綜合利用引起了眾多研究者的關(guān)注[11-13]。其中，以果渣等水果副產(chǎn)物為原料，利用生物發(fā)酵技術(shù)開展了生化黃腐酸的研究，為果渣的資源化利用提供了有效的途徑?；萦袨榈萚14]釆用二步固體發(fā)酵工藝利用蘋果渣固體發(fā)酵生產(chǎn)黃腐酸，發(fā)酵24 d后，黃腐酸產(chǎn)率為41.2%；趙丹等[15]利用復(fù)合菌劑對蘋果渣進行混合發(fā)酵生產(chǎn)黃腐酸，黃腐酸含量可達24.3%；孫建國等[16]以蘋果渣為基質(zhì)，復(fù)合微生物發(fā)酵20～25 d，黃腐酸產(chǎn)量可達22%。

我國每年有大量的水果副產(chǎn)物，如蘋果[17]、菠蘿[18]、香蕉[19]等，其副產(chǎn)物含有豐富的纖維素，利用這些有機廢棄物生產(chǎn)附加值較高的黃腐酸，可實現(xiàn)水果副產(chǎn)物的資源化利用，產(chǎn)生巨大的社會效益和經(jīng)濟效益。本研究以蘋果渣為原料，進行黃腐酸發(fā)酵菌劑的篩選，以期為農(nóng)業(yè)固體廢棄物的資源化利用提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種分離來源

生物腐植酸樣品，某腐植酸生產(chǎn)企業(yè)提供。季也蒙酵母(Meyerozymaguilliermondii)(CICC 31056)，長枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)(CICC 41185)，保藏于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

1.1.2 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，瓊脂20.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4。

高氏一號培養(yǎng)基：可溶性淀粉20.0 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KNO30.1 g，NaCl 0.5 g，F(xiàn)eSO40.01 g，瓊脂粉20.0 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4。使用之前，在融化的培養(yǎng)基中按照每1 000 mL培養(yǎng)基中加入3.3 mL的比例加入3%的K2Cr2O7溶液。

馬丁氏培養(yǎng)基：葡萄糖10.0 g，蛋白胨5.0 g，K2HPO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，孟加拉紅33.4 mg，蒸餾水1 000 mL，pH自然。使用之前，在融化的培養(yǎng)基中按照1 000 mL培養(yǎng)基中加入0.3 mL的比例加入1%的青霉素溶液。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，NaCl 10.0 g，蒸餾水1 000 mL。

YPD培養(yǎng)基：蛋白胨20.0 g，葡萄糖20.0 g，酵母提取物10.0 g，蒸餾水1 000 mL。

PDA培養(yǎng)基：稱取200 g馬鈴薯切成小塊，加水煮沸20～30 min，8層紗布過濾，加熱，加瓊脂20 g，待瓊脂溶解完后，加入葡萄糖20 g，溶解，補足蒸餾水至1 000 mL。

果渣固態(tài)培養(yǎng)基：蘋果果渣干粉20 g，(NH4)2SO40.5 g，麩皮1.5 g，配料時加水混勻，含水分20%，裝入500 mL三角瓶中，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

LRH-150型生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學儀器有限公司；GI54T型高溫高壓滅菌鍋，致維儀器有限公司；SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺，蘇州凈化有限公司；GelDoc2000型凝膠成像系統(tǒng)，美國伯樂公司；ABI9700型PCR擴增儀，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司。

1.3 方法

1.3.1 腐植酸樣品中微生物的分離純化

稱取10 g生物腐植酸樣品，放入盛有100 mL無菌水并帶有玻璃珠的錐形瓶中，振搖10 min后，吸取菌液進行梯度稀釋，并取適宜稀釋度的液體分別涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、高氏一號培養(yǎng)基、馬丁氏培養(yǎng)基固體平板上，倒置于45 ℃生化箱中培養(yǎng)。挑取平板上生長良好，且形態(tài)特征不同的單菌落，進一步純化后，轉(zhuǎn)接于斜面培養(yǎng)，并置于冰箱4 ℃條件下保存。

1.3.2 黃腐酸生產(chǎn)菌株的篩選

將初篩菌株接入LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，以10%的接種量接入果渣固態(tài)培養(yǎng)基中，45 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)20 d。發(fā)酵過程每天補充無菌水5 mL，以補充蒸發(fā)的水分。

1.3.3 黃腐酸復(fù)合菌劑的篩選

復(fù)合菌劑1由BFA02和BFA03以體積比1∶ 1構(gòu)成；復(fù)合菌劑2由季也蒙酵母、BFA02和BFA03以體積比1∶ 1∶ 1構(gòu)成；復(fù)合菌劑3由長枝木霉、BFA02和BFA03以體積比1∶ 1∶ 1構(gòu)成；復(fù)合菌劑4由季也蒙酵母、長枝木霉、BFA02和BFA03以體積比1∶ 1∶ 1∶ 1構(gòu)成。其中，BFA02、BFA03接種至LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min過夜培養(yǎng)；季也蒙酵母接種至YPD培養(yǎng)基中，28 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h；長枝木霉接種至PDA固體斜面，28 ℃生化箱中培養(yǎng)4 d，加入無菌水，刮孢子，經(jīng)適當稀釋配制成密度為107左右的孢子懸液。各復(fù)合菌劑按上述比列混合，按10%的接種量接入果渣固態(tài)培養(yǎng)基中，45 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)20 d。發(fā)酵過程每天補充無菌水5 mL，以補充蒸發(fā)的水分。

1.3.4 黃腐酸生產(chǎn)菌株的分類鑒定

1.3.4.1 形態(tài)學特征

將純化后的菌株接種于LB固體平板培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h 后觀察其菌落生長情況和形態(tài)。挑取單個菌落制成玻片，革蘭氏染色[20]，置于光學顯微鏡下，16×100，觀察各菌株的顯微形態(tài)。

1.3.4.2 分子生物學鑒定

采用細菌菌株的通用引物：正向引物27F 5’-A￣G￣A￣G￣T￣T￣G￣A￣T￣C￣C￣T￣G￣G￣C￣T￣C￣A￣G -3’；反向引物1492R:5’-G￣G￣T￣T￣A￣C￣C￣T￣T￣G￣T￣T￣A￣C￣G￣A￣C￣T￣T-3’；進行菌落PCR，擴增16S rDNA。

PCR反應(yīng)體系： 10×Buffer(含Mg2+)2 μL，dNTP(各2.5 mmol/L)2 μL，F(xiàn)(10 μmol/L)2 μL，R(10 μmol/L)2 μL，rTaq DNA 聚合酶0.5 μL，加雙蒸水至20 μL。

PCR擴增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，25 個循環(huán)；72 ℃修復(fù)延伸7 min；最后4 ℃終止反應(yīng)。

擴增產(chǎn)物用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳回收，純化后的產(chǎn)物測序后獲得的16S rDNA 序列，登錄http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi 網(wǎng)站，用Blast 程序進行序列比對分析，選取與之相似性高的菌16S rDNA 序列，使用 MEGA 5.0 軟件比對、分析、構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Bootstrap 1 000 次進行穩(wěn)定性驗證。

1.3.5 纖維素、半纖維素及木質(zhì)素的測定

參考侯勇[21]的方法，進行纖維素、半纖維素及木質(zhì)素的測定。降解率計算見式(1)～(3)。

(1)

式中：mC1為發(fā)酵前纖維素含量，g；mC2為發(fā)酵后剩余纖維素含量，g。

(2)

式中：mH1為發(fā)酵前半纖維素含量，g；mH2為發(fā)酵后剩余半纖維素含量，g。

(3)

式中：mL1為發(fā)酵前木質(zhì)素含量，g；mL2為發(fā)酵后剩余木質(zhì)素含量，g。

1.3.6 黃腐酸的測定

采用滴定法進行黃腐酸測定[22]。黃腐酸產(chǎn)量計算見式(4)。

黃腐酸產(chǎn)量=B2-B1

(4)

式中：B1為發(fā)酵前體系中黃腐酸含量，g/kg；B2為發(fā)酵后體系中黃腐酸含量，g/kg。

2 結(jié)果與討論

2.1 黃腐酸生產(chǎn)菌株的篩選

2.1.1 黃腐酸樣品微生物的分離純化

按照方法1.3.1對生物腐植酸樣品進行分離純化。由于天然腐植酸生產(chǎn)通常是在高溫下進行，因此確定篩選溫度為45 ℃。通過平板稀釋法涂布，45 ℃培養(yǎng)4 d，僅從牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中篩選出生長良好、形態(tài)不同的4株菌株，分別編號為BFA01、BFA02、BFA03、BFA04作為本研究初篩菌株，用于后續(xù)實驗。

2.1.2 黃腐酸生產(chǎn)菌株的復(fù)篩

將初篩獲得的4株菌接種于果渣固態(tài)培養(yǎng)基中，45 ℃發(fā)酵20 d，分別測定其黃腐酸產(chǎn)量和木質(zhì)纖維素降解率，結(jié)果如圖1所示。從圖1可知，菌株BFA02、BFA03兩株菌黃腐酸產(chǎn)量較高，分別為43.67、59.35 g/kg，具有較好的黃腐酸生產(chǎn)性能。

圖1 初篩菌株的黃腐酸產(chǎn)量Fig.1 Fulvic acid production of the isolated strains

考察4株菌株的木質(zhì)纖維素降解能力，結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出菌株BFA02纖維素和木質(zhì)素降解能力較好，其纖維素和木質(zhì)素降解率分別為34.42%、29.7%。而BFA03則具有非常好的半纖維素降解能力，其降解率為32.81%。自然界中木質(zhì)纖維素的分解多依賴于纖維素、半纖維素和木質(zhì)素分解菌株的協(xié)同作用，多菌混合發(fā)酵，可提高纖維素的轉(zhuǎn)化效率[23-25]，因此選定菌株BFA02、BFA03為黃腐酸生產(chǎn)菌株，進行復(fù)配實驗。

圖2 初篩菌株的木質(zhì)纖維素降解率Fig.2 Degradation rate of cellulose,hemi cellulose and lignin by the isolated strains

2.1.3 菌株BFA02、BFA03的鑒定及進化樹構(gòu)建

2.1.3.1 菌落形態(tài)特征觀察

在45 ℃培養(yǎng)24 h 后對菌株BFA02、BFA03進行菌落形態(tài)及顯微特征的觀察，結(jié)果如圖3所示。由圖3可見：菌株BFA02菌落形態(tài)為扁平，邊緣不整齊，擴展，表面粗糙，中間有環(huán)狀隆起皺褶，乳白色、不透明。顯微鏡下觀察菌株BFA02，其為革蘭氏陽性菌，菌體均一，呈短桿狀。菌株BFA03菌落呈圓形，邊緣鋸齒狀，菌落輕微隆起，表面黏稠，白色，不透明。顯微鏡下觀察菌株BFA03，其菌體均一，呈桿狀，革蘭氏陽性菌。

圖3 菌株BFA02和BFA03的菌落形態(tài)觀察Fig.3 Colonial characteristics of strain BFA02 and BFA03

2.1.3.2 分子生物學鑒定

分析了菌株BFA02和BFA03的16S rDNA，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知：其片段長度均為1 456 bp，經(jīng)基因序列比對分析，發(fā)現(xiàn)BFA02與BacillusamyloliquefaciensHYM25相似度最高為99%，BFA03與B.licheniformisCGMCC2876相似度最高為99%?；谒鼈兊?6S rDNA所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進化樹(圖5、6)，初步確認BFA02為解淀粉芽孢桿菌，BFA03為地衣芽孢桿菌。

1—菌株BFA02的PCR擴增產(chǎn)物；2—菌株BFA03的PCR擴增產(chǎn)物；M—標準DNA圖4 菌株BFA02和BFA03的16S rDNA PCR擴增結(jié)果Fig.4 Electrophoresis of PCR amplification products of bacterial 16S rDNA from BFA02 and BFA03

圖5 菌株BFA02 16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of strain BFA02 based on 16S rDNA sequence

圖6 菌株BFA03 16S rDNA 系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of strain BFA03 based on 16S rDNA sequence

2.2 復(fù)配菌劑的篩選

研究表明，固體廢棄物在堆肥過程中，相比自然發(fā)酵，采用人工接菌的方式更有利于脂肪、蛋白質(zhì)、多糖等成分的生物降解，促進腐植酸和黃腐酸的生成[26-28]；如果同時接入木質(zhì)纖維素降解菌株，如木霉、白腐真菌等，將會更有效地加速堆肥過程[27-29]。因此，考慮將篩選獲得的黃腐酸生產(chǎn)菌株BFA02、BFA03與長枝木霉、季也蒙酵母進行復(fù)配，以獲得最佳的復(fù)合菌劑。

按1.3.3節(jié)的方法制備4組復(fù)合菌劑，分別以10%的接種量接入果渣固態(tài)培養(yǎng)基中，進行黃腐酸發(fā)酵實驗，20 d后測定其生化黃腐酸含量及木質(zhì)纖維素降解率，實驗結(jié)果見圖7～8。由圖7～8可知，復(fù)合菌劑發(fā)酵優(yōu)于單菌發(fā)酵，其黃腐酸產(chǎn)量均高于單菌發(fā)酵產(chǎn)量。其中，由BFA02、BFA03和長枝木霉構(gòu)成的復(fù)合菌劑3實驗組黃腐酸產(chǎn)量最高，可達103.19 g/kg。該實驗組纖維素、半纖維素、木質(zhì)素降解率分別為46.25%、39.49%、37.5%，均高于其他單菌或復(fù)合菌劑實驗組。文獻[30]報道，長枝木霉具有很好的木質(zhì)纖維素降解能力，可利用自身的酶系，高效分解底物，提高底物轉(zhuǎn)化率。因此，加入長枝木霉后，促進了底物轉(zhuǎn)化，提高了黃腐酸產(chǎn)量。實驗中還發(fā)現(xiàn)，當BFA02、BFA03、季也蒙酵母、長枝木霉4株菌株復(fù)配后，其各項性能低于復(fù)合菌劑3。分析原因，可能是由于復(fù)配菌劑各菌株之間的拮抗作用引起的。有研究報道木霉對其他真菌具有多種拮抗作用，諸如產(chǎn)生抗生物質(zhì)、營養(yǎng)爭奪及產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶等[22]。另一原因，也可能是由于BFA02、BFA03、季也蒙酵母及長枝木霉4種菌株各按2.5%的接種量接入，單菌起始菌量較低，延滯期長，最終導(dǎo)致黃腐酸產(chǎn)量較低。

圖7 復(fù)合菌劑和單菌發(fā)酵的黃腐酸產(chǎn)量Fig.7 Fulvic acid production of the mixed cultures and single strain

圖8 復(fù)合菌劑和單菌發(fā)酵的木質(zhì)纖維素降解率Fig.8 Degradation rates of cellulose,hemi-cellulose and lignin by the mixed cultures and single strain

3 結(jié)論

從腐植酸樣品中經(jīng)分離篩選獲得2株具有較好木質(zhì)纖維素降解能力的黃腐酸生產(chǎn)菌株BFA02和BFA03，其中BFA02菌株是具有良好纖維素和木質(zhì)素降解能力，BFA03具有良好的半纖維素降解能力。經(jīng)16SrDNA分類鑒定，初步確認BFA02為解淀粉芽孢桿菌，BFA03為地衣芽孢桿菌。季也蒙酵母、長枝木霉分別與BFA02和BFA03復(fù)配后發(fā)酵，實驗結(jié)果表明，長枝木霉、BFA02和BFA03復(fù)配構(gòu)成的復(fù)合菌劑3具有較好的木質(zhì)纖維素降解能力，黃腐酸產(chǎn)量最高可達103.19 g/kg，較BFA02、BFA03單菌發(fā)酵分別提高了136%和74%。長枝木霉具有優(yōu)良的木質(zhì)纖維素降解能力，與BFA02和BFA03復(fù)配，可高效分解底物，提高黃腐酸產(chǎn)量。

因此，篩選優(yōu)良的復(fù)合菌劑對于提高黃腐酸產(chǎn)量意義重大。在我國每年都有數(shù)以億噸的果渣以及其他農(nóng)產(chǎn)品加工廢棄物，這些廢棄物量大而且相對集中，資源化利用固體廢棄物發(fā)酵制取黃腐酸，不僅可以解決環(huán)境污染問題，還可促進農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展，具有很高的經(jīng)濟效益和社會效益。