王曉寧,江成龍,刁紅錄,張昌軍

(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，湖北十堰 442000)

在體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET)技術(shù)中,經(jīng)陰道超聲引導(dǎo)下穿刺取卵術(shù)是IVF助孕的常規(guī)收集卵子的方法。穿刺取卵術(shù)的效果與手術(shù)者取卵術(shù)熟練程度、有效的負(fù)壓抽吸、穿刺取卵針直徑大小、卵泡的成熟度、注射HCG時(shí)卵泡徑線(xiàn)的大小都有關(guān)系，本中心自2014年使用經(jīng)典長(zhǎng)方案促排卵并在取卵術(shù)中使用單腔取卵針進(jìn)行取卵以來(lái),反復(fù)總結(jié)并積累經(jīng)驗(yàn),獲卵率及回收卵母細(xì)胞質(zhì)量得到較高保證。本研究對(duì)陰道超聲引導(dǎo)下穿刺取卵術(shù)與妊娠結(jié)局的關(guān)系進(jìn)行了回顧性比較，探討經(jīng)陰道穿刺取卵術(shù)中合適的取卵手術(shù)時(shí)間，減輕患者的痛苦，并獲取高質(zhì)量的卵母細(xì)胞，進(jìn)而得到高質(zhì)量的胚胎以提高臨床妊娠率。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象 回顧性分析2014年11月至2015年11月在本院生殖醫(yī)學(xué)中心因男方精子質(zhì)量較差單因素尋求輔助生殖治療的IVF-ET周期的資料共188例,納入標(biāo)準(zhǔn):女方年齡20～35歲;月經(jīng)規(guī)則;B超監(jiān)測(cè)有排卵;應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)長(zhǎng)方案超促排卵,并由同一醫(yī)生行取卵術(shù)。其按照平均每個(gè)卵子獲卵時(shí)間為1.2 min分為<1.2 min組和≥1.2 min組進(jìn)行比較。

1.2方法

1.2.1促排卵方法 采用標(biāo)準(zhǔn)長(zhǎng)方案促排卵,從上1個(gè)月經(jīng)周期的黃體中期(月經(jīng)第21天)開(kāi)始使用醋酸曲普瑞林(德國(guó)輝凌制藥有限公司)0.05 mg/d 長(zhǎng)方案行垂體降調(diào)節(jié),至月經(jīng)第3～5天垂體降調(diào)節(jié)達(dá)標(biāo)后,加用促性腺激素[Gn,重組人促卵泡刺激(r-hFSH),瑞士雪蘭諾制藥公司,75 IU/d]或(和)尿促性素(hMG,麗珠集團(tuán)麗寶生物化學(xué)制藥有限公司)行超促排卵,促排卵期間B 超監(jiān)測(cè)卵泡的發(fā)育情況,當(dāng)直徑達(dá)16～18 mm的卵泡大于2個(gè)時(shí),停用r-hFSH和hMG,注射重組人絨促性素(r-hCG,瑞士雪蘭諾制藥公司)250μg,36 h 后在B超引導(dǎo)下行穿刺取卵術(shù)。

1.2.2取卵 患者取膀胱截石位,手術(shù)在陰道超聲引導(dǎo)下進(jìn)行。陰道B 超(日本Aloka SSD-900型超聲診斷儀),陰道探頭頻率7 MHz； 常規(guī)消毒,鋪巾,局部麻醉鎮(zhèn)痛后放入陰道探頭及穿刺架,徹底掃描盆腔,了解子宮、卵巢的位置和可及度,并確定進(jìn)針位置。用單腔取卵針(美國(guó)COOK公司)，抽吸的卵泡液遞進(jìn)胚胎實(shí)驗(yàn)室由技術(shù)人員在體式顯微鏡下尋找卵冠丘復(fù)合體。記錄取卵時(shí)間,并對(duì)所回收卵母細(xì)胞質(zhì)量及胚胎質(zhì)量進(jìn)行評(píng)分。

1.2.3受精與胚胎培養(yǎng) 受精后16～18 h觀(guān)察原核情況，若出現(xiàn)兩原核判斷為正常受精。受精后胚胎在體外培養(yǎng)24～48 h，于取卵后的第3天根據(jù)文獻(xiàn)[1]對(duì)移植胚胎進(jìn)行胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)分，Ⅰ～Ⅱ?yàn)閮?yōu)質(zhì)胚胎，Ⅰ～Ⅲ級(jí)胚胎均為可用胚胎，Ⅲ以上進(jìn)行囊胚培養(yǎng)，移植D5囊胚，采用 B 超引導(dǎo)下的宮腔內(nèi)移植。妊娠的標(biāo)準(zhǔn)是胚胎移植后第14天血清人絨毛膜促性腺激素(hCG)陽(yáng)性為生化妊娠，臨床妊娠為第4周B超檢查有胎心搏動(dòng)。優(yōu)質(zhì)胚胎率=優(yōu)胚數(shù)/胚胎數(shù)×100%，可用胚胎率=可用胚胎數(shù)/胚胎數(shù)×100%，囊胚形成率=囊胚形成數(shù)/培養(yǎng)囊胚數(shù)×100%。

1.2.4激素檢測(cè) 內(nèi)分泌檢測(cè)：控制性超促排卵周期中hCG注射日早晨抽取靜脈血,應(yīng)用 DXI800全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析系統(tǒng)(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司) 進(jìn)行內(nèi)分泌(血清激素FSH、E2、P、LH)的測(cè)定。相應(yīng)試劑盒購(gòu)自武漢德高科技有限責(zé)任公司，操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行，控制試劑批內(nèi)及批間差異10%以?xún)?nèi)。

1.2.5相關(guān)參數(shù)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn) 可移植胚胎率=可移植胚胎數(shù)/卵裂正常受精卵數(shù)×100%。優(yōu)質(zhì)胚胎率=優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/卵裂正常受精卵數(shù)×100%。流產(chǎn)率=流產(chǎn)患者數(shù)/臨床妊娠患者數(shù)×100%。受精率=2原核或以上受精卵母細(xì)胞數(shù)/卵母細(xì)胞數(shù)×100%。卵裂率=卵裂正常(2原核)受精卵數(shù)/正常受精(2原核)卵母細(xì)胞數(shù)×100%。獲卵率=卵母細(xì)胞數(shù)/穿刺卵泡數(shù)×100%。成熟卵率=成熟卵母細(xì)胞數(shù)/卵母細(xì)胞數(shù)×100%。

2 結(jié) 果

2.1一般情況比較 兩組患者的平均年齡、不孕年限、BMI、Gn用量、Gn用藥時(shí)間、移植胚胎數(shù)目差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 患者一般情況比較

2.2取卵手術(shù)時(shí)間與相關(guān)參數(shù)相關(guān)性分析 取卵手術(shù)時(shí)間與年齡、既往腹部手術(shù)史、Gn用量正相關(guān)(P<0.05)，與優(yōu)胚數(shù)、取卵后孕激素水平、活產(chǎn)率呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與BMI、Gn時(shí)間、夜針日LH、夜針日雌激素、夜針日P、取卵后LH、取卵后雌激素、臨床妊娠無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)，見(jiàn)表2、3。

2.3不同妊娠結(jié)局的取卵手術(shù)時(shí)間分析 活產(chǎn)組每組[102例，(1.23±0.71)min]與流產(chǎn)組[13例，(1.49±0.61)min]相比，妊娠組[116例，(1.27±0.71)min]與非妊娠組[72例，(1.32±0.93)min]相比，取卵手術(shù)時(shí)間無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)。

表2 取卵手術(shù)時(shí)間與相關(guān)參數(shù)的Person相關(guān)分析

表3 取卵時(shí)間與相關(guān)參數(shù)的Spearman相關(guān)分析

2.4取卵手術(shù)時(shí)間對(duì)妊娠結(jié)局的影響 不同取卵手術(shù)時(shí)間hCG日平均FSH、E2、LH水平均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0．05)。<1.2 min組hCG日P水平、獲卵數(shù)、獲卵率、優(yōu)質(zhì)胚胎率顯著高于≥1.2 min組，流產(chǎn)率顯著低于≥1.2 min組(P<0．05)，見(jiàn)表4。

表4 不同取卵手術(shù)時(shí)間與妊娠結(jié)局比較

續(xù)表4 不同取卵手術(shù)時(shí)間與妊娠結(jié)局比較

3 討 論

超聲引導(dǎo)下經(jīng)陰道穿刺抽吸取卵已經(jīng)成為輔助生殖中獲得卵子的最佳途徑。但是在實(shí)際臨床工作中，常常存在部分患者獲卵時(shí)間長(zhǎng)的現(xiàn)象，獲卵時(shí)間的長(zhǎng)短與患者自身病史、卵子成熟度、HCG作用時(shí)間、卵泡沖洗次數(shù)及操作者的熟練程度可能都有關(guān)系。

目前取卵手術(shù)使用的穿刺針?lè)謫吻缓碗p腔兩種，雙腔穿刺針在使用過(guò)程中可以有一個(gè)腔抽吸卵泡液，另外一個(gè)腔抽吸卵子，但是這樣可能增加卵子暴露時(shí)間，且沖洗次數(shù)不一樣可能增加干擾因素[2-3]。此外，有研究表示，卵泡沖洗并不能提高有效卵子數(shù)以及有效胚胎數(shù)[4-5]。本研究選取同一方案的患者，且操作者為同一人，都是使用單腔取卵針，避免了由于客觀(guān)因素引起的干擾。

已有文獻(xiàn)證實(shí)，卵子對(duì)溫度、pH 及滲透壓等外界環(huán)境非常敏感,輕微的變化即可引起不可逆改變[6-8]。增加取卵手術(shù)時(shí)間，可能延長(zhǎng)卵母細(xì)胞卵泡暴露時(shí)間,從而導(dǎo)致卵母細(xì)胞形態(tài)異常率增高。本研究按照納入人群平均獲取單個(gè)卵泡所需時(shí)間的平均值將其分為兩組，從研究中可以發(fā)現(xiàn)，分組后兩組的一般情況并沒(méi)有明顯差異。

目前國(guó)內(nèi)外的研究中對(duì)于取卵手術(shù)時(shí)間與妊娠結(jié)局的影響尚少有報(bào)道，本研究中通過(guò)探討平均每個(gè)卵子手術(shù)時(shí)間與妊娠結(jié)局的關(guān)系為臨床操作提供參考，為如何提高獲卵效率，改善妊娠結(jié)局奠定基礎(chǔ)。

在本研究中發(fā)現(xiàn)，平均每個(gè)卵子獲卵時(shí)間<1.2 min組平均獲卵數(shù)、獲卵率、優(yōu)質(zhì)胚胎率均高于≥1.2 min組，兩組之間妊娠率、活產(chǎn)率無(wú)明顯差異，分析原因可能由于這些卵子成熟度好，卵丘與卵泡壁連接疏松，容易從卵泡壁剝離下來(lái)，導(dǎo)致取卵容易，獲卵時(shí)間短，從受精后結(jié)局來(lái)看，增加單個(gè)卵泡手術(shù)時(shí)間并不能增加獲卵率、優(yōu)胚率，臨床妊娠率也沒(méi)有明顯改善，提示提高手術(shù)的熟練程度以及實(shí)驗(yàn)室人員的配合能力，盡量縮短手術(shù)時(shí)間可能更有利于改善助孕結(jié)局。此外，平均每個(gè)卵子獲卵時(shí)間≥1.2 min組hCG日P水平增加，分析原因可能與該組患者卵泡過(guò)早黃素化有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)早黃素化可能損害卵子、胚胎質(zhì)量，誘導(dǎo)卵母細(xì)胞過(guò)早恢復(fù)減數(shù)分裂，使子宮內(nèi)膜過(guò)早向分泌期轉(zhuǎn)化，影響子宮內(nèi)膜容受性，從而降低臨床妊娠率[9-10]。本研究中并未發(fā)現(xiàn)臨床妊娠率受到影響，但是子宮內(nèi)膜容受性降低可能導(dǎo)致流產(chǎn)率增加，與文獻(xiàn)[11]報(bào)道一致。此外，≥1.2 min組流產(chǎn)率增加可能與取卵手術(shù)過(guò)程中對(duì)于顆粒細(xì)胞的損傷大，取卵術(shù)后患者黃體功能相對(duì)差有關(guān)。故本研究認(rèn)為，延長(zhǎng)取卵手術(shù)時(shí)間不影響胚胎質(zhì)量和妊娠結(jié)局，但當(dāng)單個(gè)卵泡手術(shù)時(shí)間小于1.2 min可能提高者的胚胎質(zhì)量，降低流產(chǎn)率。

另外需要排除不均一性的因素，如：患者卵巢功能、培養(yǎng)基量不同等。因此在取卵操作過(guò)程中把握每一個(gè)環(huán)節(jié)，控制在最短的時(shí)間內(nèi)獲得卵子，一方面需要提高取卵手術(shù)者的技能水平，另一方面促排方案的合理應(yīng)用，使顆粒細(xì)胞疏松化，卵子成熟度達(dá)到同步化，才能提高取卵效率，獲得理想的結(jié)局。