酸性氧化鋁前處理甜葉菊葉片甜菊糖苷分析樣品的質(zhì)譜驗(yàn)證

羅慶云，印敏，陳玉江，繆慧敏，陳婉婷，譚曦曦

（1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，南京210095；2.江蘇省中國科學(xué)院植物研究所/南京中山植物園/江蘇省藥用植物研究開發(fā)中心，南京2100141；3.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，南京210095）

0 引言

甜菊糖苷是甜葉菊(Stevia rebaudiana Bertoni)、甜茶（Rubus suavissimus S.Lee）等植物葉片中以四環(huán)二萜為母核合成的一類糖苷類化合物，因其口味接近蔗糖，作為綠色低熱量高倍甜味劑，已廣泛應(yīng)用于食品及醫(yī)藥業(yè)[1]。

作為甜菊糖苷類化合物的主要提取原料，甜葉菊葉片所含化學(xué)組分復(fù)雜，在甜葉菊葉片品質(zhì)評估及甜菊糖提取工藝控制中，由于樣品多、檢測任務(wù)重，為有效替代人為及系統(tǒng)誤差大、處理效率低、操作繁瑣的液液萃取、固相萃取(SPE)等現(xiàn)有前處理方法，迫切需要建立一種簡便快捷、易與現(xiàn)有檢測體系相結(jié)合且不影響色譜柱耐用性和樣品穩(wěn)定性的前處理方法。在前期研究中，本實(shí)驗(yàn)室建立了一種利用酸性氧化鋁“同步吸附”處理甜葉菊葉片提取液樣品前處理方法，HPLC-UV檢測結(jié)果表明，在甜菊糖苷類化合物檢測所使用的210 nm處，該方法可使樣品中保留時(shí)間小于RA者（在前述研究中將此部分統(tǒng)稱為“非糖苷類雜質(zhì)”，但含有RD、RM等在前述研究材料中含量甚微的甜菊糖苷）總檢出峰面積減少65.0%以上，而對RA和STV為代表的甜菊糖苷檢出量影響小于3.0%。前期分析結(jié)果表明，該方法有助于便捷地開展甜葉菊種質(zhì)甜菊糖苷特性評估及甜菊糖苷提取加工工藝控制的在線檢測[2]。

由于甜葉菊葉片中甜菊糖苷種類繁多，受研究材料限制，前期只對RA和STV兩種甜菊糖苷組分進(jìn)行了分析，未對當(dāng)前應(yīng)用中較為關(guān)注的RD、RM等化合物進(jìn)行檢測；同時(shí)，前期所依托的HPLC-UV檢測系統(tǒng)只對210 nm處有吸收的化合物進(jìn)行了檢測。質(zhì)譜分析法對化合物的檢測具有不依賴波譜吸收特性，檢測靈敏度高、定性和定量分析結(jié)果準(zhǔn)確等特性，隨著甜葉菊甜菊糖苷類化合物的應(yīng)用開展，應(yīng)用領(lǐng)域?qū)μ鹑~菊葉片中甜菊糖苷的種類及其含量特性提出了更高要求，甜葉菊育種及甜菊糖苷提取加工都迫切需要借助UPLC的線速度、流速等優(yōu)勢來提高檢測效率、強(qiáng)化提取工藝監(jiān)控、加快育種進(jìn)程。為此，本研究以RE、RD和RM相對含量較高的甜葉菊新品系為材料，在建立甜葉菊葉片樣品各甜菊糖苷組分的UPLC分離體系基礎(chǔ)上，利用UPLC-MS就酸性氧化鋁處理對甜葉菊葉片浸提液樣品中甜菊糖苷和非甜菊糖苷類化合物檢出情況進(jìn)行分析，促進(jìn)酸性氧化鋁前處理和UPLC-MS檢測體系在甜菊糖苷提取用甜葉菊種質(zhì)評估及甜菊糖苷提取加工工藝控制中的應(yīng)用。

1 儀器、材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

為探討酸性氧化鋁前處理對甜葉菊葉片浸提液樣品中各甜菊糖苷，特別是RE、RD和RM等目前生產(chǎn)上較為關(guān)注的甜菊糖苷的影響，以本實(shí)驗(yàn)室2016年選育成功的RE、RD和RM相對含量較高的甜葉菊（S.rebaudiana）新品系‘1066’為材料，材料種植于江蘇省南京市江浦縣的南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝試驗(yàn)站內(nèi)。

1.2 材料的處理

于現(xiàn)蕾期取葉片，直接于80℃烘干（樣品組1）或經(jīng)青貯處理[3]后80℃烘干（樣品組2～4），并參照羅慶云[4]等方法準(zhǔn)備樣品備用。

1.3 酸性Al2O3的制備及提取液的前處理

參照羅慶云等[2]方法進(jìn)行酸性Al2O3的制備，并采用“同步吸附法”制備提取液樣品。同時(shí)設(shè)未添加酸性Al2O3吸附的提取液對照樣品。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)品

甜菊糖苷標(biāo)準(zhǔn)品萊鮑迪苷D（Rebaudioside D,RD）、萊鮑迪苷M（Rebaudioside M,RM）、萊鮑迪苷A（Rebaudioside A,RA）、甜菊苷（Stevioside,STV）、萊鮑迪苷F（Rebaudioside F,RF）、萊鮑迪苷C（Rebaudioside C,RC）、杜克苷A（Dulcoside A,DA）、甜茶苷（Rubusoside,Rub）、萊鮑迪苷B（Rebaudioside B,RB）和雙糖苷（Steviolbioside,SB）等標(biāo)準(zhǔn)品購于ChromaDex，用含30%（v/v）乙腈的水溶液溶解，由諸城浩天藥業(yè)有限公司饋贈(zèng)。

1.5 甜菊糖苷的液質(zhì)聯(lián)用分析器材及方法

分析用耗材：色譜柱ACE Ultracore 2.5 Super C18柱（150 mm×4.6 mm,粒徑2.5μm）(廣州菲羅門科學(xué)儀器有限公司)；甲酸（ROE,LCMS級(jí)）；乙腈（Tedia company Inc,absolv）；去離子純化水。

分析用儀器：液質(zhì)聯(lián)用儀Agilent 1260 UPLC-DAD-6530 ESI-QTOF MS，質(zhì)譜檢測器ESI離子源負(fù)離子模式；毛細(xì)管電壓3500 V；干燥器溫度350℃、流速10 mL/min；霧化器壓力50 psi；Mass range 100～2000 m/z；Fragment voltage 195 V；為配合質(zhì)譜分析，用分流器將實(shí)際進(jìn)入檢測系統(tǒng)的流速調(diào)整為0.6 mL/min。

2 結(jié)果與分析

2.1 液質(zhì)聯(lián)用建立適宜甜菊糖苷各組分分析的UPLC分離體系

在質(zhì)譜儀支持下，可快速定位與各標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)的甜菊糖苷組分的保留時(shí)間。但是，由于已有的檢測體系是以磷酸鹽緩沖液為pH調(diào)節(jié)劑的，不適用于質(zhì)譜檢測儀，本研究以乙酸為pH調(diào)節(jié)劑，建立了適宜于質(zhì)譜儀的甜葉菊葉片甜菊糖苷組分分析的UPLC分離體系。

研究結(jié)果表明，在以ACE Ultracore 2.5 Super C18柱（150 mm×4.6 mm,粒徑2.5μm）為固定相、乙腈(B)和含0.1%（v/v）甲酸(A)的純凈水為流動(dòng)相條件下，實(shí)現(xiàn)甜葉菊葉片樣品甜菊糖苷各組分有效分離的洗脫梯度條件為：0 min 27%B；3.5 min 38%B；4.2 min 38%B；4.21 min 100%B；8 min 100%B；8.01 min 27%B。其他相關(guān)條件為：進(jìn)樣量5μL、柱溫50℃、流動(dòng)相總流速1.5 mL/min、二極管陣列檢測器（DAD）檢測波長210 nm。

在本研究條件下，在可通過標(biāo)準(zhǔn)品明確的10種甜菊糖苷中，除RA和STV未能實(shí)現(xiàn)基線分離外，各已知及無標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)而未明確甜菊糖苷組分間分離較好，都實(shí)現(xiàn)了基線分離，各甜菊糖苷組分保留時(shí)間先后順序與基于C18柱的JECFA一致，順序?yàn)镽D、RM、RA、STV、RF、RC、DA、Rub、RB和SB，相應(yīng)保留時(shí)間分別為1.847、2.113、3.373、3.460、3.773、3.953、4.093、4.553、4.987和5.153 min（圖1）。在此條件下，包含樣品間柱子清洗、再平衡等操作在內(nèi)，可實(shí)現(xiàn)每10 min檢測一個(gè)樣品，與在HLPC上梯度洗脫檢測一個(gè)樣品需要近60 min相比，檢測效率明顯提高。

圖1甜葉菊葉片10種常見甜菊糖苷組分的UPLC分離Fig.1 UPLC separation of ten common steviol glycosides from leaves of stevia

2.2 酸性氧化鋁處理對非甜菊糖苷類化合物檢出的影響

酸性氧化鋁處理明顯提高了樣品的澄清度（圖2），在本研究所采用的超高壓高效液相分離條件下，非糖苷類極性雜質(zhì)的保留時(shí)間多小于1.7 min，非極性雜質(zhì)的保留時(shí)間多大于5.4 min。從圖3的離子流圖可以看出，與未處理者相比較，酸性氧化鋁處理后，保留時(shí)間小于1.7 min的化合物離子流明顯減少，對保留時(shí)間大于1.7 min者，除保留時(shí)間為3.708和3.850者離子流減少明顯外，對其他組分離子流影響不明顯。

圖2酸性氧化鋁處理對甜葉菊葉片提取物色澤及透明度的影響Fig.2 Effect of acid Al2O3treatment on color and transparency of extract of stevia leaf

圖3酸性氧化鋁處理對甜葉菊葉片提取物總離子流（TIC）的影響Fig.3 Effect of acid Al2O3treatment on total ion current(TIC)of extract of stevia leaf

酸性氧化鋁對黃酮、酚類及蒽醌等酸性化合物具有較強(qiáng)的親和性，這3類化合物分別在255 nm、274 nm和330 nm左右有特異性吸收。為初步確定甜葉菊葉片甜菊糖苷組分分析樣品經(jīng)酸性氧化鋁處理后所去除的化合物種類，分別在255±2 nm、274±2 nm和330±2 nm（圖4）處對酸性氧化鋁處理前后的樣品進(jìn)行了掃描分析。結(jié)果表明，經(jīng)酸性氧化鋁處理后，與未處理者相比，上述3個(gè)波段下所檢出化合物的量多下降至30%以下（表1）。

圖4酸性氧化鋁處理對甜葉菊葉片提取物在255、274、330 nm檢出物的影響Fig.4 Effect of acid Al2O3treatment on detectable compounds at 255,274 and 330 nm in extract of stevia leaves

表1 酸性氧化鋁處理對甜葉菊葉片提取液255nm、274nm和330nm下化合物相對檢出量（%）的影響*Table 1 Effect of acidic Al2O3treatment on relative detection(%)of detectable compoundsat 255,274 and 330 nmin stevia leaf extract

2.3 酸性氧化鋁處理對甜菊糖苷類化合物檢出的影響

與未處理者相比，酸性氧化鋁處理后，RE、RD、RM、RA、STV、RC和RB等甜菊糖苷組分ESI相對值都為100%左右，表明上述甜菊糖苷組分對酸性氧化鋁處理的穩(wěn)定性強(qiáng)。相對地，RF、Rub兩種甜菊糖苷的ESI相對值波動(dòng)較大，酸性氧化鋁處理后，ESI檢出值都出現(xiàn)了不同程度的上升，這可能是由于酸性氧化鋁處理時(shí)酸根離子的引入導(dǎo)致甜葉菊葉片提取液中某些本研究未檢測的甜菊糖苷類化合物的降解形成RF和Rub所致（表2）。

表2 酸性氧化鋁處理對甜葉菊葉片各甜菊糖苷組分的ESI相對值（ESI）、OD210nm相對值（OD210nm）及OD210nm值對ESI值相對代表率（OD210nm:ESI）的影響*Table 2 Effect of acidic Al2O3treatment on relative value of ESI(ESI),relative value of OD210nm(OD210nm)and relative representative rate of the value of OD210nmto the value of ESI(OD210nm:ESI)of 9 main steviol glycosides in extract of stevia leaves

此外，表2結(jié)果還顯示，與未處理者相比，酸性氧化鋁處理后，甜葉菊葉片提取液中RD、RM等8種主要甜菊糖苷組分的OD210nm值都表現(xiàn)為不同程度的降低，相對地，210 nm處單位吸收峰面積對ESI值的表征率得到了較為明顯的提高，RF、RC和Rub三種甜菊糖苷的OD210nm值對ESI值相對代表率為未處理者的1.6～2.1倍，表明酸性氧化鋁處理較為明顯地降低了整個(gè)分離體系中在210 nm處有吸收化合物的量，使各組分在其保留時(shí)間處流份的相對純度得以提升。

3 討論與結(jié)論

有效的樣品前處理包括：1）減少雜質(zhì)的引入，降低雜質(zhì)對檢測體系的影響，降低對分離體系的要求，提高檢測效率；2）減少對目標(biāo)檢測組分理化性質(zhì)的影響，提高目標(biāo)化合物的穩(wěn)定性，確保檢測結(jié)果的可靠性。

作為第三代糖源，甜葉菊葉片富含甜菊糖苷類天然低熱高倍甜味物質(zhì)。甜菊糖苷為其葉片形成和積累的以四環(huán)二萜類化合物——甜菊醇為母核的糖苷類化合物，該類化合物因連接在甜菊醇母核13位和19位羥基上糖的種類、連接方式及連接順序不一而導(dǎo)致其空間位阻不同，使其與口腔味蕾的結(jié)合及分離特性存在差異，表現(xiàn)為不同的口感[5-7]。到目前為止，人們已經(jīng)對甜葉菊葉片內(nèi)天然形成的50種以上甜菊糖苷進(jìn)行了分離、鑒定和口感評價(jià)。

育種改良甜葉菊葉片內(nèi)目標(biāo)甜菊糖苷形成能力；栽培管理實(shí)現(xiàn)甜葉菊葉片內(nèi)目標(biāo)甜菊糖苷的有效積累；提取加工實(shí)現(xiàn)甜葉菊葉片所含甜菊糖苷類化合物的分離；復(fù)配應(yīng)用實(shí)現(xiàn)甜菊糖苷優(yōu)良特性的有效應(yīng)用。在以甜菊糖苷為標(biāo)的物的甜葉菊產(chǎn)業(yè)活動(dòng)中，對包括甜葉菊葉片在內(nèi)的所有物料甜菊糖苷組分的全面評價(jià)和有效利用是產(chǎn)業(yè)得以良性發(fā)展的核心技術(shù)。

雖然甜葉菊葉片中甜菊糖苷的總量可達(dá)到葉片干重20%以上，但還存在以下問題：1）這是一個(gè)整體概念，這對以口感為核心的甜菊糖苷的應(yīng)用借鑒意義不大，關(guān)鍵的是需要明確RE、RD、RM等口感優(yōu)良的高品位甜菊糖苷及RC、RF、STV、Rub等口感較差的低品位甜菊糖苷在包括甜葉菊葉片在內(nèi)各物料中的絕對和相對含量，為育種、栽培、分離及應(yīng)用提供依據(jù)；2）甜葉菊葉片所含與目標(biāo)甜菊糖苷理化性質(zhì)相近的化合物種類繁多，干擾了產(chǎn)業(yè)人員對目標(biāo)甜菊糖苷的有效檢測，嚴(yán)重影響了甜葉菊育種、栽培、分離及復(fù)配理論及技術(shù)體系的建設(shè)和完善。此外，作為新型甜味劑，甜葉菊源甜菊糖苷在食品及醫(yī)藥業(yè)[8-9]的應(yīng)用范圍日益廣泛，這對育種、栽培、分離、應(yīng)用及市場監(jiān)管等環(huán)節(jié)提出了挑戰(zhàn)。

為有效應(yīng)對日益繁重的檢測任務(wù)，本實(shí)驗(yàn)室圍繞甜葉菊種質(zhì)評價(jià)及甜菊糖苷分子育種所需，長期致力于建設(shè)一種簡便快捷、易與現(xiàn)有檢測體系相結(jié)合且不影響樣品穩(wěn)定性和色譜柱耐用性的前處理方法。在前期研究中，本實(shí)驗(yàn)室基于HPLC-UV評估并建立了一種利用酸性氧化鋁“同步吸附”處理甜葉菊葉片提取液樣品前處理方法，該方法有助于便捷地開展甜葉菊種質(zhì)甜菊糖苷特性的評估及甜菊糖苷提取加工工藝控制的在線檢測。

隨著甜葉菊甜菊糖苷類化合物的應(yīng)用開展，應(yīng)用領(lǐng)域?qū)μ鹑~菊葉片中甜菊糖苷的種類及其含量特性提出了更高要求，甜葉菊的育種及甜菊糖苷的提取、復(fù)配和應(yīng)用都迫切需要借助UPLC的線速度、流速等優(yōu)勢來提高檢測效率、強(qiáng)化工藝監(jiān)控、加快育種進(jìn)程。質(zhì)譜分析法對化合物的檢測具有不依賴波譜吸收特性，檢測靈敏度高、定性和定量分析結(jié)果準(zhǔn)確等特性[10]，本研究以RE、RD和RM相對含量較高的甜葉菊新品系為材料，在甜葉菊葉片樣品各甜菊糖苷組分UPLC分離體系建立的基礎(chǔ)上，利用UPLC-MS進(jìn)一步就酸性氧化鋁處理對甜葉菊葉片浸提液樣品中甜菊糖苷和非甜菊糖苷類化合物檢出情況進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，甜菊糖苷組分對酸性氧化鋁處理的穩(wěn)定性強(qiáng)，檢測結(jié)果可靠性高；酸性氧化鋁對黃酮、酚類及蒽醌等化合物具有較強(qiáng)的親和性，甜葉菊葉片提取物經(jīng)酸性氧化鋁處理后，黃酮、酚類及蒽醌等檢出量多下降至30%以下，降低了整個(gè)分離體系中210 nm處有吸收化合物的量，使RE、RD、RM、RA、STV、RC、RF、Rub等各組分在其保留時(shí)間處流份中的相對純度得以提升，提高了甜菊糖苷檢測值的準(zhǔn)確度。這些結(jié)果是對前期研究的驗(yàn)證，揭示了甜葉菊葉片提取物經(jīng)酸性氧化鋁處理后可有效去除非甜菊糖苷雜質(zhì)，對甜菊糖苷檢測有利，對在甜葉菊種質(zhì)甜菊糖苷形成特性評估、甜菊糖苷分離提取工藝控制及甜菊糖苷的復(fù)配應(yīng)用等場景所需檢測樣品的前處理中的應(yīng)用將起到推動(dòng)作用。

致謝：印敏負(fù)責(zé)UPLC-MS相關(guān)實(shí)驗(yàn)方案設(shè)計(jì)、數(shù)據(jù)采集并對數(shù)據(jù)的分析提出參考意見；陳玉江、繆慧敏、陳婉婷和譚曦曦等參與實(shí)驗(yàn)材料繁育；陳愛彥和劉福鳳負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)材料田間管理。