馮蘇敏，賀添艷，李曉

（河南省誠(chéng)建檢驗(yàn)檢測(cè)技術(shù)股份有限公司，河南鄭州 450000）

0 引言

單核細(xì)胞增生李斯特氏菌（Listeria monocytogenes）簡(jiǎn)稱單增李斯特氏菌，廣泛存在于自然界中，該菌在4℃的環(huán)境中仍可生長(zhǎng)繁殖，是冷藏食品威脅人類健康的主要病原菌之一[1-5]。單增李斯特氏菌食物中毒是由該菌產(chǎn)生的溶血素溶劑引起，易感者常為新生兒、孕婦及40歲以上人群，臨床表現(xiàn)為呼吸急促、嘔吐、出血性皮疹、抽搐、發(fā)熱、昏迷、流產(chǎn)、敗血癥直至死亡[6-11]。2011年，美國(guó)由該菌造成16人死亡，是自1998年以來致死人數(shù)最多的一次食源性疾病疫情。因此，單增李斯特氏菌檢驗(yàn)是食品衛(wèi)生微生物檢驗(yàn)重點(diǎn)之一。

目前，能力驗(yàn)證已經(jīng)成為了各檢測(cè)機(jī)構(gòu)補(bǔ)充其內(nèi)部質(zhì)量控制技術(shù)，為自身的持續(xù)改進(jìn)和質(zhì)量管理提供信息的主要手段，并且近幾年政府部門、社會(huì)組織及其他方在選擇提供技術(shù)服務(wù)檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)時(shí)，將能力驗(yàn)證的結(jié)果作為重要依據(jù)。重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院以GB 4789.30—2010為檢驗(yàn)依據(jù)，對(duì)樣品編號(hào)TF0580094的3個(gè)樣品進(jìn)行單增李斯特氏菌定性檢測(cè)并取得滿意結(jié)果[12]。四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院依據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)》進(jìn)行檢測(cè)，利用BAX system Q7型全自動(dòng)病原微生物檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)能力驗(yàn)證中的3個(gè)樣品進(jìn)行快速篩查，取得滿意結(jié)果[13]。為提高實(shí)驗(yàn)室微生物檢測(cè)能力，實(shí)驗(yàn)室參加中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心組織的乳粉中單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的檢測(cè)能力驗(yàn)證計(jì)劃（ACAS-PT541(2018)），按照國(guó)標(biāo)方法及相關(guān)儀器對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，試驗(yàn)對(duì)此次能力驗(yàn)證過程及結(jié)果進(jìn)行分析，總結(jié)經(jīng)驗(yàn)教訓(xùn)為日常的檢驗(yàn)工作提供技術(shù)性支持。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

2瓶白色凍干塊狀的乳品樣品，于2～6℃下保存，中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心提供，代碼分別為18-Y493，18-X650。

含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆瓊脂（TSAYE）、李氏增菌肉湯LB（LB1，LB2）、PALCAM培養(yǎng)基、李斯特氏菌顯色平板、革蘭氏染色液試劑盒、單增李斯特氏菌生化鑒定套裝，均購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

BSC-1300IIA2型生物安全柜、SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)、BPX-272型電熱恒溫培養(yǎng)箱、BXM-75VE型立式壓力滅菌器，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司產(chǎn)品。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)菌株

（1） 陽(yáng)性對(duì)照菌株。單核細(xì)胞增生李斯特氏菌，菌株編號(hào)：BNCC314197（ATCC19115等效菌株），購(gòu)于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

（2）陰性對(duì)照菌株。英諾克李斯特氏菌，菌株編號(hào)：BNCC186087（ATCC33090等效菌株），購(gòu)于北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

以上菌株傳代次數(shù)均未超過5代。

1.3 試驗(yàn)方法[14-15]

1.3.1 樣品處理

樣品需要用40.0 mL無菌再水化。無菌開啟樣品后，立即加入4 mL無菌水進(jìn)行再水化，待溶解后，吸出放入無菌瓶中，再反復(fù)用余下的無菌水清洗西林瓶?jī)?nèi)壁，回收清洗液放入上述無菌瓶中，此溶液即為待測(cè)樣品原液。

1.3.2 增菌

以無菌操作吸取取25 mL樣品原液轉(zhuǎn)至含有225 mL LB1增菌液的均質(zhì)袋中，在拍擊式均質(zhì)器上連續(xù)均質(zhì)1～2 min，于30±1℃下培養(yǎng)24±2 h，移取0.1 mL，轉(zhuǎn)種于10 mL LB2增菌液內(nèi)，于30±1℃下培養(yǎng)24±2 h。

單增李斯特氏菌常見的增菌方法有LB二次增菌法，EB法、改良FDA法及Fraser肉湯增菌法，通過4種方法對(duì)同一樣品進(jìn)行增菌，采用PALCAM選擇性平板進(jìn)行分離，再進(jìn)行國(guó)標(biāo)生化鑒定，對(duì)比4種增菌方法對(duì)樣品的檢出率，LB二次增菌法是4種方法中檢出率較高且較為穩(wěn)定的增菌方法，因此選擇LB二次增菌法。

1.3.3 分離

取LB2增菌液一環(huán)劃線接種于李斯特氏菌顯色平板和PALCAM瓊脂平板，于36±1℃下培養(yǎng)24～48 h，觀察各個(gè)平板上菌落生長(zhǎng)情況。李斯特氏菌顯色平板中所含色素與單增李斯特氏菌具有的酶發(fā)生特異性反應(yīng)，水解底物，釋放出顯色基團(tuán)，在平板上，單增李斯特氏菌呈現(xiàn)藍(lán)綠色的光滑規(guī)則的小菌落，抑制劑和配套試劑可抑制雜菌的生長(zhǎng)。另外李斯特氏菌常見分離平板還有PALCAM，OXA，OXA和LPM，對(duì)4種選擇性分離培養(yǎng)基上目標(biāo)菌的生長(zhǎng)率和非目標(biāo)菌的抑制性進(jìn)行比較，結(jié)果顯示目標(biāo)菌在LMP上的生長(zhǎng)率最低，其余3種分離培養(yǎng)基的生長(zhǎng)率差異不大；綜合比較對(duì)非目標(biāo)菌的抑制性，PALCAM最佳；然而檢測(cè)雜菌較多的樣品時(shí)，PALCAM的選擇性靈敏度最高[16]。

1.3.4 初篩

自選擇性平板上分別挑取5個(gè)典型或可疑菌落，分別接種木糖、鼠李糖發(fā)酵管，于36±1℃下培養(yǎng)24±2 h，同時(shí)在TSA-YE平板上劃線，于36±1℃下培養(yǎng)18～24 h，選擇木糖陰性、鼠李糖陽(yáng)性的純培養(yǎng)物繼續(xù)進(jìn)行鑒定。

1.3.5 鑒定

根據(jù)初篩結(jié)果，對(duì)1.3.4的純培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢、動(dòng)力試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)過氧化氫酶試驗(yàn)及生化鑒定，生化鑒定按生化試劑盒操作說明進(jìn)行。

單增李斯特氏菌微量生化試驗(yàn)見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 初篩結(jié)果

樣品18-X650在PALCAM瓊脂平板為黃白色菌落，在李斯特氏顯色平板為黃白色菌落。樣品18-X650在PALCAM平板和李斯特氏顯色平板上均無典型或可疑菌落。樣品18-Y493在PALCAM瓊脂平板上為小的圓形灰綠色菌落，周圍有棕黑色水解圈；在李斯特氏顯色平板上為藍(lán)綠色菌落，周圍有不同透明暈圈。初步可判斷樣品18-X650為非單核細(xì)胞增生李斯特氏菌，樣品18-Y493為可疑單核細(xì)胞增生李斯特氏菌。

2.2 鑒定結(jié)果

對(duì)樣品18-Y493的純培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢、動(dòng)力試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)及生化鑒定。結(jié)果顯示，樣品18-Y493為革蘭氏陽(yáng)性短桿菌，在半固體上呈傘狀生長(zhǎng)，在血平板上為寬大、輪廓清晰、完全透明的溶血圈；陽(yáng)性菌株為革蘭氏陽(yáng)性短桿菌，在半固體上呈傘狀生長(zhǎng)，在血平板上為狹窄、清晰、明亮的溶血圈。

生化試驗(yàn)反應(yīng)結(jié)果見表2。

表2 生化試驗(yàn)反應(yīng)結(jié)果

通過與陽(yáng)性菌株的系列反應(yīng)結(jié)果相比較，可判斷樣品18-Y493為非單核細(xì)胞增生李斯特氏菌。

此次結(jié)果報(bào)告為樣品18-X650未檢出單核細(xì)胞增生李斯特氏菌25 mL，樣品18-Y493未檢出單核細(xì)胞增生李斯特氏菌25 mL。中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心判定實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果與指定值一致，結(jié)果評(píng)價(jià)為滿意。

3 結(jié)論

食品微生物檢測(cè)中，檢測(cè)雜菌較多的樣品時(shí)，常使用2種及2種以上分離平板對(duì)目標(biāo)菌進(jìn)行分離篩選，以防漏檢。國(guó)標(biāo)GB 4789.30—2016中單增李斯特氏菌選用李斯特氏菌顯色平板和PALCAM平板，李斯特氏顯色平板的選擇特異性較強(qiáng)，由于防止其對(duì)其他菌進(jìn)行抑制的同時(shí)干擾到目標(biāo)菌，使目標(biāo)菌生長(zhǎng)緩慢或抑制其生長(zhǎng)，而PALCAM平板可以擴(kuò)大目標(biāo)菌的檢測(cè)范圍，因此需要2種平板配合使用，提高目標(biāo)菌的檢出率。單增李氏特菌檢驗(yàn)中在TSA-YE平板上純化是必須的，因?yàn)樵赑ALCAM和李斯特氏菌顯色平板上分離菌落時(shí)可能黏有不可見的受抑微生物。挑取5個(gè)典型菌落的原因是1個(gè)樣品中可能分離到1種以上的李斯特氏菌。

此外，依據(jù)樣品18-Y493的生化鑒定反應(yīng)結(jié)果，可判斷樣品18-Y493為非單核細(xì)胞增生李斯特氏菌，疑似斯氏李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌，由于實(shí)驗(yàn)室條件限制，未能判定其菌株類型。此次實(shí)驗(yàn)室按照CNAS RL02：2011《能力驗(yàn)證規(guī)則》等CNAS政策要求參加微生物項(xiàng)能力驗(yàn)證，并取得滿意結(jié)果。此次結(jié)果可作為證明實(shí)驗(yàn)室技術(shù)能力的有效證明，為監(jiān)管部門、客戶和其他利益相關(guān)方選擇、評(píng)價(jià)、認(rèn)可實(shí)驗(yàn)室提供參考依據(jù)。參加能力驗(yàn)證是實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制的重要手段，為不斷提升自身檢驗(yàn)檢測(cè)能力，發(fā)現(xiàn)和解決檢測(cè)過程中所遇到的問題，實(shí)驗(yàn)室將持續(xù)性參加能力驗(yàn)證項(xiàng)目。