郁斯貽

【摘 要】環(huán)境DNA（eDNA）技術(shù)是一種運用分子生物學的方法，通過從環(huán)境樣品中提取DNA并進行測序和分析來反映物種信息的技術(shù)。eDNA技術(shù)具有靈敏度高、操作簡便、對水生態(tài)系統(tǒng)干擾小等優(yōu)點，因而被越來越多地運用到了水生生物監(jiān)測和評價中。本文從eDNA技術(shù)的發(fā)展歷程、研究方法和應(yīng)用領(lǐng)域這三個方面對eDNA技術(shù)進行了綜述，總結(jié)了eDNA技術(shù)的優(yōu)缺點，并對其未來的發(fā)展前景進行了展望。

【關(guān)鍵詞】環(huán)境DNA;分子生物學;水生生物監(jiān)測

中圖分類號： S932.4 文獻標識碼： A文章編號： 2095-2457（2019）22-0078-002

DOI：10.19694/j.cnki.issn2095-2457.2019.22.034

0 引言

水生態(tài)系統(tǒng)是人類生存重要的自然資源之一。隨著人類社會經(jīng)濟和工業(yè)化的發(fā)展，水生態(tài)系統(tǒng)遭到了越來越嚴重破壞。因而對水生態(tài)系統(tǒng)進行監(jiān)測是非常重要的。水生生物是水生態(tài)系統(tǒng)中重要的組成部分。當污染物進入水體后，會產(chǎn)生一定的生態(tài)效應(yīng)，對水生態(tài)環(huán)境造成破壞，影響水體中動植物的生長發(fā)育，進而對水生生物造成危害[1]。因此對水生生物開展監(jiān)測能直觀地反映水生態(tài)系統(tǒng)受污染的程度。

傳統(tǒng)的水生生物監(jiān)測方法是對浮游生物、底棲生物、魚類等生物開展現(xiàn)場調(diào)查及采樣，采用形態(tài)學方法對所采集到的物種進行定性和定量分析。傳統(tǒng)水生生物監(jiān)測方法具有一定的局限性，一些密度比較低的生物群體在現(xiàn)場采樣時比較難以獲得，分析結(jié)果也會因此而受到影響。且傳統(tǒng)水生生物監(jiān)測中的形態(tài)學鑒定方法對從事物種鑒定的人員技術(shù)要求較高，有時對于樣本的完整性程度要求也比較高。因此，有必要尋找一種更為高效便捷的方法對水生生物物種進行鑒定和分析。

隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展，分子生物學技術(shù)逐漸被應(yīng)用到物種鑒定中。近些年在水生態(tài)環(huán)境監(jiān)測領(lǐng)域里，環(huán)境DNA（environmental DNA， eDNA）分子技術(shù)正被越來越多的研究者們所應(yīng)用。eDNA是指從環(huán)境中（如土壤、水、空氣等）提取的所有DNA集合，包括環(huán)境微生物以及從生物體上脫落下來的活細胞DNA和因生物死亡后細胞破碎而游離出的胞外DNA[2-3]。以下從eDNA的發(fā)展歷程、eDNA的技術(shù)方法、eDNA檢測技術(shù)在水生生物監(jiān)測中的應(yīng)用、總結(jié)與展望這幾個方面進行綜述，為水生生物監(jiān)測提供參考。

1 eDNA技術(shù)的發(fā)展歷程

eDNA技術(shù)最早出現(xiàn)于環(huán)境微生物學領(lǐng)域，并在2000年之后逐漸得到認可和應(yīng)用。Willerslev[4]等利用eDNA技術(shù)提取了不同國家和地區(qū)古老沉積物中的DNA，對生物多樣性、動植物的組成及變化等進行了研究。Ficetola[5]等于2008年報導了利用eDNA技術(shù)檢測淡水中一種蛙（Rana catesbeiana）的存在，這也是首次利用該技術(shù)對水生生物進行監(jiān)測。隨著eDNA技術(shù)的發(fā)展，其研究范圍也逐漸擴大，從最初對于某一種生物的定性研究發(fā)展到定量研究，研究對象也從單一物種逐漸擴大到了兩棲類、魚類、哺乳類、爬行類等各類物種。eDNA技術(shù)的發(fā)展為水生生物的監(jiān)測提供了新的方法。

2 eDNA研究方法

目前eDNA的主要研究方法有三種：PCR、熒光定量PCR和高通量測序。與傳統(tǒng)的人工形態(tài)學方法相比，這三種方法具有省時省力的優(yōu)勢。PCR方法主要用于物種的定性檢測，可檢測水體中是否存在某一特定的物種。Goldberg等[6]使用PCR技術(shù)檢測溪流中的洛基山尾蛙（Ascaphus montanus）和愛達荷州巨型火蜥蜴（Dicamptodon aterrimus）。熒光定量PCR法可以在定性檢測物種是否存在的基礎(chǔ)上，對物種的生物量進行預(yù)測。

高通量測序技術(shù)（High-throughput sequencing）又稱二代測序技術(shù)（next-generation sequencing， NGS），能夠一次對幾十萬至幾百萬條DNA分子進行序列測定。NGS技術(shù)與eDNA技術(shù)相結(jié)合產(chǎn)生eDNA宏條形碼（eDNA metabarcoding）技術(shù)。eDNA宏條形碼技術(shù)通過從環(huán)境樣品中提取DNA，借助第二代高通量測序獲取其物種組成，進而探究群落水平上的生物多樣性。孫晶瑩等[7]以太湖流域常見的5種枝角類浮游動物為研究對象，建立了一種基于eDNA宏條形碼技術(shù)的物種定量方法。趙夢迪[8]利用高通量測序技術(shù)檢測了黃海南部和東海北部10個點位的魚類多樣性和豐度，發(fā)現(xiàn)所鑒定到的魚類種類多為東黃海的常見品種，部分魚類雖不是常見品種，但曾出現(xiàn)在東黃海的記錄中，與此同時，通過該技術(shù)獲得的各點位優(yōu)勢種與當次捕撈的優(yōu)勢種基本相同，證明eDNA技術(shù)與傳統(tǒng)形態(tài)學分析法具有較好的一致性。

3 eDNA在水生生物監(jiān)測中的應(yīng)用

目標物種的檢測物種入侵、瀕危物種和稀有物種的保護是重要且亟待解決的生態(tài)問題之一。eDNA技術(shù)可通過檢測水樣中是否含有特定的DNA序列來判斷某一物種是否存在。這使得原本復雜且耗時的工作變得高效省力。

3.1 對外來物種進行監(jiān)測

外來物種入侵是21世紀5大全球性環(huán)境變化問題之一，也是全世界最為關(guān)注的焦點問題之一。外來物種一旦入侵成功，可能會與本土的物種形成競爭關(guān)系并成為優(yōu)勢種，對全球生物多樣性帶來影響。入侵成功的外來物種根除可能性很小且控制成本高，如果能對入侵物種提前進行監(jiān)測，在早期就采取措施，那么就有可能提升根除成功率并降低控制成本。近些年來，eDNA技術(shù)已被逐漸用于外來物種的監(jiān)測中，目前在全球范圍內(nèi)利用eDNA監(jiān)測過的外來物種包括：美國牛蛙、大西洋鮭、亞洲鯉魚、克氏螯蝦、小龍蝦、莫比魚等物種。

3.2 對瀕危和稀有物種進行監(jiān)測

由于瀕危物種或稀有物種密度低，所以傳統(tǒng)的形態(tài)學鑒定方法很難對這些物種進行監(jiān)測。且采用傳統(tǒng)形態(tài)學方法時需要使用拖網(wǎng)、電捕魚等采樣工具，易對生態(tài)系統(tǒng)造成影響。eDNA技術(shù)與傳統(tǒng)方法相比具有更好的靈敏度，且在實際操作時直接采集水樣即可，因而能很好地避免這些問題，該技術(shù)特別適用于瀕危物種和稀有物種的監(jiān)測。目前eDNA技術(shù)已經(jīng)實現(xiàn)了對歐白鮭、美國隱鰓鯢、王鮭、澳洲麥氏鱸等物種的監(jiān)測。

生物多樣性監(jiān)測 生物多樣性是衡量某一地區(qū)生物資源豐富程度的客觀指標，對人類社會的生存和發(fā)展具有非常重要的意義。生物多樣性不僅在保持土壤肥力、保證水質(zhì)、調(diào)節(jié)氣候、調(diào)控大氣層成分地標溫度等方面發(fā)揮了重要作用，而且生物多樣性的維持有助于珍稀物種和瀕危物種的保存。因此，許多國家和地區(qū)都開展了對生物多樣性的監(jiān)測和保護。傳統(tǒng)的監(jiān)測技術(shù)存在難以正確識別一些隱秘物種或幼年生命階段物種的問題，因而需要尋找一種能夠快速準確地進行生物多樣性監(jiān)測的技術(shù)。近年來，eDNA宏條形碼技術(shù)被越來越廣泛地應(yīng)用到了生物多樣性研究中。eDNA宏條形碼技術(shù)是通過提取環(huán)境樣品中的DNA，使用特異性引物進行PCR擴增，再對擴增產(chǎn)物進行測序后得到的可操縱分類單元（operational taxonomic units， OTUs）進行物種鑒定來獲知物種組成的[9]，從而可探究群落水平上的生物多樣性。eDNA宏條形碼技術(shù)很好地避開了傳統(tǒng)生物多樣性監(jiān)測技術(shù)中的問題，快速、高效的特點使其成為了生物多樣性監(jiān)測較為理想的技術(shù)手段。Thomsen等[10]從丹麥的海洋生態(tài)系統(tǒng)中采集海水，利用eDNA宏條形碼技術(shù)對海洋中魚類的生物多樣性開展了研究。研究共發(fā)現(xiàn)了15種魚類，其中包括了用傳統(tǒng)方法難以監(jiān)測到的稀有物種。與9種用傳統(tǒng)方法監(jiān)測到的海洋魚類進行比較，發(fā)現(xiàn)eDNA檢測到的魚類多樣性與傳統(tǒng)方法相當，這表明eDNA宏條形碼技術(shù)具有水生生物多樣性評價的潛力。

生物量的估算 生物量是重要的生物學參數(shù)之一，但要對其進行精確的估算通常比較困難。采用傳統(tǒng)方法進行生物量估算時會對生態(tài)系統(tǒng)造成較大的損害。孫晶瑩等[7]利用eDNA宏條形碼技術(shù)對枝角類浮游動物開展了生物量的監(jiān)測研究，建立了一種基于eDNA宏條形碼技術(shù)的物種定量測定方法。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，eDNA宏條形碼技術(shù)可對浮游動物實現(xiàn)半定量監(jiān)測，且eDNA宏條形碼技術(shù)與qPCR結(jié)果具有較強的一致性，能較好地反映物種的豐度變化。一些學者運用eDNA技術(shù)對水生態(tài)系統(tǒng)中的兩棲動物、魚類等物種進行生物量估算，發(fā)現(xiàn)水溫、pH、光照等因素會對eDNA的釋放產(chǎn)生一定的影響，間接地影響了生物量的估算。因此，eDNA技術(shù)在生物量估算方面還需要更為深入的研究。

4 總結(jié)與展望

作為一種新型的水生生物監(jiān)測技術(shù)，eDNA技術(shù)目前已在目標種的監(jiān)測、生物多樣性調(diào)查、生物量估算等方面得到了較為廣泛的應(yīng)用。與傳統(tǒng)的生物監(jiān)測技術(shù)相比，eDNA技術(shù)具有如下的優(yōu)勢：（1）靈敏度高：eDNA技術(shù)可用于密度很低的珍稀物種和瀕危物種的定性監(jiān)測，而傳統(tǒng)方法很難準確地對低密度種群進行監(jiān)測;（2）高效省時：與傳統(tǒng)監(jiān)測方法相比，eDNA技術(shù)通常所需的人力、物力和時間更少;（3）降低了對人員的要求：傳統(tǒng)監(jiān)測技術(shù)需要依靠形態(tài)學對物種進行定性、定量分析，這就要求研究人員具有很高的分類鑒定能力，而eDNA技術(shù)是只需使用分子生物學方法就可以進行物種鑒定，操作更為便捷;（4）采樣受限?。簜鹘y(tǒng)的生物采樣方法受天氣、環(huán)境的影響較大，而使用eDNA技術(shù)時只需采集一定量的水樣，受外界影響較小;（5）對水生生態(tài)系統(tǒng)干擾小：傳統(tǒng)的生物采樣方法需要使用捕撈工具，在捕撈生物時易對生態(tài)系統(tǒng)造成損害，而eDNA技術(shù)只采集水樣，因而對生態(tài)系統(tǒng)干擾較小。

雖然eDNA技術(shù)在許多方面相比傳統(tǒng)監(jiān)測方法具有明顯的優(yōu)勢，但依然在某些方面存在一定的問題與不足：（1）eDNA技術(shù)的結(jié)果判別需要依靠數(shù)據(jù)庫，如果數(shù)據(jù)庫中的生物信息不完備，那么最終檢測結(jié)果將受到影響;（2）當樣品在采集或運輸過程中發(fā)生交叉污染，或是實驗室分析過程中出現(xiàn)試劑污染問題時，eDNA的分析過程往往會受到影響，其分析結(jié)果也會有所偏差，因而在操作時所使用的工具、材料、設(shè)備等須提前進行滅菌處理，并在PCR擴增過程中添加去抑制劑;（3）某些環(huán)境因子可能會對eDNA的產(chǎn)生速率或降解速率造成影響，這將直接影響到最終的DNA量和定量研究的準確性，而目前仍無法完全確定哪些環(huán)境因子會影響eDNA的產(chǎn)生或降解速率，有待進一步的研究和考證;（4）eDNA技術(shù)的檢測結(jié)果在時間和空間尺度上的精度較低，其檢測精度還有待提升。

eDNA技術(shù)是以分子生物學為基礎(chǔ)的一種簡單高效的物種監(jiān)測方法，與二代測序技術(shù)相結(jié)合后可展現(xiàn)出巨大的潛能。未來關(guān)于eDNA技術(shù)的研究應(yīng)涉及以下幾個方面：（1）明確影響eDNA產(chǎn)生和降解的環(huán)境因子和相應(yīng)的機理;（2）建立eDNA與生物量之間的關(guān)系模型，實現(xiàn)利用eDNA技術(shù)對物種進行定量評估;（3）對生物多樣性熱點地區(qū)的eDNA進行分析，發(fā)揮并提升eDNA技術(shù)在生物多樣性保護中的作用;（4）將eDNA技術(shù)應(yīng)用到食物網(wǎng)、能量流動等研究中，進一步拓展其應(yīng)用的領(lǐng)域。

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[7]孫晶瑩，楊江華，張效偉.環(huán)境DNA（eDNA）宏條形碼技術(shù)對枝角類浮游動物物種鑒定及其生物量監(jiān)測研究[J].生態(tài)毒理學報，2018，13（05）：76-86.

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