冷鏈與斷鏈流通對(duì)冰藏大黃魚(yú)品質(zhì)與微生物多樣性的影響

王 倩 藍(lán)蔚青 ，2* 張墨言 孫曉紅 ，2 楊曉慧 謝 晶 ，2

（1上海海洋大學(xué)食品學(xué)院 上海 201306

2上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心 上海冷鏈裝備性能與節(jié)能評(píng)價(jià)專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺(tái)食品科學(xué)與工程國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心（上海海洋大學(xué)）上海 201306）

大黃魚(yú)（Pseudosciaena crocea）又名石首魚(yú)、黃瓜魚(yú)、大鮮，為石首魚(yú)科黃魚(yú)屬暖溫性近海中下層集群洄游魚(yú)類，廣泛分布于黃海、東海、臺(tái)灣海峽等地，是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類，為傳統(tǒng)“四大海產(chǎn)”之一。大黃魚(yú)體內(nèi)蛋白質(zhì)、微量元素與維生素含量豐富，具有很好的食療效果，在東南亞有較好的消費(fèi)市場(chǎng)[1-2]。此外，大黃魚(yú)中還含有豐富的微量元素硒，能清除人體代謝產(chǎn)生的自由基，延緩衰老，對(duì)各種癌癥的預(yù)防有良好效果。水產(chǎn)品由于其水分含量高、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，極易發(fā)生腐敗變質(zhì)。低溫保鮮是目前應(yīng)用最為廣泛的水產(chǎn)品保鮮方法。冰藏保鮮是低溫保鮮方法之一，是指在水產(chǎn)品周圍放置冰，以此降低魚(yú)體溫度，使其接近冰點(diǎn)而不凍結(jié)，從而維持魚(yú)體新鮮度的方法[3]。

目前，我國(guó)90%以上大黃魚(yú)的流通銷售多以冰鮮形式進(jìn)行[4]，在實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)途運(yùn)輸時(shí)，使原料保持相對(duì)較高的新鮮度。冷鏈物流泛指冷藏冷凍類食品在生產(chǎn)、加工、貯藏、運(yùn)輸和銷售等環(huán)節(jié)始終處于規(guī)定的低溫環(huán)境下，以保障食品質(zhì)量的特殊供應(yīng)鏈系統(tǒng)[5]。多數(shù)情況下，由于運(yùn)輸條件與成本的限制，所以水產(chǎn)品在流通期間的溫度達(dá)不到規(guī)定要求，樣品易受外界環(huán)境的影響而發(fā)生溫度波動(dòng)，從而影響水產(chǎn)品品質(zhì)。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳（Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，PCR-DGGE）技術(shù)是目前用于分析微生物群落多樣性與監(jiān)視種群動(dòng)態(tài)的分子指紋技術(shù)手段[6]。相較于傳統(tǒng)微生物學(xué)方法，該技術(shù)不通過(guò)培養(yǎng)，直接從樣品中提取細(xì)菌總DNA，能檢測(cè)到難以培養(yǎng)或不能培養(yǎng)的微生物，且能同時(shí)對(duì)多個(gè)樣品進(jìn)行分析，具有快速、高效等優(yōu)點(diǎn)[7-8]。本研究主要模擬大黃魚(yú)的冷鏈與斷鏈兩種流通方式，以感官評(píng)分、菌落總數(shù)與嗜冷菌數(shù)、TVB-N值等指標(biāo)來(lái)綜合評(píng)價(jià)流通期間的溫度變化對(duì)大黃魚(yú)品質(zhì)的影響，并通過(guò)PCR-DGGE技術(shù)分析兩種流通過(guò)程中冰藏大黃魚(yú)的菌相變化，探究大黃魚(yú)流通過(guò)程中的腐敗菌，以期為大黃魚(yú)的流通運(yùn)輸與保鮮加工提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 原料

冰鮮大黃魚(yú)2016年1月購(gòu)自上海蘆潮港海鮮市場(chǎng)，樣品體態(tài)勻稱，鱗片完整且緊貼，魚(yú)鰓鮮紅清晰、眼球飽滿，具固有清新氣味，質(zhì)量（500±50）g，30 min內(nèi)運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，層冰層魚(yú)裝入泡沫箱內(nèi)。

1.2 主要藥品試劑

平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白胨、氯化鈉，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒。溶菌酶，天根生化科技（北京）有限公司；Premix Ex Taq 酶、100 bp DNA Ladder Marker，大連寶生物工程公司；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、尿素、TEMED，美國(guó)Sunshine公司；所有引物均由上海生工生物工程公司合成。

1.3 主要儀器設(shè)備

FOSS Kjeltec8400凱式定氮儀，丹麥FOSS中國(guó)上海有限公司；Testo-176T4型德圖電子溫度記錄儀，德國(guó)儀器國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；Appendrof PCR儀，德國(guó)Eppendorf公司；Dcode system變性凝膠梯度電泳儀、Gel-Doc2000型凝膠成像儀，美國(guó)Bio-Rad公司；Centrifuge 5810R冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；BCD-256KF冰箱，青島海爾股份有限公司；生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；MLS-3750滅菌鍋，日本SANYO公司等。

1.4 原料處理

將大黃魚(yú)樣品分成兩組，其中冷鏈組（T1）：從試驗(yàn)開(kāi)始至結(jié)束，樣品始終處于4℃；斷鏈組（T2）：模擬流通過(guò)程，樣品在搬運(yùn)、運(yùn)輸、配送和銷售環(huán)節(jié)于 20 ℃分別放置 2，24，8，1 h，其余環(huán)節(jié)溫度均為4℃。模擬冷鏈與斷鏈物流試驗(yàn)中溫度要求及相關(guān)操作標(biāo)準(zhǔn)參照 《食品冷鏈物流技術(shù)與管理規(guī)范》[9-10]進(jìn)行。冷鏈流通過(guò)程各環(huán)節(jié)試驗(yàn)設(shè)計(jì)如圖1所示，各環(huán)節(jié)完成后兩組樣品均置于4℃條件下貯藏。

圖1 冰鮮大黃魚(yú)流通過(guò)程模擬示意圖Fig.1 Simulated situations of cold chain logistics process of large yellow croaker with ice

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 溫度監(jiān)測(cè) 將多點(diǎn)溫度采集儀溫度探頭分別置于魚(yú)肉、泡沫箱內(nèi)冰層與箱蓋間和冷藏箱內(nèi)，分別監(jiān)測(cè)魚(yú)體中心、泡沫箱內(nèi)和泡沫箱外環(huán)境溫度。每隔15 min采集1次數(shù)據(jù)，對(duì)大黃魚(yú)流通期間的溫度波動(dòng)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。

1.5.2 品質(zhì)評(píng)價(jià)

1.5.2.1 感官分析 由6名經(jīng)專業(yè)訓(xùn)練的人員組成感官小組對(duì)樣品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。評(píng)價(jià)指標(biāo)參考《SC/T 3101-2010鮮大黃魚(yú)、凍大黃魚(yú)、鮮小黃魚(yú)、凍小黃魚(yú)》[11]與楊憲時(shí)等[12]法，分別在0 h（貯藏初期）、26 h（運(yùn)輸）、74 h（貯藏中期）、82 h（配送）、106 h（銷售后期）、131 h（貯藏中后期）、203 h、275 h、347 h、395 h（貯藏末期）對(duì)魚(yú)樣的眼球、魚(yú)鰓、質(zhì)地、氣味等4個(gè)方面采用4分法進(jìn)行感官評(píng)分。其中，0分為最佳品質(zhì)，1分為高品質(zhì)終點(diǎn)，2分為可接受終點(diǎn)，＞2分視為感官拒絕。

1.5.2.2 TVB-N值 用凱氏定氮儀測(cè)定如上時(shí)間內(nèi)樣品的TVB-N值，每個(gè)樣品3個(gè)平行。

1.5.2.3 菌落總數(shù)（TVC）與嗜冷菌數(shù)（PBC）分別在如上時(shí)間內(nèi)對(duì)兩組樣品取樣進(jìn)行菌落總數(shù)的測(cè)定。參考GB/T 4789.2-2010[13]操作。采用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定TVC值與PBC值。在（30±1）℃生化培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)（48±3）h計(jì)數(shù)為菌落總數(shù)，在（7±1）℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)10 d計(jì)數(shù)為嗜冷菌數(shù)。選取的每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行。

1.5.3 微生物多樣性分析

1.5.3.1 細(xì)菌總DNA提取 分別在0 h（貯藏初期）、26 h（運(yùn)輸）、74 h（貯藏中期）、106 h（銷售后期）、131 h（貯藏中后期）、395 h（貯藏末期）對(duì)兩組樣品取樣并進(jìn)行細(xì)菌總DNA提取。參考周琰冰等[14]法，稍作調(diào)整，采用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取細(xì)菌總DNA。提取前增加溶菌酶破壁處理，然后進(jìn)行DNA提取，并于1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，樣品在-20℃冰箱貯藏。

1.5.3.2 PCR擴(kuò)增 以樣品細(xì)菌總DNA為模板，進(jìn)行16S rDNA V3區(qū)段的PCR擴(kuò)增[15]。參考Muyzer等[16]法，分別選取上游引物為GC 341f（5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGG GGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’），下游引物選 518 r（5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3'），擴(kuò)增片段約 200 bp。PCR反應(yīng)體系參考Muyzer等[16]法，稍作調(diào)整，采用 50.0 μL反應(yīng)體系，具體為 Premix Taq 25.0 μL、 上游引物 1.0 μL、下游引物 1.0 μL、模板 2.0 μL、ddH2O 21.0 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min，35個(gè)循環(huán)（95℃變性 45 s，56℃退火 45 s，72℃延伸 1 min），72℃延伸8 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后置4℃貯藏備用。

1.5.3.3 DGGE分析 參考Du等[17]法對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行DGGE凝膠電泳。用8%聚丙烯酰胺凝膠（質(zhì)量比為丙烯酰胺∶甲叉雙丙烯酰胺=37.5∶1），變性梯度范圍為35%～50%。在1×TAE緩沖溶液中，60℃恒溫條件下，100V電壓電泳10 h。電泳完畢后采用 SYBR greenⅠ（1∶10 000）染色，重復(fù)兩次，每次染15 min。清水沖洗后使用凝膠成像系統(tǒng)成像。

1.5.3.4 優(yōu)勢(shì)條帶的回收、純化與測(cè)序 將染色后的DGGE凝膠置于紫外燈下，用經(jīng)酒精燈灼燒并冷卻的刀片切下不同位置、分離明顯且亮度較高的條帶。搗碎后分別裝入1.5 mL滅菌離心管中，加入 40 μL無(wú)菌水。常溫放置 24 h，取 2 μL回收產(chǎn)物作為模板DNA，用不含GC夾子的341f和518r作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序同1.5.3.2節(jié)。PCR擴(kuò)增后，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。出現(xiàn)特異性條帶后用PCR產(chǎn)物純化試劑盒對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化。將純化后產(chǎn)物送至上海邁浦生物科技有限公司測(cè)序，登錄NCBI網(wǎng)站，將測(cè)得的序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中已知序列進(jìn)行相似性比對(duì)。

1.5.4 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)處理：用軟件origin（Pro）8.5繪制曲線，數(shù)據(jù)間的差異通過(guò)統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0中的Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行方差分析與多重比較，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度監(jiān)測(cè)

溫度是冷鏈物流過(guò)程中最主要的影響因素，水產(chǎn)品的冷藏鏈要求是水產(chǎn)品被捕撈后，在其加工、運(yùn)輸、貯藏到銷售各環(huán)節(jié)都處在低溫環(huán)境下[18]。冰鮮大黃魚(yú)流通期間的溫度數(shù)據(jù)如圖2所示。

圖2 流通過(guò)程中溫度實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)圖Fig.2 Real-time temperature monitoring during cold chain logistic process

由圖2可知，冷鏈流通組中，大黃魚(yú)魚(yú)體中心溫度-1.5～-2.0℃，泡沫箱內(nèi)溫度3～4℃，泡沫箱外溫度4～5℃，整體波動(dòng)幅度小。而在斷鏈流通組中，當(dāng)環(huán)境溫度20℃時(shí)，泡沫箱內(nèi)溫度和魚(yú)體中心溫度均有較大波動(dòng)，魚(yú)體中心溫度最高為1.05℃，泡沫箱內(nèi)溫度達(dá)8.69℃。

2.2 感官評(píng)價(jià)

感官評(píng)價(jià)是通過(guò)人的視覺(jué)、味覺(jué)、嗅覺(jué)、聽(tīng)覺(jué)和觸覺(jué)等五官對(duì)事物的感覺(jué)來(lái)鑒別食品質(zhì)量的評(píng)定方法。由于其可直接在實(shí)驗(yàn)室或現(xiàn)場(chǎng)評(píng)價(jià)，因此能實(shí)現(xiàn)產(chǎn)品品質(zhì)的快速評(píng)定，是消費(fèi)者選購(gòu)水產(chǎn)品時(shí)評(píng)判其鮮度的主要方式，現(xiàn)已被世界各國(guó)研究人員廣泛采用。感官評(píng)定人員對(duì)大黃魚(yú)的眼球、魚(yú)鰓、質(zhì)地與氣味等方面進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，如圖3所示。

大黃魚(yú)初始感官分值為0.53±0.15，新鮮度較好，體表呈金黃色，眼球清澈、角膜透明，魚(yú)鰓鮮紅、黏液少且透明，肌肉堅(jiān)實(shí)富有彈性。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，樣品體表色澤逐漸暗淡，切面光澤度降低，肉質(zhì)相對(duì)松散，固有色澤隨之消失，異味產(chǎn)生。由圖3可見(jiàn)，隨著流通時(shí)間的延長(zhǎng)，大黃魚(yú)的感官分值逐漸上升，品質(zhì)逐漸劣變。在流通至275 h時(shí)，斷鏈組感官分值為2.35±0.13，超出可接受終點(diǎn)，而冷鏈組此時(shí)的感官分值為1.85±0.13，第347小時(shí)才達(dá)到2.27±0.12?？梢?jiàn)，溫度波動(dòng)加速了樣品的腐敗進(jìn)程。

圖3 冰鮮大黃魚(yú)流通過(guò)程中感官分值的變化Fig.3 Change of sensory scores in large yellow croaker with ice during logistics process

圖4 冰鮮大黃魚(yú)流通過(guò)程中TVB-N值的變化Fig.4 Change of TVB-N value in large yellow croaker with ice during logistics process

2.3 TVB-N值

魚(yú)肉貯藏過(guò)程中，由于微生物及魚(yú)體內(nèi)源酶的共同作用，魚(yú)肉蛋白質(zhì)發(fā)生降解，產(chǎn)生胺類物質(zhì)，導(dǎo)致TVB-N值升高，因此，TVB-N值是指示水產(chǎn)品腐敗程度的重要指標(biāo)[19]。根據(jù)SC/T 3101-2010[11]可知，TVB-N值≤13 mgN/100 g為一級(jí)品，13 mgN/100 g＜TVB-N值≤30 mgN/100 g為合格品，TVB-N值＞30 mgN/100 g為不可接受范圍。

相關(guān)研究表明，魚(yú)類TVB-N值的變化與樣品種類、生活地域、捕獲季節(jié)、魚(yú)齡和性別有關(guān)，這也是導(dǎo)致其TVB-N值存在差異的主因[20-21]。冰鮮大黃魚(yú)流通過(guò)程中TVB-N的變化如圖4所示，大黃魚(yú)的初始 TVB-N 值為（12.22±0.78）mgN/100 g，符合一級(jí)品的品質(zhì)要求。隨著流通時(shí)間的延長(zhǎng)，兩組樣品的微生物活動(dòng)加劇，使TVB-N值逐漸上升。第275小時(shí)，斷鏈組TVB-N值達(dá)到（31.04±0.06）mgN/100 g，超出可接受范圍，而冷鏈組TVB-N值僅為（25.68±1.56）mgN/100g。貯藏終點(diǎn)時(shí)冷鏈組和斷鏈組的TVB-N值均較高，達(dá)（37.27±1.00）mgN/100g與（39.79±0.54）mgN/100g。結(jié)合菌落總數(shù)的結(jié)果可知，冷鏈組貨架期為275～347 h，斷鏈組貨架期為203～275 h。

2.4 菌落總數(shù)與嗜冷菌數(shù)

菌落總數(shù)是水產(chǎn)品最重要的品質(zhì)評(píng)價(jià)指標(biāo)之一，其對(duì)水產(chǎn)品在貯藏過(guò)程中品質(zhì)的影響特別明顯，由微生物的生長(zhǎng)和新陳代謝所造成的水產(chǎn)品損失可達(dá)30%[22-23]。根據(jù)大黃魚(yú)國(guó)標(biāo)，TVC值＜4 lgCFU/g時(shí)為新鮮魚(yú)，4 lgCFU/g＜TVC 值＜5 lgCFU/g為二級(jí)鮮度，TVC值＞6 lgCFU/g時(shí)表明魚(yú)體腐敗[24]。

初始菌落數(shù)在水產(chǎn)品保藏中不僅是指示其初始新鮮度的重要指標(biāo)，還是影響鮮魚(yú)在冰藏期間腐敗進(jìn)程的重要因素[25]。如圖5a所示，大黃魚(yú)的初始菌落總數(shù)為（3.84±0.07）lg（CFU/g），符合一級(jí)品的品質(zhì)要求，與包玉龍等[26]研究得到的冰藏鯽魚(yú)初始菌落數(shù)3.78 lg（CFU/g）結(jié)果一致。大黃魚(yú)樣品流通至275 h時(shí)，斷鏈組菌落總數(shù)達(dá)（6.50±0.07）lg（CFU/g），超出可接受范圍。而冷鏈組此時(shí)的菌落總數(shù)僅為（5.69±0.05）lg（CFU/g）。貯藏末期，冷鏈組的菌落總數(shù)為（7.56±0.03）lg（CFU/g），低于斷鏈組的（7.76±0.01）lg（CFU/g）。

大黃魚(yú)在斷鏈流通時(shí)，其魚(yú)體中心溫度和魚(yú)體外部環(huán)境溫度有所波動(dòng)，且嗜冷菌的較適生長(zhǎng)溫度范圍為0～20℃，對(duì)大黃魚(yú)進(jìn)行嗜冷菌數(shù)測(cè)定，以此評(píng)估兩種流通方式對(duì)嗜冷菌正常生長(zhǎng)的影響。由圖5b可知，兩組樣品的初始嗜冷菌菌落數(shù)為（3.64±0.08）lg（CFU/g）。其中斷鏈組樣品在流通至 131h 時(shí)，嗜冷菌數(shù)達(dá)（5.66±0.09）lg（CFU/g），而冷鏈組嗜冷菌數(shù)為（4.90±0.10）lg（CFU/g），斷鏈組嗜冷菌數(shù)增長(zhǎng)速率大于冷鏈組。在流通末期，冷鏈組和斷鏈組的嗜冷菌數(shù)分別為（7.79±0.13）lg（CFU/g）與（7.84±0.10）lg（CFU/g），斷鏈組樣品的嗜冷菌數(shù)高于冷鏈組樣品。斷鏈流通時(shí)，其溫度環(huán)境為嗜冷菌提供有利的生長(zhǎng)條件。與菌落總數(shù)相比，兩組樣品的嗜冷菌數(shù)大于菌落總數(shù)，可能由于流通過(guò)程中大黃魚(yú)所處溫度環(huán)境更適于嗜冷菌的生長(zhǎng)繁殖。

圖5 冰鮮大黃魚(yú)流通過(guò)程中菌落總數(shù)與嗜冷菌數(shù)的變化Fig.5 Change of TVC and PBC in large yellow croaker with ice during logistics process

2.5 細(xì)菌16S rDNA的V3區(qū)PCR擴(kuò)增結(jié)果

以細(xì)菌總DNA為模板，用引物GC341f和518r對(duì)細(xì)菌的16S rDNA V3區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以不加模板DNA為陰性對(duì)照，結(jié)果如圖6所示。

由圖6可知，11組樣品均有較亮的特異性擴(kuò)增條帶，且不加DNA模板的樣品，即陰性對(duì)照無(wú)條帶，說(shuō)明引物和ddH2O未被污染。通過(guò)與Marker對(duì)比發(fā)現(xiàn)，特異性擴(kuò)增條帶分子質(zhì)量均在200 bp左右，說(shuō)明PCR擴(kuò)增體系與反應(yīng)程序合適，可用于DGGE分析。

2.6 DGGE圖譜分析

PCR-DGGE可用于評(píng)價(jià)冰鮮大黃魚(yú)在流通期間的微生物生態(tài)多樣性。冰鮮大黃魚(yú)流通過(guò)程中細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)PCR產(chǎn)物的DGGE圖譜如圖7所示。同一泳道上不同位置的條帶代表不同的細(xì)菌，條帶亮度反映細(xì)菌相對(duì)量的多少，不同的條帶數(shù)體現(xiàn)樣品微生物的豐度[8，27]。

從圖7可看出，冷鏈處理組與斷鏈處理組中每個(gè)泳道上均有較多條帶。其中，26 h時(shí)，斷鏈組樣品條帶數(shù)多于冷鏈組，其它時(shí)間點(diǎn)兩組樣品的條帶分布較相似。隨著流通時(shí)間的延長(zhǎng)，到末期395h時(shí)，冷鏈與斷鏈組泳道的條帶數(shù)明顯多余其它泳道，且多數(shù)條帶較亮，表明貯藏末期，樣品中的微生物種類與數(shù)量明顯增加。此時(shí)，1～6條帶均變?nèi)?，可能是由于低溫貯藏使細(xì)菌的生長(zhǎng)速度減弱或優(yōu)勢(shì)菌群在競(jìng)爭(zhēng)中占有優(yōu)勢(shì)，抑制了其它細(xì)菌的生長(zhǎng)[6，15]。7、8、10 條帶變亮，9、11 條帶出現(xiàn)。這些條帶亮度深淺與條帶數(shù)變化反映冰鮮大黃魚(yú)在流通過(guò)程中微生物多樣性的演變過(guò)程。

圖6 細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.6 Electrophoresis profile of PCR products from bacterial 16S rDNA V3 region

圖7 大黃魚(yú)流通過(guò)程中的細(xì)菌DGGE圖譜Fig.7 DGGE fingerprinting of PCR products of large yellow croaker with ice during logistics process

2.7 主要條帶切膠回收后PCR擴(kuò)增及測(cè)序結(jié)果

根據(jù)DGGE圖譜，選取條帶1～11進(jìn)行切膠回收。以回收的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析得知條帶均在200 bp左右，可知，切膠回收的11個(gè)條帶均擴(kuò)增成功，其中8號(hào)、9號(hào)條帶較淺，可能由于DGGE膠較薄，切膠過(guò)程中造成條帶損失或回收DNA量較少[15]。將PCR產(chǎn)物純化后送檢測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知序列進(jìn)行相似性比對(duì)，結(jié)果如表1所示。

表1 DGGE條帶分離的細(xì)菌16S rDNA序列比較Table 1 Comparison of dominant microbe similarity by partial 16S rDNA sequencing fragments from DGGE bands

測(cè)序結(jié)果中，條帶4濃度不高，PCR產(chǎn)物測(cè)序不成功，無(wú)法進(jìn)行比對(duì)。由表1可知，冰鮮大黃魚(yú)在兩種流通方式下，通過(guò)PCR-DGGE法測(cè)序比對(duì)后得到的微生物主要有不動(dòng)桿菌、腐生葡萄球菌、假交替單胞菌、副溶血性弧菌、假單胞菌、嗜冷桿菌、熒光假單胞菌與希瓦氏菌。結(jié)合圖6的DGGE圖譜和表1測(cè)序結(jié)果可知，冰鮮大黃魚(yú)在流通末期，腐生葡萄球菌、假交替單胞菌和副溶血性弧菌逐漸減少，尤其是副溶血性弧菌在貯藏末期不再出現(xiàn)；假單胞菌、嗜冷桿菌與熒光假單胞菌在流通后期亦有出現(xiàn)，并占有較高比例，希瓦氏菌在流通末期中也有出現(xiàn)。嗜冷桿菌所占比例較高的結(jié)論也與前期嗜冷菌數(shù)測(cè)定結(jié)果相吻合，可見(jiàn)低溫流通對(duì)其生長(zhǎng)有利。同時(shí)，不動(dòng)桿菌與不可培養(yǎng)細(xì)菌在樣品流通過(guò)程中均存在綜上所述，冰鮮大黃魚(yú)在冷鏈和斷鏈兩種流通方式下貯藏末期的主要優(yōu)勢(shì)菌是假單胞菌與嗜冷桿菌，同時(shí)也有不動(dòng)桿菌與希瓦氏菌。這與郭全友等[28]研究養(yǎng)殖大黃魚(yú)冷藏過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌群為腐敗希瓦氏菌和假單胞菌屬結(jié)果相似。

假單胞菌為革蘭氏陰性桿菌，單鞭毛，具運(yùn)動(dòng)性，是水產(chǎn)品中一類常見(jiàn)的需氧型腐敗菌[15，29]。許鐘等[30]研究表明，假單胞菌是冷藏養(yǎng)殖羅非魚(yú)在0，5℃和10℃貯藏貨架期終點(diǎn)的特定腐敗菌；朱天祥等[31]報(bào)道其為冰鮮大黃魚(yú)4℃冷藏5 d后的優(yōu)勢(shì)腐敗菌。希瓦氏菌為革蘭氏陰性桿菌，郭紅等[32]研究發(fā)現(xiàn)，南美白對(duì)蝦達(dá)一級(jí)鮮度時(shí)，在冰溫（-1.4±0.1）℃條件下的特定腐敗菌為希瓦氏菌。不動(dòng)桿菌存在于魚(yú)體表面的黏液、魚(yú)鰓及消化道中，也為常見(jiàn)的腐敗細(xì)菌[33]。

3 結(jié)論

本文研究了冰鮮大黃魚(yú)在冷鏈與斷鏈流通中品質(zhì)及微生物演替規(guī)律。得出結(jié)果：隨著流通時(shí)間的延長(zhǎng)，大黃魚(yú)感官分值呈上升趨勢(shì)，品質(zhì)相應(yīng)劣變，微生物數(shù)明顯升高，且斷鏈組增長(zhǎng)速率大于冷鏈組。斷鏈組樣品在流通至275 h時(shí)，感官分值和菌落總數(shù)分別達(dá)到（2.35±0.13）lg（CFU/g）和（6.50±0.07）lg（CFU/g），超出可接受范圍。冷鏈組貨架期為275～347 h，而斷鏈組貨架期僅為203～275 h。通過(guò)直接提取不同流通階段樣品中的細(xì)菌DNA，PCR擴(kuò)增后進(jìn)行DGGE電泳分析，并對(duì)DGGE圖譜上分離較好且較亮條帶的切膠回收并測(cè)序，可獲得冰鮮大黃魚(yú)在兩種流通期間微生物的種類變化及優(yōu)勢(shì)菌。結(jié)果表明：冰鮮大黃魚(yú)在流通期間貯藏末期的主要優(yōu)勢(shì)菌為假單胞菌與嗜冷桿菌，也有不動(dòng)桿菌與希瓦氏菌。