轉(zhuǎn)錄因子FOXO1和干細(xì)胞標(biāo)志物CD133與神經(jīng)母細(xì)胞瘤臨床病理因素相關(guān)性

王芳

(渮澤醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校內(nèi)科學(xué)教研室，山東 菏澤 274000)

腫瘤干細(xì)胞是存在于腫瘤中的具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞，文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)母細(xì)胞瘤(NB)組織和細(xì)胞中存在腫瘤干細(xì)胞〔1，2〕，而且NB惡化程度與腫瘤干細(xì)胞的比例密切相關(guān)〔3〕。CD133作為腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物，廣泛應(yīng)用于神經(jīng)干細(xì)胞及腫瘤干細(xì)胞的分選及鑒定。叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O亞族(FOXO)1作為腫瘤抑制轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于人體組織器官，如心、腦、胎盤、肺、肝、骨骼肌、前列腺、卵巢、小腸、結(jié)腸、外周血白細(xì)胞等〔4〕。在腫瘤組織如NB、前列腺癌〔5〕、乳腺癌〔6〕、肝癌〔7〕等中表達(dá)下調(diào)，參與腫瘤組織發(fā)生發(fā)展。既往研究發(fā)現(xiàn)FOXO1參與神經(jīng)干細(xì)胞〔8〕和精原干細(xì)胞〔9〕干性維持，但有關(guān)FOXO1調(diào)控NB細(xì)胞分化的研究目前尚無(wú)報(bào)道。本研究通過免疫組化及Western印跡法檢測(cè)不同臨床分期、病理類型NB組織中FOXO1和CD133表達(dá)情況，并分析兩者的相關(guān)性。

1 材料和方法

1.1臨床材料及標(biāo)本采集 選取菏澤醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校附屬醫(yī)院病理科2012年5月至2017年8月入院經(jīng)術(shù)后切除NB石蠟組織塊標(biāo)本53例為病例組，均通過組織病理學(xué)檢查確診。另選取癌旁正常組織27例為對(duì)照組。病例組臨床分期：其中1期12例、2期10例、3期13例、4期10例，4S期8例。

1.2試劑及耗材 FOXO1兔抗人單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，兔抗人CD133單克隆抗體購(gòu)自Abcam公司，免疫組織化學(xué)SP染色試劑盒二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑購(gòu)于北京中杉金橋生物有限公司。

1.3免疫組化染色 每個(gè)石蠟包塊連續(xù)切片5張，每張切片放置兩片組織、厚度4～5 μm，1張行蘇木素-伊紅(HE)染色復(fù)查診斷。采用SP法進(jìn)行組織染色，實(shí)驗(yàn)操作按照試劑盒使用說(shuō)明書進(jìn)行:組織切片使用二甲苯脫蠟8 min×3次，應(yīng)用不同濃度梯度乙醇溶液水化組織切片后在蒸餾水中洗滌3 min×3次，加入高壓鍋于121℃×5 min高壓抗原修復(fù)并自然降溫至室溫，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后加入0.3%過氧化氫阻斷組織內(nèi)源性過氧化物酶活性處理30 min，PBS洗滌后滴加一抗4℃孵育過夜，PBS清洗10 min×3次，滴加二抗常溫孵育1 h，PBS清洗10 min×3次，滴加DAB顯色液顯色，蘇木素復(fù)染后脫水、封片。陰性對(duì)照為使用PBS代替一抗處理組織切片。

1.4免疫組化結(jié)果判定 免疫組化染色處理組織切片，置于顯微鏡下觀察拍照。FOXO1以胞核染色棕色者表示陽(yáng)性，CD133以胞膜染色棕色者表示陽(yáng)性。隨機(jī)選取高倍鏡(400倍)3～4個(gè)視野拍照，統(tǒng)計(jì)不同視野下100個(gè)腫瘤細(xì)胞中FOXO1或CD133表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，依據(jù)FOXO1或CD133表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞所占比例判斷NB的FOXO1或CD133表達(dá)水平:其中陰性(-)<5%、弱陽(yáng)性(+)6%～25% 、 中度陽(yáng)性()26%～50% 、 強(qiáng) 陽(yáng) 性()>50%。

1.5Western印跡檢測(cè)組織中FOXO1和CD133蛋白表達(dá) 兩組組織切小塊置入研磨器中，加入RIPA蛋白裂解液研磨，轉(zhuǎn)移至1.5 ml離心管，震蕩混勻30 s，冰上靜置10 min，4℃、15 000 r/min離心15 min，提取上清總蛋白后重復(fù)上述離心，提取上清總蛋白。留取5 μl定量，其余加入6×上樣緩沖液(1∶5體積比)后在沸水中煮沸5 min變性。取30 μg蛋白上樣，10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)進(jìn)行電泳分離，用110 V電壓2 h將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素(NC)膜上。50 g/L脫脂奶粉將膜封閉1 h后,將膜置于特定一抗，4℃搖床上孵育過夜。次日使用TBST洗膜液10 min/次洗3次并置于相應(yīng)的二抗，常溫?fù)u床慢速孵育1 h，10 min/次洗3次后使用電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影液進(jìn)行顯影，目的蛋白表達(dá)量通過與內(nèi)參蛋白β-actin標(biāo)準(zhǔn)化后得到相對(duì)比值。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS19.0軟件進(jìn)行多因素方差分析、χ2檢驗(yàn)、Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1兩組FOXO1和CD133蛋白表達(dá) 免疫組化結(jié)果顯示，F(xiàn)OXO1蛋白染色陽(yáng)性呈棕黃色顆粒，主要定位于細(xì)胞核，少數(shù)胞質(zhì)中亦可見表達(dá)。在病例組中有21例表達(dá)陽(yáng)性者，陽(yáng)性率為39.6%(21/53)，其中弱陽(yáng)性(+)8例，中度陽(yáng)性()8例，強(qiáng)陽(yáng)性()5例。FOXO1蛋白在對(duì)照組中有19例表達(dá)陽(yáng)性者，陽(yáng)性率為70.4%(19/27)，其中弱陽(yáng)性(+)5例，中度陽(yáng)性()7例，強(qiáng)陽(yáng)性()7例。見圖1。對(duì)照組FOXO1蛋白表達(dá)陽(yáng)性率顯著高于病例組(P<0.05)。經(jīng)免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，CD133蛋白陽(yáng)性棕黃色顆粒主要定位于胞膜及胞質(zhì)中，在病例組中陽(yáng)性表達(dá)率為64.2%(34/53)，弱陽(yáng)性(+)14例，中 度 陽(yáng) 性()8例，強(qiáng)陽(yáng)性()12例。同時(shí)，CD133蛋白在對(duì)照組中陽(yáng)性率為37.0%(10/27)，其中弱陽(yáng)性(+)4例，中度陽(yáng)性()3例，強(qiáng)陽(yáng)性()3例，見圖1。病例組中CD133陽(yáng)性率顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

2.2病例組FOXO1和CD133表達(dá)陽(yáng)性率與病理指標(biāo)的關(guān)系 病例組不同臨床分期、病理分型及組織類型FOXO1、CD133表達(dá)陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

圖1 兩組FOXO1和CD133陽(yáng)性表達(dá)(×400)

分類nFOXO1χ2值P值CD133χ2值P值臨床分期1～2期2213(59.1)6.581<0.0512(54.5)16.764<0.053～4期235(21.7)18(78.3)4S期83(37.5)4(50.0)組織類型NB4215(35.7)25.013<0.0530(71.4)69.281<0.05GNB116(54.5)4(36.4)病理分型預(yù)后良好型2115(71.4)14.504<0.059(42.9)23.536<0.05預(yù)后不良好型326(18.7)25(78.1)

2.3Western印跡檢測(cè)FOXO1和CD133蛋白表達(dá) NB組織未檢測(cè)到FOXO1蛋白表達(dá)或表達(dá)極弱，而癌旁組織中FOXO1不同程度表達(dá)；NB組織CD133不同程度表達(dá)，而癌旁組織中CD133表達(dá)明顯減弱，見圖2。進(jìn)一步經(jīng)Image-J軟件灰度值分析提示，NB組織和癌旁組織中FOXO1、CD133表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

N1、N2、N3:癌旁組織；C1、C2、C3:NB組織；表2同圖2 Western印跡檢測(cè)FOXO1、CD133表達(dá)

組別FOXO1CD133N10.98±0.031.05±0.03C10.21±0.021)2.04±0.031)N20.97±0.021.07±0.04C20.05±0.012)7.75±0.142)N30.98±0.031.00±0.01C30.04±0.013)6.68±0.173)

與N1組比較：1)P<0.05;與N2組比較：2)P<0.05;與N3組比較：3)P<0.05

2.4FOXO1和CD133表達(dá)的相關(guān)性分析 53例NB患者中FOXO1和CD133表達(dá)均陽(yáng)性者為7例，均陰性者5例；FOXO1表達(dá)陽(yáng)性，CD133表達(dá)陰性者18例；FOXO1表達(dá)陰性，CD133表達(dá)陽(yáng)性者23例。經(jīng)過Pearson等級(jí)相關(guān)分析:FOXO1和CD133的表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.68,P<0.05)。

3 討 論

腫瘤干細(xì)胞具有無(wú)限增殖、多向分化潛能和高度自我更新能力，常是引起腫瘤異質(zhì)性的重要因素〔10〕。腫瘤干細(xì)胞數(shù)量較少，然而可在腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)及后期腫瘤耐藥中起到重要作用。研究發(fā)現(xiàn)腫瘤干細(xì)胞存在于NB中，Meany等〔11〕對(duì)41例NB細(xì)胞使用Hoechst染料進(jìn)行染色處理，通過流式細(xì)胞儀方法對(duì)NB腫瘤細(xì)胞進(jìn)行干細(xì)胞分選處理，在18例NB腫瘤細(xì)胞成功篩選出干細(xì)胞群。因此，深入研究NB干細(xì)胞發(fā)生及發(fā)展機(jī)制，對(duì)于NB治療和預(yù)防將具有重要意義。

FOXO1蛋白在多種腫瘤中異常表達(dá)，是胰島素/胰島素樣生長(zhǎng)因子信號(hào)通路的關(guān)鍵分子，上游受磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)磷酸化級(jí)聯(lián)通路的調(diào)節(jié)，下游調(diào)節(jié)的靶基因與細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移及干細(xì)胞等有關(guān)。其表達(dá)及活性在多種水平受到調(diào)節(jié)，如轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平、翻譯后修飾及蛋白酶體降解等。FOXO1作為轉(zhuǎn)錄因子存在于細(xì)胞核內(nèi)，當(dāng)被上游調(diào)控分子磷酸化后轉(zhuǎn)移至胞質(zhì)中，無(wú)法激活下游靶基因，從而不能發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子功能〔12〕。本研究通過免疫組化發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO1蛋白在NB中明顯低表達(dá)，同時(shí)Western印跡結(jié)果進(jìn)一步證明了FOXO1在NB中處于低表達(dá)水平，提示抑癌蛋白FOXO1在NB發(fā)生、發(fā)展過程中起到重要作用。進(jìn)一步分析FOXO1蛋白與NB的臨床分期、組織類型和病理分型之間存在明顯相關(guān)性，提示FOXO1蛋白表達(dá)可能影響NB生物學(xué)特性。

CD133是細(xì)胞膜蛋白，作為造血和某些正常組織干細(xì)胞標(biāo)志物特異性標(biāo)志物存在。研究發(fā)現(xiàn)，全身多種臟器組織如心、腦、腎臟等存在CD133的mRNA轉(zhuǎn)錄本，此外神經(jīng)嵴干細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)CD133的存在，Chen等〔1〕使用流式細(xì)胞分離技術(shù)從腦細(xì)胞中提取到CD133+表型、具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞。近些年來(lái)，CD133已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于腫瘤干細(xì)胞的特異性標(biāo)記，并且在NB中證實(shí)存在CD133陽(yáng)性表達(dá)的腫瘤干細(xì)胞。將CD133+表達(dá)神經(jīng)腫瘤干細(xì)胞通過注射方法種植于免疫缺陷小鼠皮下，結(jié)果全部免疫缺陷小鼠存在腦腫瘤成瘤〔13〕，同樣將CD133-表達(dá)神經(jīng)腫瘤細(xì)胞種植于免疫缺陷小鼠皮下，卻難以引起小鼠腦腫瘤成瘤〔14〕。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CD133在NB組織中陽(yáng)性表達(dá)，且隨臨床分期增加，CD133陽(yáng)性率呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)。此外Western印跡結(jié)果進(jìn)一步證明了CD133在NB中處于高表達(dá)水平。

關(guān)于FOXO1與CD133之間是否存在關(guān)聯(lián)性，Song等〔15〕在胰腺導(dǎo)管腺癌中發(fā)現(xiàn)FOXO1低表達(dá)的腫瘤細(xì)胞具有明顯干細(xì)胞特性且CD133處于高表達(dá)狀態(tài)，而FOXO1高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞細(xì)胞干性明顯減弱且CD133表達(dá)明顯下調(diào)，推測(cè)CD133可能是FOXO1下游靶基因，F(xiàn)OXO1很可能通過調(diào)節(jié)CD133表達(dá)來(lái)調(diào)控腫瘤細(xì)胞干細(xì)胞特性。本研究中，通過免疫組織化學(xué)染色方法檢測(cè)兩者，使用蛋白水平作為綜合尺度來(lái)推測(cè)兩者表達(dá)之間的相關(guān)性，通過結(jié)果分析得知FOXO1和CD133在蛋白水平存在明顯負(fù)相關(guān)性，與既往胰腺癌中的研究呈現(xiàn)相似結(jié)果，推測(cè)NB干細(xì)胞特性可能通過FOXO1表達(dá)下調(diào)引起CD133蛋白水平升高來(lái)控制。

近年來(lái)分子靶向治療在很多腫瘤疾病中取得突破性進(jìn)展，本研究證實(shí)在NB組織中FOXO1和CD133異常表達(dá)且與臨床分期及腫瘤發(fā)生發(fā)展存在密切聯(lián)系，并存在明顯負(fù)相關(guān)性，認(rèn)為以兩者為靶點(diǎn)進(jìn)行綜合性治療對(duì)于NB治療將會(huì)取得更佳療效。