慢病毒介導的SUMO1P3基因表達對胃癌細胞侵襲、遷移、黏附能力及EMT的影響

任喜尚 楊潔 鄭鳳龍

(鄭州澍青醫(yī)學高等?？茖W校臨床醫(yī)學系，河南 鄭州 450064)

胃癌死亡率居惡性腫瘤首位，近些年的發(fā)病率有上升趨勢〔1〕。腫瘤發(fā)生發(fā)展涉及多基因、多信號，已有多項研究表明基因異常表達可影響胃癌增殖、侵襲遷移和黏附〔2,3〕。上皮細胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是指上皮細胞在某些特定生理病理條件下，轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)樣表型細胞的生物學過程〔4〕。EMT參與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移、胚胎發(fā)育、組織纖維化等多種生理及病理過程。研究表明，發(fā)生EMT的腫瘤細胞，細胞侵襲和遷移能力明顯增強，更易發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移及周圍組織浸潤〔5〕。也有研究表明降低腫瘤細胞EMT可抑制細胞侵襲和遷移能力〔6〕。小泛素樣修飾物基因(SUMO)是存在于所有真核生物的保守序列，SUMO1P3是SUMO假基因家族一員，有研究表明，沉默胰腺癌細胞SUMO1P3表達可抑制細胞增殖、遷移及侵襲能力，可能與其抑制EMT過程有關(guān)〔7〕。胃癌細胞中SUMO1P3也呈高表達，其表達與腫瘤大小、分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有關(guān)〔8〕，SUMO1P3對胃癌細胞生物學特性影響研究尚未清楚。本研究以慢病毒為載體沉默胃癌細胞SUMO1P3表達，旨在研究SUMO1P3基因?qū)ξ赴┘毎鲋?、侵襲、遷移和黏附能力的影響。

1 材料與方法

1.1實驗細胞及慢病毒 人胃癌BGC-823細胞購自中科院上海細胞生物學研究所。SUMO1P3 siRNA慢病毒載體由美國Sigma設計合成包裝。

1.2試劑和儀器 胎牛血清(FBS)、RPMI1640培養(yǎng)基均購自美國Gibco；噻唑藍(MTT)購自美國Sigma；Transwell細胞培養(yǎng)板及Matrigel膠均購自美國BD；聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白定量試劑盒購自美國Pierce；SUMO1P3、E-鈣黏蛋白(cadherin)、波形蛋白(Vimentin)和α-SMA抗體均購自美國Abcam；酶標儀購自美國BIORAD。

1.3細胞培養(yǎng) BGC-823細胞用含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，于5%體積分數(shù)CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.4siRNA慢病毒轉(zhuǎn)染 取生長狀態(tài)良好的BGC-823細胞，用綠色熒光染料CFSE標記后以5×104/孔濃度接種細胞于6孔板，無抗生素的RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞24 h，待細胞達40%～60%的匯合度時進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染參照LipofectamineTM RNAi MAX轉(zhuǎn)染試劑盒說明。實驗分組：空白組不作處理；NC組轉(zhuǎn)染陰性對照病毒載體(把RNA干擾病毒所使用的干擾序列換成無序、無干擾作用的堿基)；si-SUMO1P3組轉(zhuǎn)染SUMO1P3基因的siRNA慢病毒載體。將含siRNA慢病毒及陰性對照病毒的轉(zhuǎn)染試劑與細胞共孵育5 h，加入新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)孵育，48 h后通過Western印跡檢測轉(zhuǎn)染效果。

1.5轉(zhuǎn)染效果檢測 適量放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液常規(guī)提取轉(zhuǎn)染siRNA慢病毒的細胞總蛋白，BCA法定量蛋白。取50 μg蛋白上樣，經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉封閉膜后，加一抗(1∶500稀釋的SUMO1P3、E-cadherin、Vimentin和α-SMA抗體)4℃過夜，加二抗〔辣根過氧化物酶(HRP)標記的1∶2 000稀釋的兔抗鼠IgG〕，37℃孵育1 h，TBST洗滌。加電化學發(fā)法(ECL)試劑，曝光3 min，暗室中顯影、定影。用Image-J軟件行圖像條帶灰度值分析。以GAPDH為內(nèi)參，SUMO1P3、E-cadherin、Vimentin和α-SMA與GAPDH灰度值比值為蛋白相對表達量。實驗重復3次。

1.6細胞活力檢測實驗 將轉(zhuǎn)染siRNA慢病毒的BGC-823細胞接種于96孔板，每孔5×103個，轉(zhuǎn)染24、48、72 h，每孔加入MTT試劑(5 mg/ml)20 μl，37℃孵育4 h，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl，震蕩5 min，酶標儀測定570 nm波長吸光度(A)值。實驗重復3次。

1.7細胞侵襲能力檢測實驗 將500 μg Matrigel鋪在Transwell小室濾膜上，37℃孵育2 h使膠凝固。Transwell小室上室加100 μl轉(zhuǎn)染siRNA慢病毒48 h的細胞懸液，Transwell小室下室加600 μl含10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)液，37℃孵育24 h，吸棄上室液體，棉簽輕拭掉Matrigel膠及未侵襲的細胞，4%多聚甲醛固定及結(jié)晶紫染色后，使用倒置顯微鏡(×400)隨機選擇5個視野，計數(shù)穿膜細胞數(shù)，取均值。實驗重復3次。

1.8細胞遷移能力檢測實驗 實驗步驟大體同1.7，差異在于聚碳酸多孔濾膜表面未鋪Matrigel。

1.9細胞黏附力檢測實驗 胰酶消化轉(zhuǎn)染siRNA 慢病毒48 h的細胞，將細胞濃度調(diào)整為5×104個/ml，接種細胞懸液于96孔，每孔100 μl，培養(yǎng)箱中孵育5、30、60 min，更換培養(yǎng)液，取出未貼壁細胞，MTT法檢測各個孔A值。方法同1.6。

1.10統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組SUMO1P3蛋白表達 si-SUMO1P3組SUMO1P3蛋白表達(0.052±0.005)明顯低于空白組(0.668±0.065，P<0.05)，NC組(0.679±0.068)與空白組差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；3組比較差異有統(tǒng)計學意義(F=130.613，P=0.000)，見圖1。

圖1 Western印跡檢測SUMO1P3蛋白表達

2.2各組BGC-823細胞活力比較 si-SUMO1P3組BGC-823細胞24、48、72 h細胞活力均顯著低于空白組(P<0.05)。見表1。

2.3各組BGC-823細胞侵襲和遷移能力比較 與空白組比較，si-SUMO1P3組細胞侵襲和遷移能力明顯降低(P<0.05)。見圖2，表2。

表1 各組BGC-823細胞活力比較

與空白組比較：1)P<0.05；下表同

圖2 抑制SUMO1P3表達對BGC-823細胞侵襲(×400)

組別細胞侵襲數(shù)細胞遷移數(shù)空白組202.3±11.4154.3±8.7NC組198.8±10.7150.1±7.2si-SUMO1P3組121.2±6.41)96.5±5.31)F/P值66.280/0.00060.064/0.000

2.4各組BGC-823細胞黏附能力比較 si-SUMO1P3組在接種30 min和60 min細胞黏附能力均明顯低于空白組(P<0.05)。見表3。

表3 各組BGC-823細胞黏附能力比較

2.5各組EMT相關(guān)蛋白表達比較 與空白組比較，si-SUMO1P3組E-cadherin表達明顯升高，Vimentin和α-SMA表達明顯降低(P<0.05)。見圖3、表4。

圖3 Western印跡檢測各組細胞EMT相關(guān)蛋白表達

組別E-cadherinVimentinα-SMA空白組0.046±0.0060.578±0.0580.401±0.036NC組0.053±0.0080.592±0.0610.392±0.032si-SUMO1P3組0.487±0.0531)0.147±0.0181)0.076±0.0101)F值P值197.4320.00077.7400.000127.4150.000

3 討 論

腫瘤發(fā)生發(fā)展是一個多基因、多階段、多因素的復雜過程，腫瘤相關(guān)基因與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，對腫瘤分子生物學特性及機制研究具有重要意義。SUMO是存在于所有真核生物的保守序列，有SUMO1、SUMO2、SUMO3和SUMO4 4條編碼蛋白基因，SUMO1、SUMO2和SUMO3在人體各種組織和細胞中廣泛存在，參與細胞核轉(zhuǎn)運、凋亡、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等細胞過程，SUMO1有8條假基因，SUMO1P3是SUMO假基因家族成員之一，研究表明SUMO1P3影響腫瘤發(fā)生發(fā)展〔9〕。研究顯示，膀胱癌SUMO1P3基因上調(diào)表達與組織學分級及晚期TNM分期呈正相關(guān)，沉默SUMO1P3 表達可抑制癌細胞增殖、遷移和誘導凋亡〔10〕；結(jié)直腸癌中SUMO1P3表達明顯高于正常組織，沉默SUMO1P3表達可阻滯細胞于G1期，抑制細胞增殖，促進細胞凋亡〔11〕。胃癌中SUMO1P3研究較少。有研究顯示，胃癌細胞中SUMO1P3也呈現(xiàn)高表達，其表達與腫瘤大小、分化、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等有關(guān)〔8〕。本研究旨在SUMO1P3表達對胃癌細胞侵襲遷移及黏附能力的影響。

RNA干擾(RNAi)是由RNA雙鏈介導的在轉(zhuǎn)錄后沉默基因的現(xiàn)象，作為一種新的、強有力的研究工具，具有快速、高效、序列特異性及易操作等優(yōu)點，使用RNAi技術(shù)治療腫瘤、遺傳性疾病、炎癥等已成為研究熱點，目前RNAi技術(shù)在腫瘤方面研究已有迅速發(fā)展〔12,13〕，在胃癌治療中也取得了一定進展。研究表明，通過RNAi技術(shù)抑制基因表達可降低胃癌細胞生長。如有RNAi介導的NOX4基因沉默可通過JAK激酶(JAK2)/信號轉(zhuǎn)錄與轉(zhuǎn)錄因子(STAT)3信號抑制胃癌細胞侵襲能力〔14〕；通過RNAi技術(shù)抑制肝腸鈣黏連蛋白(CDH17)基因表達可抑制胃癌細胞增殖，誘導細胞凋亡〔15〕。本研究結(jié)果顯示，SUMO1P3表達降低可抑制BGC-823細胞增殖、侵襲、遷移及黏附力，提示抑制SUMO1P3表達可降低胃癌細胞生長。

EMT與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，通過EMT，上皮來源腫瘤細胞失去極性，細胞間黏附能力降低，同時獲得較高的侵襲遷移能力和抗凋亡能力，甚至降低細胞外基質(zhì)能力，使腫瘤細胞更易發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移〔16,17〕。因此EMT是腫瘤進展的重要環(huán)節(jié)。EMT過程發(fā)生依賴于E-cadherin等上皮表型蛋白表達下調(diào)，Vimentin、α-SMA等間質(zhì)表型相關(guān)蛋白過表達〔18〕。E-cadherin是EMT發(fā)生的重要標志，在包括胃癌在內(nèi)的多種腫瘤中表達降低，低表達E-cadherin的胃癌患者生存期更短，而胃癌中重新表達E-cadherin可降低細胞侵襲和遷移能力〔19〕。侵襲遷移能力強、分化強的腫瘤細胞Vimentin和α-SMA往往高表達，而抑制其表達可降低腫瘤細胞侵襲和遷移能力〔20,21〕。本研究結(jié)果提示，SUMO1P3表達抑制可通過EMT途徑抑制胃癌細胞侵襲遷移。