趙夢娜，梁 晶，張克中，2，3，崔金騰，2，3*

(1.北京農(nóng)學(xué)院園林學(xué)院，北京102206；2.城鄉(xiāng)生態(tài)環(huán)境北京實(shí)驗(yàn)室，北京102206；3.北京市鄉(xiāng)村景觀規(guī)劃設(shè)計(jì)工程技術(shù)研究中心，北京102206)

病毒介導(dǎo)的基因沉默技術(shù)(Virus Induced Gene Silencing，VIGS)是研究植物基因功能的一種重要方法，屬于轉(zhuǎn)錄后基因沉默的現(xiàn)象[1]。VIGS利用攜帶目的基因片段的重組病毒載體侵染植株，隨著病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄而特異性誘導(dǎo)序列同源基因mRNA降解或被甲基化等修飾，使植物內(nèi)源基因的表達(dá)受到抑制，引起植物表型或生理指標(biāo)的變化，進(jìn)而闡明目的基因的功能[2-5]。煙草脆裂病毒(Tobacco Rattle Virus，TRV)是目前應(yīng)用最廣泛的VIGS載體，TRV作為病毒載體有諸多優(yōu)點(diǎn)，如病毒癥狀較輕、沉默效率高且持久、各種組織均可產(chǎn)生沉默等，因而被廣泛應(yīng)用[6-10]。

類胡蘿卜素是一類重要的天然色素的總稱，常見的有胡蘿卜素、葉黃素等，是一種輔助色素主要吸收藍(lán)紫光，類胡蘿卜素能將吸收的光能傳遞給葉綠素a，是光合作用不可少的光合色素，同時也是形成植物花色和葉色重要色素成分[11]。在類胡蘿卜素代謝途徑中番茄紅素β-環(huán)化酶(Lycopene beta cyclase，LCYB)是調(diào)控胡蘿卜素合成的一個關(guān)鍵酶[12]。東方百合(Liliumorientalis)為多年生草本球根植物，花姿優(yōu)美伴有清香，是世界四大鮮切花之一[13-14]，具有十分重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，但對其葉色的調(diào)控尚未開展相關(guān)研究。本研究東方百合為試驗(yàn)材料，利用VIGS體系驗(yàn)證LoLcyB基因的功能，對深入開展東方百合葉色調(diào)控研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以東方百合‘Justina’為材料。試驗(yàn)材料在2017年5月種植于北京農(nóng)學(xué)院溫室中，光照為自然光，采用濕簾降溫加濕，白天室溫不高于30 ℃，夜間室溫不高于25 ℃。待種下的東方百合‘Justina’種球長出3～5片葉片時，取葉片為試驗(yàn)材料，用于后續(xù)總RNA的提取。植株生長30 d后進(jìn)行VIGS驗(yàn)證。VIGS驗(yàn)證采用農(nóng)桿菌菌株為GV3101和煙草脆裂病毒TRV。

1.2 LoLcyB 基因TRV載體構(gòu)建

本實(shí)驗(yàn)室前期通過百合轉(zhuǎn)錄組文庫分析得到LoLcyB基因CDS序列[15]，采用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，在引物前端加入EcoR I和BamH I的酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，定量驗(yàn)證TRV1和TRV2載體所需引物并根據(jù)TRV載體序列設(shè)計(jì)[16]，由北京六合華大基因科技有限公司合成(酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基用下劃線表示，見表1)。依照試驗(yàn)設(shè)計(jì)構(gòu)建pTRV2-LoLcyB重組載體，重組載體pTRV2-LoLcyB的示意圖見圖1。采用T4 DNA Ligase Buffer對目的片段和目標(biāo)載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)入EscherichiacoliDH5α培養(yǎng)，選取陽性克隆菌液進(jìn)行測序驗(yàn)證，并提取pTRV2-LoLcyB重組質(zhì)粒，進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證。

表1 引物序列Tab.1 The primer sequence

圖1 重組載體pTRV2-LoLcyB的示意圖Fig.1 Sketch map of pTRV2-LoLcyB recombinant vector

1.3 重組TRV載體侵染百合葉片

通過電擊轉(zhuǎn)化法，將pTRV1、pTRV2、重組質(zhì)粒pTRV2-LoLcyB轉(zhuǎn)至農(nóng)桿菌GV3101，涂在含有50 μg/mL卡那霉素、50 μg/mL利福平、50 μg/mL慶大霉素的LB固體培養(yǎng)基上，倒置培養(yǎng)48 h。分別挑取含有pTRV1、pTRV2、pTRV2-LoLcyB載體的農(nóng)桿菌單菌落，至2 mL含有50 μg/mL卡那霉素、50 μg/mL利福平、50 μg/mL慶大霉素的LB液體培養(yǎng)基，在28 ℃、200 r/min條件下過夜培養(yǎng)，取2 mL轉(zhuǎn)入20 mL新鮮LB液體培養(yǎng)基，繼續(xù)過夜培養(yǎng)。以LB液體培養(yǎng)基為對照，用分光光度計(jì)測量OD600值(OD600=0.6～0.8)，4 000 r/min離心15 min棄上清，加入滲透緩沖液重懸；將OD600值調(diào)至2.0，使含有pTRV1質(zhì)粒的菌液和含有pTRV2、pTRV2-LoLcyB質(zhì)粒的菌液分別按1∶1比例均勻混合；28 ℃靜置3 h，即獲得TRV空載體和TRV-LoLcyB載體菌液。采用切割侵染法對東方百合幼苗的葉片進(jìn)行侵染。用無菌試驗(yàn)手術(shù)刀分別蘸取已混合均勻的菌液，輕輕劃割百合葉片的上表皮，劃割傷口大小和多少可根據(jù)葉片進(jìn)行適量選擇，不蘸取菌液為對照組。被侵染的百合植株放置在白天25 ℃，晚上20 ℃，每天16 h光照的溫室中培養(yǎng)，每天做好觀測記錄，7 d后取樣。

1.4 色素含量測定

設(shè)置3個處理組，對照組(不侵染任何菌液的東方百合植株)、TRV空載體侵染組(用帶有TRV空載體菌液侵染的東方百合植株)和TRV-LoLcyB重組載體侵染組(用帶有TRV-LoLcyB載體菌液侵染的東方百合植株)。侵染7 d后，采集對照組、TRV空載體侵染組和TRV-LoLcyB重組載體侵染組侵染的百合葉片。采用分光光度法測定葉片的葉綠素a、葉綠素b、總類胡蘿卜素、胡蘿卜素、葉黃素的含量。充分研磨后，準(zhǔn)確稱取植物樣品0.30 g，迅速加入25 mL提取液(丙酮∶無水乙醇=1∶1)，充分吹打混勻，避光保存4 h。以提取液為空白對照，使用D30紫外分光光度計(jì)，測量470.0、474.0、485.0、642.5、649.0、665.0 nm波長下的吸光值[17]。設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)。通過以下公式計(jì)算葉綠體色素含量：

葉綠素a(mg/L)=9.99A(665)-0.0872A(642.5)

葉綠素b(mg/L)=17.7A(642.5)-3.04A(665)

總類胡蘿卜素(mg/L)=4.92A(474)-0.0255[a]-0.225[b]

胡蘿卜素(mg/L)=12.6A(485)-6.00A(470)-0.0298[a]+0.336[b]

葉黃素(mg/L)= 10.2A(470)-11.5A(485)-0.0036[a]-0.652[b]

葉綠素a及葉綠素b的質(zhì)量濃度用[a]、[b]表示。

葉綠素a(mg/g·FW)=葉綠素a(mg/L)×提取液總體積(L)/樣品鮮重(g)

葉綠素b(mg/g·FW)=葉綠素b(mg/L×提取液總體積(L)/樣品鮮重(g)

總類胡蘿卜素含量(mg/g·FW)=總類胡蘿卜素(mg/L)×提取液總體積(L)/樣品鮮重(g)

胡蘿卜素含量(mg/g·FW)=胡蘿卜素(mg/L)×提取液總體積(L)/樣品鮮重(g)

葉黃素含量(mg/g·FW)=葉黃素(mg/L)×提取液總體積(L)/樣品鮮重(g)

1.5 LoLcyB基因的qRT-PCR分析

侵染7 d后，采集對照組、TRV空載體侵染組和TRV-LoLcyB重組載體侵染組侵染的百合葉片。提取對照組、TRV空載體侵染組和TRV-LoLcyB重組載體侵染組侵染的百合葉片中RNA，測定對照組、TRV空載體侵染組和TRV-LoLcyB重組載體侵染組侵染的百合葉片中LoLcyB基因的相對表達(dá)量。設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)，每個重復(fù)3個單株。

1.6 數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)據(jù)采用Excel軟件進(jìn)行整理，利用SPSS17.0軟件的One-way ANOVA對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 pTRV2-LoLcyB重組載體的驗(yàn)證

將pTRV2-LoLcyB重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coli)DH5α后，提取陽性克隆菌液的質(zhì)粒，以陽性克隆質(zhì)粒為模板，使用TRV2-F和TRV2-R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(如圖2)，擴(kuò)增出目的條帶約為742 bp，符合重組載體的設(shè)計(jì)，281 bp片段是以TRV2空載體為模板擴(kuò)增出的條帶，重組載體插入LoLcyB基因片段大小為461 bp，證明pTRV2-LoLcyB重組載體構(gòu)建成功。

2.2 LoLcyB基因沉默對百合葉色的影響

取東方百合種球種后30 d的植株上三片葉為材料進(jìn)行侵染，侵染7 d后(圖3)，對照組葉片和TRV空載體侵染組的葉片未有明顯的白化或黃化現(xiàn)象，其中TRV空載體侵染組的葉片僅在刀口邊緣出現(xiàn)輕微黃化。而TRV-LoLcyB重組載體侵染組的葉片在刀口邊緣明顯黃化，并且沿著葉脈延伸，表明TRV-LoLcyB重組載體侵染組的葉片出現(xiàn)基因沉默。

注：281 bp條帶模板為TRV2空載體，742 bp條帶模板為pTRV2-LoLcyB重組載體。Note: The 281 bp allele is TRV2 empty vector, the 742 bp allele is pTRV2-LoLcyB recombinant vector.圖2 LoLcyB基因片段的重組載體驗(yàn)證Fig.2 The verification of LoLcyB gene fragment in recombinant vector

圖3 LoLcyB基因沉默對東方百合葉片顏色的影響Fig.3 The effect of LoLcyB gene silencing on leave color in L. orientalis ‘Justina’

2.3 LoLcyB基因沉默對葉片色素積累的影響

圖4顯示了不同東方百合葉片中各種色素的含量。侵染后葉片類胡蘿卜素含量：TRV-LoLcyB重組載體侵染組含量比對照組和TRV空載體侵染組分別減少了82.37%和80.47%(圖4A)；葉片胡蘿卜素含量：TRV-LoLcyB重組載體侵染組含量比對照組和TRV空載體侵染組分別減少了80.008%和77.487%(圖4B)；葉片葉黃素含量：TRV-LoLcyB重組載體侵染組含量比對照組和TRV空載體侵染組分別減少了70.69%和67.77%(圖4C)。利用SPSS17.0進(jìn)行鄧肯測驗(yàn)(在0.05水平)，表明TRV-LoLcyB重組載體侵染組的葉片中總類胡蘿卜素、胡蘿卜素和葉黃素的相對含量均明顯低于對照組葉片、TRV空載體侵染組的葉片中相對含量。而對照組葉片和TRV空載體侵染組的葉片中總類胡蘿卜素、胡蘿卜素和葉黃素的相對含量差異均不顯著。另外，葉綠素a、葉綠素b的含量發(fā)生和類胡蘿卜素相似的變化情況；TRV-LoLcyB重組載體侵染組的葉綠素a、葉綠素b含量比對照組和TRV空載體侵染組均有明顯下降。

圖4 LoLcyB基因沉默對東方百合葉片色素含量的影響Fig.4 The effect of LoLcyB gene silencing on the pigment contents in L. orientalis ‘Justina’ leaves

2.4 LoLcyB基因的qRT-PCR分析

試驗(yàn)分析對照組、TRV空載體侵染組和TRV-LoLcyB重組載體侵染組中百合葉片LoLcyB基因的相對表達(dá)量(圖5)。TRV-LoLcyB重組載體侵染組LoLcyB基因表達(dá)量比對照組和TRV空載體侵染組分別減少了71.44%和66.48%。TRV-LoLcyB重組載體侵染組的葉片LoLcyB基因的表達(dá)量明顯降低，而對照組葉片、TRV空載體侵染組的葉片LoLcyB基因的表達(dá)量并未出現(xiàn)較明顯變化。

圖5 東方百合葉片LoLcyB基因相對表達(dá)量Fig.5 The relative expression of LoLcyB gene in L. orientalis ‘Justina’ leaves

3 討 論

類胡蘿卜素代謝途徑是調(diào)控東方百合葉色變化的重要途徑，LoLcyB基因是類胡蘿卜素代謝途徑中的一個關(guān)鍵酶基因。前人研究表明，在類胡蘿卜素代謝途徑中，經(jīng)LcyB基因和LcyE基因翻譯得到的番茄紅素β-環(huán)化酶和番茄紅素ε-環(huán)化酶可以共同作用將番茄紅素環(huán)化為α-胡蘿卜素；番茄紅素β-環(huán)化酶也可單獨(dú)作用將番茄紅素環(huán)化為β-胡蘿卜素，這個分支反應(yīng)對植物體內(nèi)類胡蘿卜素的含量有決定性作用[18-19]。VIGS技術(shù)在基因功能方面的研究已十分廣泛，在植物的形態(tài)發(fā)育、信號傳導(dǎo)和代謝途徑等方面均有涉及，如植物程序性細(xì)胞死亡以及逆境應(yīng)激等，已是一種很普遍的研究基因功能的方法[20-21]。VIGS技術(shù)在百合等植物上的應(yīng)用正在不斷深入，并且在植物花色、葉片、果實(shí)代謝等方面相關(guān)基因功能的鑒定及分子育種上均有廣闊的應(yīng)用前景[22-23]。本試驗(yàn)通過VIGS技術(shù)，采用煙草脆裂病毒載體構(gòu)建了pTRV2-LoLcyB重組載體，利用切割侵染法對東方百合葉片進(jìn)行侵染，發(fā)現(xiàn)侵染后葉片中LoLcyB基因表達(dá)量顯著下調(diào)，即LoLcyB基因的沉默使番茄紅素向下合成胡蘿卜素途徑受到阻礙導(dǎo)致葉片類胡蘿卜素含量下降。LoLcyB基因參與東方百合葉片中類胡蘿卜素和葉綠素合成的代謝調(diào)控。

東方百合LoLcyB基因功能的研究為深入探究類胡蘿卜素的代謝途徑在呈色方面的作用機(jī)理提供理論參考，另外本研究通過分析葉片中葉綠素含量的變化，發(fā)現(xiàn)和類胡蘿卜素含量變化相同的情況，推測葉片中LoLcyB基因可能參與葉綠素代謝調(diào)控，對于其內(nèi)在調(diào)控機(jī)理還需進(jìn)一步研究。同時，VIGS體系在東方百合中的成功應(yīng)用，為今后研究東方百合基因功能研究開拓新思路。