高正銀, 孫文杰, 宋曉云, 胡 軾, 左開井

上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院, 上海 200240

棉花纖維是重要的天然紡織材料。棉花纖維是由棉花胚珠種皮細(xì)胞發(fā)育而來的單細(xì)胞結(jié)構(gòu)[1]。成熟的棉花纖維主要由纖維素(大于90%)組成，此外還有少量的非纖維素成分，例如：果膠、木聚糖、木質(zhì)素和木質(zhì)素類酚醛物質(zhì)[2,3]，其中，木質(zhì)素的合成過程影響了成熟纖維的品質(zhì)包括纖維的長度和強(qiáng)度等，其分子機(jī)理有待進(jìn)一步的研究。

過氧化物酶是一個(gè)重要的酶家族，廣泛存在于植物、動(dòng)物和微生物中，催化氧化還原反應(yīng)[4]。過氧化物酶分為三類：①第Ⅰ類過氧化物酶(Class Ⅲ Peroxidases，Class Ⅰ Prxs)為細(xì)胞內(nèi)過氧化物酶，包含抗壞血酸過氧化物酶、細(xì)胞色素C過氧化物酶以及過氧化氫酶?？箟难徇^氧化物酶存在于植物和酵母的葉綠體或細(xì)胞質(zhì)中，可以控制過氧化氫分子的濃度。細(xì)胞色素C過氧化物酶能夠與細(xì)胞色素C形成復(fù)合物，催化過氧化氫還原為水[5]。②第Ⅱ類過氧化物酶(Class Ⅱ Peroxidases，Class Ⅲ Prxs)包括木質(zhì)素酶和其他細(xì)胞外真菌過氧化物酶[6]。③第Ⅲ類過氧化物酶(Class Ⅲ Peroxidases，Class Ⅲ Prxs，secreted plant peroxidases)是植物特有的一個(gè)巨大的過氧化物酶家族，存在于植物細(xì)胞外空間或液泡中[7]。該類蛋白的三維結(jié)構(gòu)由大部分的α螺旋和小部分的β折疊組成，血紅素分子結(jié)合于近C端結(jié)構(gòu)域和N端結(jié)構(gòu)域之間的α螺旋上(圖1B)[8]。其蛋白序列存在高度保守的序列和不保守的可變序列，蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)中有4個(gè)高度保守的結(jié)構(gòu)域：血紅素結(jié)合位點(diǎn)、活性位點(diǎn)、底物結(jié)合位點(diǎn)和2個(gè)保守的鈣結(jié)合位點(diǎn)[9～12]。家族的所有成員共享一個(gè)血紅素假體基團(tuán)，以過氧化氫作為電子受體，催化一個(gè)多步驟氧化反應(yīng)，與過氧化氫解毒、生長素分解代謝、木質(zhì)素生物合成和應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

圖1 第Ⅲ類過氧化物酶基因和三維蛋白結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Gene and 3D protein structure of Class Ⅲ Peroxidases.A：第Ⅲ類過氧化物酶基因編碼序列經(jīng)典模式結(jié)構(gòu)示意圖；Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ 為3個(gè)高度保守的內(nèi)含子區(qū)域。B: 第Ⅲ類過氧化物酶基蛋白三維結(jié)構(gòu)示意圖；α螺旋和β折疊分別用藍(lán)色和紅色表示，血紅素分子(粉色)結(jié)合于N端結(jié)構(gòu)域和C端結(jié)構(gòu)域之間的α螺旋上，鈣原子用灰色球形表示。

第Ⅲ類過氧化物酶(Class Ⅲ Prxs)又稱為分泌性植物過氧化物酶，廣泛存在于植物各組織的細(xì)胞外空間或液泡中，參與過氧化氫解毒、生長素分解代謝、木質(zhì)素生物合成和應(yīng)激反應(yīng)等生理過程[13]， 然而參與這些生理過程的機(jī)理仍然未被解釋。在擬南芥基因組中有73個(gè)第Ⅲ類過氧化物酶被鑒定[7, 14]，大多數(shù)第Ⅲ類過氧化物酶基因廣泛在植物各組織中表達(dá)，目前擬南芥中只有3個(gè)基因被證實(shí)在根部特異性表達(dá)[15]。第Ⅲ類過氧化物酶木質(zhì)素是維管束植物細(xì)胞壁的主要成分，是一種復(fù)雜的芳香雜聚物，木質(zhì)素的聚合是通過第Ⅲ類過氧化物酶或漆酶催化的氧化偶聯(lián)過程，是一種新的單體與細(xì)胞壁中生長的聚合物(或低聚體)發(fā)生重復(fù)自由基偶聯(lián)而進(jìn)行的[16～18]。在煙草、擬南芥、白楊等植物中都有研究表明過氧化物酶參與催化木質(zhì)素的合成過程，不同的過氧化物酶在特定的器官、細(xì)胞和發(fā)育階段參與木質(zhì)素合成[19～21]。第Ⅲ類過氧化物酶能夠通過消耗或產(chǎn)生活性氧ROS參與多種抗逆過程，如重金屬脅迫、病原體入侵、臭氧過多、溫度脅迫、缺氧、磷酸鹽缺乏、硫缺乏和缺鉀等[22]。因此，過氧化物酶基因的表達(dá)依賴于多種不良的環(huán)境因素。研究表明，還有一些第Ⅲ類過氧化物酶通過氧化生長素以及產(chǎn)生·OH參與了植物生長過程。擬南芥中大多數(shù)第Ⅲ類過氧化物酶的編碼序列具有經(jīng)典模式結(jié)構(gòu)：包含有4個(gè)外顯子和3個(gè)完全保守的內(nèi)含子，目前在擬南芥基因組中有73個(gè)第Ⅲ類過氧化物酶被鑒定[7,14]，而只有3個(gè)基因被證實(shí)在根部特異性表達(dá)[15]，研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥AtPrx33和AtPrx34除了參與抗逆過程還參與了根的伸長[23]。在葡萄和西葫蘆中也發(fā)現(xiàn)第Ⅲ類過氧化物酶能夠調(diào)控IAA的含量進(jìn)而影響細(xì)胞的伸長[24,25]。

在棉花植株生長的過程中，第Ⅲ類過氧化物酶起到重要的功能。例如，抵抗病原體攻擊、耐鹽、參與植物激素和生物堿的代謝[26～28]。此外，在棉花纖維的伸長發(fā)育過程中，有多種細(xì)胞活動(dòng)需要第Ⅲ類過氧化物酶參與催化氧化還原反應(yīng)，例如細(xì)胞壁化合物的聚合[4,26,29,30]。在棉花纖維發(fā)育過程中特異高表達(dá)的第Ⅲ類過氧化物酶可能參與調(diào)控棉花纖維的起始、伸長以及次生壁合成等過程，尤為值得關(guān)注。有研究表明GhPOX1在快速伸長的纖維細(xì)胞中大量表達(dá)，qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)該基因在伸長的纖維細(xì)胞中的表達(dá)量是胚珠、花、根、莖和葉片中的400倍以上，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)也證明該基因確實(shí)參與調(diào)控棉花纖維的伸長過程[31]。

為了進(jìn)一步系統(tǒng)分析第Ⅲ類過氧化物酶在纖維伸長過程中的功能，鑒定與纖維發(fā)育有關(guān)的過氧化物酶基因，本研究擬通過生物信息學(xué)手段和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析對雷蒙德第Ⅲ類過氧化物酶家族基因進(jìn)行系統(tǒng)分類和表達(dá)分析，鑒定可能參與調(diào)控棉花纖維的起始、伸長以及次生壁合成等過程的關(guān)鍵基因，為進(jìn)一步探究第Ⅲ類過氧化物酶在棉花纖維發(fā)育過程中的功能提供參考依據(jù)。

1 材料方法

1.1 雷蒙德棉第Ⅲ類過氧化物酶基因確定和序列獲取

在Cottongen(https://www.cottongen.org/find/genes)棉花基因組數(shù)據(jù)庫，以peroxidase為關(guān)鍵詞搜索Gossypiumraimondii(D5) genome JGI assembly v2.0 (annot v2.1)數(shù)據(jù)庫，獲得候選序列301條。進(jìn)行序列比對、進(jìn)化樹構(gòu)建，蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測(http://cello.life.nctu.edu.tw/)[32,33]，以及保守域結(jié)構(gòu)分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Struc-ture/cdd/wrpsb.cgi)[34]，進(jìn)一步對第Ⅲ類過氧化物酶候選基因進(jìn)行確定。利用ExPASy (http://www.expasy.org/) 計(jì)算候選蛋白的等電點(diǎn)和分子量。

1.2 雷蒙德棉第Ⅲ類過氧化物酶基因結(jié)構(gòu)分析以及進(jìn)化樹構(gòu)建

利用 ClustalX 2.0進(jìn)行多重序列比對[35]，然后用MEGA 6.0 構(gòu)建Neighbor-joining (NJ) 進(jìn)化樹[36]。用Gene Structure Display (http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)[37]，對候選蛋白的CDS和基因組序列進(jìn)行分析，獲得其基因結(jié)構(gòu)。

1.3 雷蒙德棉第Ⅲ類過氧化物酶家族基因表達(dá)分析

從NCBI的SRA (https://www.ncbi.nlm.nih.gov)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選陸地棉TM-1不同組織(根、莖、葉和不同發(fā)育時(shí)期纖維0～25DPA)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)并下載SRP044705。對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，具體如下：①數(shù)據(jù)解壓：將數(shù)據(jù)從.sra格式轉(zhuǎn)化為.fastq格式；②數(shù)據(jù)剪切：剪切數(shù)據(jù)中低質(zhì)量部分，數(shù)據(jù)會(huì)壓縮；③建立棉花參考基因組的bowtie2的索引文件；④利用TopHat2 將RNA-Seq 數(shù)據(jù)進(jìn)行快速剪接映射到棉花基因組上；⑤利用HTSeq-count計(jì)算比對數(shù)；⑥計(jì)算所有基因組各個(gè)位點(diǎn)的rpkm值[38]。從所有rpkm值中提取候選基因的對應(yīng)值，繪制heatmap進(jìn)行分析。

1.4 第Ⅲ類過氧化物酶家族基因qRT-PCR分析

本研究所用棉花材料陸地棉品種冀棉14。引用Hasenfratz掛牌法，取開花期間不同時(shí)期(0、5 DPA、10 DPA、20 DPA、25 DPA) 的纖維材料迅速放于液氮中冷凍存儲(chǔ)。使用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(購自天根公司)提取棉花總RNA,將所得RNA于-70℃ 條件下凍存?zhèn)溆?。進(jìn)一步反轉(zhuǎn)錄獲得棉花纖維組織cDNA。

根據(jù)要定量分析的基因序列設(shè)計(jì)基因特異性引物(表1)。利用ubiquitin基因作為內(nèi)參，以△CT法對棉花纖維不同發(fā)育時(shí)期基因的表達(dá)水平進(jìn)行qRT-PCR分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 雷蒙德棉第Ⅲ類過氧化物酶家族蛋白的確定和聚類分析

在Cottongen(https://www.cottongen.org/find/genes)棉花基因組數(shù)據(jù)庫，以“peroxidase”為關(guān)鍵詞搜索Gossypiumraimondii(D5) genome JGI assembly v2.0 (annot v2.1)數(shù)據(jù)庫，獲得了301個(gè)棉花過氧化物酶家族候選蛋白序列，下載并進(jìn)行分析。利用NCBI conserved domain 工具對下載的蛋白序列進(jìn)行比對分析，選擇具有第Ⅲ類過氧化物酶保守結(jié)構(gòu)、血紅素結(jié)合位點(diǎn)、活性位點(diǎn)、底物結(jié)合位點(diǎn)和2個(gè)保守的鈣結(jié)合位點(diǎn)的蛋白，排除其他201個(gè)第Ⅰ類、第Ⅱ類過氧化物酶家族的蛋白，最終確認(rèn)雷蒙德棉花基因組中有90個(gè)第Ⅲ類過氧化物酶蛋白。所有的這90個(gè)蛋白具有第Ⅲ類過氧化物酶的典型特征，包含4個(gè)保守結(jié)構(gòu)域。用Neighbour-joining法對90個(gè)第Ⅲ類過氧化物酶蛋白進(jìn)行了進(jìn)化樹分析，根據(jù)聚類分析的結(jié)果將第Ⅲ類過氧化物酶蛋白分為8個(gè)亞類，每個(gè)亞類用不同的顏色加以區(qū)分如圖2，其中第Ⅳ亞類包含的蛋白數(shù)量最多。對90個(gè)蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測，發(fā)現(xiàn)這些蛋白分別定位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、胞外和周質(zhì)空間等(表2)。

表1 本研究所用的引物序列Table 1 Primers used in this investigation.

2.2 雷蒙德棉第Ⅲ類過氧化物酶家族蛋白的結(jié)構(gòu)和分類特征

本文對雷蒙德棉第Ⅲ類過氧化物酶家族基因的結(jié)構(gòu)分類和進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了分析。該家族總共有90個(gè)成員，分布于棉花的13條染色體上。參考擬南芥和水稻第Ⅲ類過氧化物酶基因結(jié)構(gòu)的分類方法，對雷蒙德棉第Ⅲ類過氧化物酶家族基因的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示該家族基因存在高度保守的序列和不保守的可變序列。其序列保守性主要表現(xiàn)在外顯子序列的高度保守和內(nèi)含子位點(diǎn)高度的保守(圖3)。

此外，在經(jīng)典的4個(gè)外顯子-3個(gè)內(nèi)含子模型的基礎(chǔ)上，內(nèi)含子的數(shù)量發(fā)生了缺失和增加。圖4為雷蒙德棉第Ⅲ類過氧化物酶基因結(jié)構(gòu)分類示意圖，黃色區(qū)域表示外顯子，對應(yīng)的數(shù)字表示外顯子序列長度范圍，黑色線段表示內(nèi)含子插入位點(diǎn)。在90個(gè)成員中有55個(gè)基因(占整個(gè)家族成員數(shù)量的61%)具有過氧化物酶基因典型的4個(gè)外顯子-3個(gè)內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)(圖4H,I)，這種結(jié)構(gòu)也廣泛存在于擬南芥和水稻中[7,14]，還有35個(gè)基因在4個(gè)外顯子-3個(gè)內(nèi)含子的模型上缺失或增加1～3個(gè)內(nèi)含子(圖4A～G,J,K)。

表2 雷蒙德棉第Ⅲ類過氧化物酶蛋白八個(gè)亞群保守域和亞細(xì)胞定位分析結(jié)果Table 2 The conserved domain and protein subcellular localization analysis of eight subgroup of Gossypium raimondii Class Ⅲ peroxidases.

續(xù)表 Continued亞群基因 ID基因名稱CDD Accession蛋白質(zhì)名稱可能的定位IVGorai.008G007700GrPrx45cd00693secretory_peroxidase周質(zhì)Gorai.008G007500GrPrx43cd00693secretory_peroxidase細(xì)胞質(zhì)Gorai.008G007600GrPrx44cd00693secretory_peroxidase細(xì)胞質(zhì)Gorai.006G074900GrPrx28cd00693secretory_peroxidase細(xì)胞質(zhì)Gorai.011G184600GrPrx73cd00693secretory_peroxidase周質(zhì)Gorai.011G184500GrPrx72cd00693secretory_peroxidase周質(zhì)Gorai.008G172200GrPrx49cd00693secretory_peroxidase周質(zhì)Gorai.005G150500GrPrx26cd00693secretory_peroxidase周質(zhì)Gorai.005G150600GrPrx27cd00693secretory_peroxidase周質(zhì)Gorai.013G099400GrPrx85cd00693secretory_peroxidase外膜Gorai.013G099600GrPrx87cd00693secretory_peroxidase外膜Gorai.013G099500GrPrx86cd00693secretory_peroxidase外膜Gorai.009G017700GrPrx55cd00693secretory_peroxidase周質(zhì)Gorai.002G208800GrPrx9cd00693secretory_peroxidase細(xì)胞質(zhì)Gorai.012G046400GrPrx79cd00693secretory_peroxidase周質(zhì)Gorai.008G264300GrPrx52cd00693secretory_peroxidase周質(zhì)Gorai.004G049000GrPrx13cd00693secretory_peroxidase周質(zhì)Gorai.004G049200GrPrx15cd00693secretory_peroxidase周質(zhì)Gorai.004G049100GrPrx14cd00693secretory_peroxidase周質(zhì)Gorai.009G064700GrPrx56cd00693secretory_peroxidase周質(zhì)Gorai.001G039200GrPrx2cd00693secretory_peroxidase外膜Gorai.008G281600GrPrx53cd00693secretory_peroxidase周質(zhì)Gorai.003G006600GrPrx10cd00693secretory_peroxidase周質(zhì)Gorai.010G001900GrPrx65cd00693secretory_peroxidase周質(zhì)Gorai.009G192200GrPrx60cd00693secretory_peroxidase周質(zhì)VGorai.010G131800GrPrx67cd00693secretory_peroxidase周質(zhì)Gorai.005G077600GrPrx23cd00693secretory_peroxidase外膜Gorai.008G090200GrPrx48cd00693secretory_peroxidase周質(zhì)Gorai.007G234600GrPrx40cd00693secretory_peroxidase細(xì)胞質(zhì)VIGorai.007G065200GrPrx37cd00693secretory_peroxidase細(xì)胞質(zhì)Gorai.007G049900GrPrx36cd00693secretory_peroxidase細(xì)胞質(zhì)Gorai.007G070800GrPrx38cd00693secretory_peroxidase細(xì)胞質(zhì)Gorai.007G199700GrPrx39cd00693secretory_peroxidase細(xì)胞質(zhì)Gorai.009G198700GrPrx61cd00693secretory_peroxidase周質(zhì)Gorai.008G228500GrPrx51cd00693secretory_peroxidase周質(zhì)Gorai.005G068200GrPrx22cd00693secretory_peroxidase外膜Gorai.008G174200GrPrx50cd00693secretory_peroxidase周質(zhì)Gorai.005G149000GrPrx25cd00693secretory_peroxidase周質(zhì)Gorai.012G150400GrPrx83cd00693secretory_peroxidase外膜Gorai.008G073800GrPrx46cd00693secretory_peroxidase周質(zhì)Gorai.010G127400GrPrx66cd00693secretory_peroxidase周質(zhì)Gorai.004G093200GrPrx17cd00693secretory_peroxidase周質(zhì)Gorai.006G143400GrPrx29cd00693secretory_peroxidase細(xì)胞質(zhì)Gorai.007G238800GrPrx41cd00693secretory_peroxidase細(xì)胞質(zhì)Gorai.004G265900GrPrx21cd00693secretory_peroxidase周質(zhì)Gorai.004G093000GrPrx16cd00693secretory_peroxidase周質(zhì)Gorai.002G168400GrPrx8cd00693secretory_peroxidase外膜

續(xù)表 Continued亞群基因 ID基因名稱CDD Accession蛋白質(zhì)名稱可能的定位VIIGorai.N001200GrPrx88cd00693secretory_peroxidase外膜Gorai.006G234200GrPrx35cd00693secretory_peroxidase細(xì)胞質(zhì)Gorai.006G234100GrPrx34cd00693secretory_peroxidase細(xì)胞質(zhì)Gorai.N001400GrPrx90cd00693secretory_peroxidase外膜Gorai.N001300GrPrx89cd00693secretory_peroxidase外膜Gorai.006G233900GrPrx33cd00693secretory_peroxidase細(xì)胞質(zhì)Gorai.006G233800GrPrx32cd00693secretory_peroxidase細(xì)胞質(zhì)Gorai.011G129800GrPrx70cd00693secretory_peroxidase周質(zhì)ⅧGorai.011G211300GrPrx76cd00693secretory_peroxidase周質(zhì)Gorai.011G211100GrPrx75cd00693secretory_peroxidase周質(zhì)Gorai.011G211400GrPrx77cd00693secretory_peroxidase周質(zhì)Gorai.011G129900GrPrx71cd00693secretory_peroxidase周質(zhì)Gorai.004G234900GrPrx19cd00693secretory_peroxidase周質(zhì)Gorai.009G361800GrPrx63cd00693secretory_peroxidase周質(zhì)Gorai.003G151700GrPrx12cd00693secretory_peroxidase周質(zhì)Gorai.013G005800GrPrx84cd00693secretory_peroxidase外膜Gorai.012G016200GrPrx78cd00693secretory_peroxidase周質(zhì)Gorai.009G295200GrPrx62cd00693secretory_peroxidase周質(zhì)

圖2 雷蒙德棉第Ⅲ類過氧化物酶蛋白聚類分析Fig.2 Phylogenetic analysis of Gossypium raimondii Class Ⅲ peroxidases.

圖3 雷蒙德棉第Ⅲ類過氧化物酶基因結(jié)構(gòu)分析圖Fig.3 Gene structure analysis of Gossypium raimondii Class Ⅲ peroxidases.注：每個(gè)亞家族用不同的顏色加以區(qū)分，藍(lán)色區(qū)域表示5’和3’非編碼區(qū)，黃色區(qū)域表示外顯子，黑色線段表示內(nèi)含子。

圖4 雷蒙德棉第Ⅲ類過氧化物酶基因結(jié)構(gòu)分類示意圖Fig.4 Structure classification of Gossypium raimondii Class Ⅲ peroxidase genes.

2.3 第Ⅲ類過氧化物酶家族基因在棉花纖維發(fā)育過程中的表達(dá)模式分析

目前生產(chǎn)應(yīng)用的棉花均為AADD的四倍體棉花，為了分析第Ⅲ類過氧化物酶基因家族在纖維起始發(fā)育及伸長發(fā)育過程中的可能功能，因此本研究利用陸地棉TM-1轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對所有的第Ⅲ類過氧化物酶家族基因在纖維發(fā)育過程中的表達(dá)模式進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示第Ⅲ類過氧化物酶基因在纖維發(fā)育的不同階段表達(dá)的基因有所不同，具有3種不同的表達(dá)模式(圖5)，而它們的表達(dá)趨勢變化暗示它們參與不同的生化途徑，行使不同的功能。

進(jìn)一步對3種表達(dá)模式的代表性基因進(jìn)行組織時(shí)空表達(dá)模式分析，結(jié)果如圖6所示，表達(dá)模式一：該類過氧化物酶基因在棉纖維發(fā)育的起始階段表達(dá)量上調(diào)，如GrPrx21、GrPrx36、GrPrx57和GrPrx59等。這類基因的表達(dá)量在纖維起始階段0 DPA達(dá)到最高，進(jìn)入纖維伸長期后立即快速下降。表達(dá)模式二：該類過氧化物酶基因在棉纖維發(fā)育的伸長階段表達(dá)量持續(xù)顯著上升，然后隨著進(jìn)入次生壁合成期后表達(dá)量顯著降低，如GrPrx3、GrPrx32、GrPrx56和GrPrx61等基因，暗示其可能在棉花纖維的快速伸長期起到重要的作用。表達(dá)模式三：過氧化物酶基因在纖維快速伸長期結(jié)束進(jìn)入次生壁合成期后表達(dá)量迅速上升，如GrPrx11、GrPrx16、GrPrx66和GrPrx77等，這類基因可能在棉花纖維次生壁合成過程中起到重要的作用。

圖5 90個(gè)雷蒙德棉第Ⅲ類過氧化物酶家族基因在纖維(0 DPA、5 DPA、10 DPA、20 DPA、25DPA)中的表達(dá)模式Fig.5 The expression pattern of 90 Gossypium raimondii Class Ⅲ peroxidase genes in fiber(0 DPA、5 DPA、10 DPA、20 DPA、25DPA).注：紅色表示表達(dá)量較高，藍(lán)色表示表達(dá)量較低。

圖6 纖維發(fā)育過程中三種不同表達(dá)模式的雷蒙德棉第Ⅲ類過氧化物酶基因表達(dá)示例Fig.6 The illustration of three different expression pattern of Gossypium raimondii Class Ⅲ peroxidases genes during cotton fiber development.

為了進(jìn)一步驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析結(jié)果的可靠性，選取具有代表性的三種不同表達(dá)模式的基因分別進(jìn)行qRT-PCR分析。轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表明，GrPrx21、GrPrx3和GrPrx11分別屬于三種不同表達(dá)模式。如圖7所示，對三個(gè)不同表達(dá)模式的基因在纖維發(fā)育的0 DPA、5 DPA、10 DPA、20 DPA和25 DPA時(shí)期的基因表達(dá)水平進(jìn)行qRT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)：GrPrx21在纖維發(fā)育0 DPA時(shí)基因的表達(dá)量最高，進(jìn)入纖維伸長期后表達(dá)水平持續(xù)降低；GrPrx3基因的表達(dá)水平從0 DPA到25 DPA呈現(xiàn)先上升后下降的模式，在10 DPA表達(dá)水平達(dá)到最高；GrPrx11在0 DPA、5 DPA、10DPA基因的表達(dá)量很低，直到進(jìn)入次生壁合成階段(20～25 DPA)，其表達(dá)水平急速上升；上述qRT-PCR結(jié)果均與轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果相一致。

圖7 纖維發(fā)育過程中三種不同表達(dá)模式的第Ⅲ類過氧化物酶基因定量分析Fig.7 qRT-PCR analysis of three different expression pattern Gossypium raimondii Class Ⅲ peroxidases genes during cotton fiber development.A.GrPrx21基因; B.GrPrx3基因; C:GrPrx11基因。

3 討論

第Ⅲ類過氧化物酶作為重要的催化植物體內(nèi)各種氧化還原反應(yīng)的保護(hù)酶類家族參與調(diào)控植株生長、發(fā)育和抗逆等多種生化途徑。相關(guān)研究表明，過氧化物酶在棉花纖維的伸長過程中起到重要的調(diào)控作用，可能參與棉花雄性生殖過程以及響應(yīng)抗病等過程。例如：GhPOX1在快速伸長的纖維細(xì)胞中大量表達(dá)，參與了棉花纖維的發(fā)育過程，qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)該基因在伸長的纖維細(xì)胞中的表達(dá)量是胚珠、花、根、莖和葉片中的400倍以上[31]。Ghpod(cDNA GenBank Accession Number: EU196676)在棉花的花器官中特異表達(dá)，可能參與棉花雄性生殖過程[39]。在大麗輪枝菌侵染棉花植株后，一些第Ⅲ類過氧化物酶基因響應(yīng)并且表達(dá)量發(fā)生了變化[40]。

擬南芥、水稻、玉米、楊樹、梨和二穗短柄草全基因組的第Ⅲ類過氧化物酶已經(jīng)被鑒定[7,14,41～44]。在棉花中關(guān)于第Ⅲ類過氧化物酶的研究比較少，因此系統(tǒng)全面的研究棉花中的第Ⅲ類過氧化物酶具有重要的意義。本文通過對已經(jīng)注釋的雷蒙德棉基因組進(jìn)行搜索，鑒定得到了90個(gè)雷蒙德棉第Ⅲ類過氧化物酶基因。對所有的第Ⅲ類過氧化物酶蛋白及其CDS序列進(jìn)行同源比對、構(gòu)建進(jìn)化樹，整合已有的擬南芥過氧化物酶功能研究結(jié)果，將90個(gè)過氧化物酶蛋白分為8個(gè)亞家族。進(jìn)化樹分析結(jié)果表明第Ⅲ類過氧化物酶蛋白序列是相對保守的，暗示同一亞家族的基因可能在植株生長、發(fā)育和抗逆過程中承擔(dān)相同或相似的功能。進(jìn)一步的基因結(jié)構(gòu)分析顯示雷蒙德棉第Ⅲ類過氧化物酶基因結(jié)構(gòu)、位點(diǎn)都相對保守，雷蒙德棉大多數(shù)(61%)的第Ⅲ類過氧化物酶保留了經(jīng)典的第Ⅲ類過氧化物酶的基因結(jié)構(gòu)。此外，蒙德棉第Ⅲ類過氧化物酶基因的結(jié)構(gòu)存在一定的多樣性，90個(gè)雷蒙德棉第Ⅲ類過氧化物酶成員基因的內(nèi)含子數(shù)目有0～4個(gè)不等，大多數(shù)的基因包含2個(gè)及以上的內(nèi)含子，說明雷蒙德棉第Ⅲ類過氧化物酶基因家族存在一定的多樣性。雷蒙德棉第Ⅲ類過氧化物酶在不同亞家族之間也存在這些特征的差異表現(xiàn)，說明雷蒙德棉第Ⅲ類過氧化物酶亞家族成員在功能上是多樣化的。在每個(gè)亞家族中存在其特定的保守序列，各成員在此保守序列的基礎(chǔ)上插入或缺失內(nèi)含子增加了亞家族成員的序列和功能多樣性。

基因的表達(dá)模式可以為有關(guān)基因的功能研究提供重要的線索。本研究通過結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和qRT-PCR分析來研究第Ⅲ類過氧化物酶基因的表達(dá)模式。分析發(fā)現(xiàn)，許多第Ⅲ類過氧化物酶基因在不同組織和纖維發(fā)育的過程中呈現(xiàn)特異性的沉默或特異性高表達(dá)，暗示這些基因在棉花植株和纖維發(fā)育過程中承擔(dān)相應(yīng)的功能。進(jìn)一步對在纖維發(fā)育過程中棉花第Ⅲ類過氧化物酶的表達(dá)水平進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了3種不同表達(dá)模式的基因，在纖維發(fā)育過程中不同階段有特異的基因表達(dá)，表明在纖維發(fā)育的起始期、伸長期以及次生壁合成階段分別有不同的第Ⅲ類過氧化物酶行使相應(yīng)的功能，為進(jìn)一步探究第Ⅲ類過氧化物酶在纖維發(fā)育過程中的功能提供依據(jù)。

本研究對雷蒙德棉第Ⅲ類過氧化物酶家族成員的進(jìn)化起源、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，并對纖維發(fā)育不同階段第Ⅲ類過氧化物酶基因的時(shí)空表達(dá)模式進(jìn)行了檢測。研究結(jié)果為進(jìn)一步了解第Ⅲ類過氧化物酶基因家族的進(jìn)化和每個(gè)第Ⅲ類過氧化物酶基因在纖維發(fā)育過程中的潛在功能提供了一個(gè)有用的參考。由于迄今為止，棉花中只有少數(shù)第Ⅲ類過氧化物酶基因明確了功能特征，本研究結(jié)果有助于進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能，并應(yīng)用于纖維品質(zhì)改良和生產(chǎn)。