N-乙酰半胱氨酸與磷霉素聯(lián)用對(duì)幾種下呼吸道感染病原菌的體外抑制作用研究

金晶 張立佳 席薇 鄭雨捷 孫慎俠

（大連大學(xué)醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)系， 大連 116622）

近年流行學(xué)調(diào)查研究結(jié)果表明，下呼吸道感染是呼吸系統(tǒng)常見病之一，其常見病原菌以革蘭陰性菌居多，其次是革蘭陽性菌，革蘭陰性菌主要有銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌和鮑曼不動(dòng)桿菌，革蘭陽性菌主要有金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎鏈球菌[1,2]等。近年來由于抗菌藥物廣泛使用，細(xì)菌耐藥性在不斷升高，尤其是泛耐藥菌株的出現(xiàn)，給臨床治療帶來很大困難[3]。如果兩種藥物存在協(xié)同和累加作用，在臨床使用過程中，不僅降低了藥物的使用劑量，同時(shí)可以減緩或減少耐藥性的產(chǎn)生，減少藥物的毒副作用。

N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysyeine，NAC)作為一種黏液溶解劑多年來應(yīng)用于治療各種呼吸系統(tǒng)疾病。磷霉素作為一種較早發(fā)現(xiàn)的天然抗生素，雖然抑菌效果不及頭孢菌素類抗生素，但與其它抗生素的作用機(jī)制不同，且與其他抗菌藥無交叉耐藥性，同時(shí)具有減輕其他抗生素對(duì)肝、腎和神經(jīng)系統(tǒng)的毒性、提高機(jī)體免疫機(jī)能[4]等作用，正逐漸受到臨床的關(guān)注。

本研究選用引起下呼吸道感染的常見病原菌為供試菌，NAC和磷霉素為供試材料，從體外藥敏試驗(yàn)方面觀察NAC與磷霉素聯(lián)用對(duì)常見下呼吸道病原菌的抑制作用，如果兩種藥物能夠聯(lián)合使用，將為臨床上治療由病原菌引起的下呼吸道感染提供一條有效途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureusATCC29213)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidisATCC12228)、乙型溶血性鏈球菌(Streptococcus hemolytic-βATCC19615)、肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniaeATCC49619)、大腸埃希菌(Escherichia coliATCC35218)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniaeATCC700603)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosaATCC27853)由大連大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)研究中心提供，鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacter baumannii多重耐藥，購(gòu)自溫州康泰生物科技有限公司)。NAC、磷霉素購(gòu)自大連天美生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 藥液的配制和藥敏紙片的制備

參考文獻(xiàn)[5]配制藥液，NAC儲(chǔ)存液濃度為100mg/mL，磷霉素鈉儲(chǔ)存液濃度為10mg/mL，參考文獻(xiàn)[6]制備藥敏紙片，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 NAC、磷霉素單藥抑菌效果觀察

K-B法測(cè)定磷霉素鈉和NAC溶液對(duì)供試菌的抑菌圈直徑，參考文獻(xiàn)[6]，重復(fù)3次。MIC測(cè)定采用試管有限稀釋法，參考文獻(xiàn)[7]，重復(fù)2次。

1.2.3 NAC與磷霉素聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果觀察

1.2.3.1 紙片擴(kuò)散法初步觀察兩種藥物聯(lián)用抑菌作用

參考CLSI的紙片瓊脂擴(kuò)散法，略有改進(jìn)。營(yíng)養(yǎng)要求較低的供試菌用MH平板，營(yíng)養(yǎng)要求高的供試菌采用MH平板(含5%小牛血清)。兩紙片中心距離為兩藥敏紙片單獨(dú)藥敏實(shí)驗(yàn)時(shí)的抑菌環(huán)半徑之和，置37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育18～24h后，觀察結(jié)果，重復(fù)2次。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)兩藥抑菌圈交界處的夾角，初步判斷是否存在累加或協(xié)同作用。如果兩藥抑菌圈交界處的夾角是平直或一種藥物抑菌圈向另一種藥物擴(kuò)大，初步判定為兩藥存在協(xié)同作用，如果兩種藥物抑菌圈交界處的交角為鈍角，初步判定為存在累加作用。

1.2.3.2 棋盤法初步觀察兩種藥物聯(lián)用抑菌作用

采用棋盤微量稀釋法[8]觀察供試菌的聯(lián)合用藥情況，重復(fù)兩次。

2 結(jié)果

2.1 K-B法抑菌作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果

K-B法測(cè)定單藥的抑菌圈直徑(mm)。結(jié)果見表1。

由表1可以看出，NAC對(duì)供試菌均具有較好的抑菌效果，磷霉素鈉對(duì)肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌的抑菌效果較差，但對(duì)金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎鏈球菌表現(xiàn)較強(qiáng)的抑菌效果。

表1 磷霉素鈉及NAC對(duì)供試菌的抑菌環(huán)直徑(X±S)(mm)

2.2 試管有限稀釋法測(cè)定MIC結(jié)果

由表2可以看出，磷霉素鈉對(duì)金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌均具有較好的抑菌作用；但對(duì)肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌抑菌效果較差，表明磷霉素對(duì)不同的呼吸道感染病原菌抑菌效果差異很大。

表2 磷霉素鈉及NAC對(duì)供試菌的MIC結(jié)果(mg/mL)

2.3 K-B法聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果

K-B法結(jié)果表明NAC與磷霉素聯(lián)用對(duì)金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、肺炎鏈球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌可能存在累加或協(xié)同作用。部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。

2.4 棋盤聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果

通過棋盤法聯(lián)合藥敏實(shí)驗(yàn)觀察，NAC和磷霉素鈉聯(lián)合用藥對(duì)金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、銅綠假單胞菌的FIC指數(shù)分別為0.19、0.325、0.43 、0.125、0.42、0.33，均小于0.5，表現(xiàn)為協(xié)同作用。

3 討論

近年來,由于抗生素不規(guī)范使用和濫用現(xiàn)象日益增多，加速了臨床抗生素使用壽命降低和細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生[9]，因此抗菌藥物合理使用是解決細(xì)菌耐藥問題的關(guān)鍵之一。本研究發(fā)現(xiàn)作為化痰藥的NAC，具有很好的抑菌效果[5]，在探索其與臨床抗生素聯(lián)合應(yīng)用的過程中，發(fā)現(xiàn)NAC與磷霉素可能存在協(xié)同作用，體外聯(lián)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，兩藥聯(lián)合使用存在協(xié)同作用，為開創(chuàng)多途徑治療呼吸系統(tǒng)疾病提供依據(jù)。

在研究NAC與抗生素聯(lián)用的過程中，我們發(fā)現(xiàn)NAC與環(huán)丙沙星、磷霉素、頭孢曲松具有很好的協(xié)同作用，與趙鐵梅等[10]做的環(huán)丙沙星與NAC的聯(lián)合作用相一致。NAC與頭孢曲松協(xié)同作用非常明顯，但棋盤稀釋法實(shí)驗(yàn)過程中，出現(xiàn)了異常現(xiàn)象，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，兩藥高濃度混合，出現(xiàn)白色混濁的化學(xué)反應(yīng)，因此推斷頭孢曲松鈉與NAC存在配伍禁忌，臨床使用過程中，要注意間隔用藥。因此本實(shí)驗(yàn)先用NAC與磷霉素聯(lián)合用藥，雖然在臨床上磷霉素不如頭孢菌素類藥物抑菌效果好，但其不易與其他藥物產(chǎn)生交叉耐藥性，且體內(nèi)作用較體外作用強(qiáng)，我們將NAC和磷霉素聯(lián)用，初步探究?jī)烧叽嬖诘膮f(xié)同抑菌作用，因此在治療深部感染及難治性嚴(yán)重感染方面應(yīng)具有廣闊的應(yīng)用前景。

在實(shí)驗(yàn)過程中，K-B法結(jié)果表明NAC對(duì)乙型溶血性鏈球菌和肺炎鏈球菌具有較好的抑菌作用，但MIC結(jié)果與K-B法結(jié)果不一致，考慮原因可能是NAC抑菌效果受有機(jī)物干擾，該現(xiàn)象與鄒玉明等[5]結(jié)果是一致的。

此外，本研究供試菌株為幾種能引起呼吸道感染的病原菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株，旨在探討兩藥聯(lián)合是否存在協(xié)同或相加作用，如拓展其在臨床的進(jìn)一步應(yīng)用，還需要大量的臨床實(shí)驗(yàn)來證明，該項(xiàng)工作有待于進(jìn)一步地研究。

致謝:

感謝遲慶老師在專業(yè)知識(shí)的分析和創(chuàng)新意識(shí)的培養(yǎng)方面的培養(yǎng)，謝謝遲老師在實(shí)驗(yàn)過程中給予的悉心指導(dǎo)。感謝這篇論文所涉及的學(xué)者，感謝他們研究成果的幫助和啟發(fā)。

圖1 兩藥聯(lián)合的抑菌作用