趙 冰,黃 紅,王聞卿,李彩云,崔琪奇,朱林英

空腸彎曲菌(Campylobacter.jejuni)是世界上引起感染性腹瀉最常見的病原體之一[1]。人群中各個年齡段均易感[2]。在歐美發(fā)達國家,感染性腹瀉中的彎曲菌占很高比例[3-6]。空腸彎曲菌某些菌株能引起一些嚴重并發(fā)癥,例如吉蘭巴雷綜合征[7-8]。

菌株的分子分型對解釋傳染病的流行至關(guān)重要。傳統(tǒng)表型分型方法如血清分型以及生物分型分辨率不足。目前主流的分子分型方法如脈沖場凝膠電泳(PFGE)在短期暴發(fā)監(jiān)測中顯示了很強分辨率,但是在長期監(jiān)測中,對于遺傳關(guān)系的分析能力不足?；谛蛄蟹治鰹榛A(chǔ)的多位點序列分型(MLST)能夠靈敏地發(fā)現(xiàn)因種內(nèi)和種間頻繁的水平基因交換引起的遺傳多樣性,其方法簡單,結(jié)果能在國際實驗室間比對,共享性好。其技術(shù)原理是對細菌的數(shù)個管家基因序列進行測序,數(shù)據(jù)庫將管家基因序列進行識別和組裝,生成序列型(Sequence Type,ST),應(yīng)用生物信息分析軟件分析序列型。Dingle等人建立了空腸彎曲菌的MLST方案[9],并建立了成熟共享數(shù)據(jù)庫,該技術(shù)應(yīng)用于空腸彎曲菌株間比對、溯源分析、遺傳進化分析[10-11]。

1 材料與方法

1.1 菌株的來源

1.1.1 人源株 選取浦東新區(qū)11家醫(yī)療機構(gòu)作為監(jiān)測點,依據(jù)系統(tǒng)抽樣原則,采集急性感染性腹瀉病人糞便標本,2014年共采集1 846件,2015年共采集2 100件。采集的糞便拭子標本接種Karmali瓊脂,42℃微需氧培養(yǎng)48 h,可疑菌株進行氧化酶、過氧化氫酶、馬尿酸水解試驗進行篩選,符合者再用熒光PCR試劑盒鑒定,通過分離共獲得144株空腸彎曲菌,其中2014年分離到70株,2015年分離到74株。1.1.2 禽源株 利用浦東新區(qū)設(shè)置的禽流感監(jiān)測點,2014-2015年共采集樣本1 345件,樣本主要類型有禽類泄殖腔、禽類糞便、禽舍籠具、養(yǎng)殖場地面、污水等,檢測方法同1.1.1,通過分離共獲得56株空腸彎曲菌。

1.1.3 食品株 選取腹瀉病原譜監(jiān)測點附近的超市、農(nóng)貿(mào)市場,采集禽畜肉、豬內(nèi)臟共252件。采集的食品取25 g剪碎后,加入100 mL TSB增菌液,混勻后取上清液50 mL,10 000r/min離心,取沉淀接種karmali瓊脂,以下過程同1.1.1,通過分離共獲得9株空腸彎曲菌。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 主要儀器 PCR儀(AB9700)、Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)(GEL DPC)

1.2.2 主要試劑 PCR擴增試劑盒購自上海生工,DNA marker購自于大連寶生物,管家基因擴增引物由Invitrogen公司合成,10XTBE緩沖液購自于伯樂,瓊脂糖購自于上海生工,細菌基因組DNA提取試劑盒購自于北京天根生物科技公司,微需養(yǎng)產(chǎn)氣袋購自于Thermo Fisher,空腸彎曲菌雙色熒光pcr試劑盒購自于碩世生物科技有限公司。

1.3 管家基因位點選擇 根據(jù)彎曲MLST數(shù)據(jù)庫方案(http://pubmlst.org/campylobacter)確定空腸彎曲菌的7個管家基因:asp A、gln A、glt A、gly A、pgm、tkt、unc A。

1.4 管家基因擴增 挑取少許菌落,用商品化細菌基因組DNA試劑盒提取。反應(yīng)程序為94℃變性30 s,50℃(unc A),55℃(asp A,glt A,gly A,pgm,tkt),60℃(gln A)退火30 s,72℃延伸60 s,共35個循環(huán)。擴增序列見表1。

1.5 測序 取PCR產(chǎn)物委托上海奕躍生物技術(shù)公司進行sanger一代雙向測序。測序序列見表1。

1.6 數(shù)據(jù)處理與分析 將測序拼接后管家基因序列提交至 MLST數(shù)據(jù)庫 (http://pubmlst.org/campylobacter),獲得7個管家基因號,整合后確定ST型和CC。應(yīng)用BioNumerics 7.1進行比對分析。

表1 管家基因擴增與測序引物Tab.1 Primers for amplification and sequencing of housekeeping genes

2 結(jié) 果

2.1 MLST測序結(jié)果 所有209株空腸彎曲菌共獲得110種序列型,歸屬25種同源復(fù)合體。歸屬ST-21同源復(fù)合體菌株最多,共計31株,占比為14.8%(31/209),其中人源株占比9.7%(14/144),禽類養(yǎng)殖環(huán)境株占比30.4%(17/56);歸屬ST-353同源復(fù)合體共計28株,占比為13.4%(28/209),其中人源株占比16.7%(24/144),禽類養(yǎng)殖環(huán)境株占比7.1%(4/56);歸屬ST-464同源復(fù)合體共計25株,占比為11.9%(25/209),其中人源株占比10.4%(15/144),禽類養(yǎng)殖場環(huán)境株占比17.9%(10/56);無法歸屬同源復(fù)合體共42株,占比為20.1%(42/209),其中人源株占比20.1%(29/144),禽源株占比16.1(9/56),食品株占比44.4%(4/9)。人源株和養(yǎng)殖場環(huán)境株在主要流行種群種類上相似,僅僅在結(jié)構(gòu)數(shù)量上有區(qū)別,見表2。

表2 不同來源菌株同源復(fù)合體所占比例Tab.2 The rate of isolates from different source belonging to various complex

2.2 MLST進化分析 用BioNumerics7.1繪制Neighbor Joining遺傳進化樹圖,見圖1,樹狀圖中清晰地展示菌株進化關(guān)系,圖中綠色代表2014年人源株,紅色代表2015年人源株,紫色代表禽類養(yǎng)殖環(huán)境株,黃色代表食品株。遺傳進化分析圖上我們總結(jié)成了5個主要聚類簇,聚類簇1是以ST45序列型為核心組成的ST-45CC,其規(guī)模較小,主要集中了來自腹瀉病人的菌株。聚類簇2是ST-50型為核心,ST-50隸屬于ST-21CC,是起源株ST-21型發(fā)展而來,監(jiān)測數(shù)據(jù)中僅僅只有一株ST-21來自于腹瀉病人,ST50均為養(yǎng)殖環(huán)境株,人源株中未發(fā)現(xiàn)。圖1中央的包圍著ST-464形成了最大的一個聚類簇3,以ST-464起源命名的ST-464CC成為了最大的同源復(fù)合體。第4個聚類簇包含ST-354CC和ST-52CC,其規(guī)模較小,ST型多樣性,以人源株為主。第5個聚類簇是以ST-5為核心,其歸屬的ST-353CC該復(fù)合體也是全球和國內(nèi)流行的序列型,在本次研究的樣本中,主要來自于腹瀉病人。食品株均呈散在分布,與禽源和人源株關(guān)系較遠。

圖1 209株空腸彎曲菌遺傳進化樹Fig.1 Dendrogram of genetic relationships among 209 strains

3 討 論

空腸彎曲菌已經(jīng)成為本地區(qū)主要的腹瀉病原體,但是過去一直缺乏簡便、分型能力強的方法,故無法對菌株進行更深層次的分析,MLST方法的應(yīng)用,解決了難以分子分型的問題。MLST技術(shù)體現(xiàn)了高分辨率、分析能力強、共享性好的特點,在空腸彎曲菌分子分型中具有非常強的適用性。今后,可推廣成為多種致病菌來源、傳播途徑、進化分析、暴發(fā)識別的工具[9]。

本研究通過對209株不同來源的空腸彎曲菌進行MLST分析,得到了多種STs,雖然STs種類繁多,但是其中也具有較高的重復(fù)頻率,揭示了比較親密的遺傳關(guān)系。144株人源株分型結(jié)果顯示,本轄區(qū)人源株呈多樣性,從流行上分析,存在相對優(yōu)勢的同源復(fù)合體,2014年的最優(yōu)勢群體為ST-353CC(25.7%),2015年的最優(yōu)勢同源復(fù)合體轉(zhuǎn)變?yōu)镾T-21CC(14.6%),兩年的其他同源復(fù)合體分布呈多樣性,種類也較為相似,但結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。

從禽類養(yǎng)殖場所的環(huán)節(jié)陽性株分析結(jié)果看,ST-50檢出頻次最高的序列型,ST-50所屬的ST-21CC在華東地區(qū)禽類監(jiān)測中普遍存在[12],而且在發(fā)達國家養(yǎng)殖業(yè)中也普遍流行[13-15],本轄區(qū)兩年的監(jiān)測數(shù)據(jù)并沒有在腹瀉病人中發(fā)現(xiàn)ST-50序列型的蹤跡。從圖1進化關(guān)系中可以發(fā)現(xiàn)大多數(shù)所屬ST-21CC的人源ST型與ST-50有很近進化關(guān)系,有可能ST-50從禽類遷徙到人群以及人群間傳播過程中變異分化,本次研究由于數(shù)據(jù)有限,進化趨勢特征需要多年監(jiān)測才能得到正確的判斷。ST-464是國內(nèi)最為流行的序列型,本次研究共檢出12株,禽糞便和腹瀉病人中均能發(fā)現(xiàn),其所屬的ST464CC,其家族更大,共有25株,占比為12.0%,在禽類糞便、養(yǎng)殖環(huán)節(jié)、腹瀉病人均有分布,這些數(shù)據(jù)揭示了本轄區(qū)人感染空腸彎曲菌與禽類關(guān)系非常密切。ST353CC也是全球和國內(nèi)流行的克隆群[16],在本次研究的樣本中,主要來自于腹瀉病人,本研究沒有對外來的禽類進行大樣本量的分析,所以無法判斷是外源輸入還是本地流行。

本次研究食品株有44.4%(4/9)序列型無同源復(fù)合體歸屬,其主要原因本次研究的食品樣品數(shù)量和種類的相對缺乏,從食品中主要分離到的是與本研究無關(guān)結(jié)腸彎曲菌,共48株,而目標菌空腸彎曲菌僅僅9株,遺傳背景信息太少,無法反映食品株和人源株以及禽類養(yǎng)殖環(huán)境株的關(guān)系,也是本研究的一個遺憾之處。

本研究對菌株的序列型以及相互關(guān)系進行描述性分析,無法準確推測總體,僅能提出假設(shè),若要推測群體間的確切的遺傳關(guān)系,下一步的重點工作需要進一步持續(xù)地對不同來源的菌株分子信息進行積累,應(yīng)用分子信息模型工具量化分析不同群體間的遺傳關(guān)系遠近,并進行歸因分析,確切地鎖定最可能的危害因素,為控制該病原提供客觀的依據(jù)。

綜上所述,本地區(qū)的空腸彎曲菌感染以散發(fā)為主,序列型呈多樣性,種群結(jié)構(gòu)相對穩(wěn)定,禽源株的與人源株存在密切的關(guān)系,主要的流行群在本轄區(qū)相對穩(wěn)定存在。研究結(jié)果提示我們,加強禽類養(yǎng)殖、運輸、加工的管理,持續(xù)對空腸彎曲菌的動態(tài)監(jiān)測是控制和降低人群彎曲菌感染的重要途徑。

利益沖突:無

引用本文格式:趙冰,黃紅,王聞卿,等.209株不同來源空腸彎曲菌分子特征分析[J].中國人獸共患病學(xué)報,2019,35(9):865-869,874.DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2019.00.095