周立斌，龍慧民

(寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院泌尿外科，浙江寧波 315040)

腎癌(renal cell carcinoma，RCC)是最常見的腎臟惡性腫瘤，透明細(xì)胞腎癌 (clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)占所有RCC的80%。隨著手術(shù)水平的不斷進(jìn)步及對(duì)腎癌的分子生物學(xué)和基因組學(xué)的深入研究，腎癌患者生存時(shí)間顯著延長，患者生活質(zhì)量明顯提高[1]。然而，90%腎癌導(dǎo)致的死亡與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。雖然有不同的腎癌診斷和預(yù)后模型，但由于缺乏特異性和敏感性，其臨床使用價(jià)值非常有限[2]。因此，深入研究ccRCC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制將有利于發(fā)現(xiàn)診斷和預(yù)后的標(biāo)志物及開發(fā)新的分子靶向藥物。

癌癥相關(guān)數(shù)據(jù)的挖掘已在泌尿腫瘤中廣泛應(yīng)用，為深入研究腎癌的發(fā)病機(jī)制提供了重要的線索[3-4]。本研究將充分利用Oncomine數(shù)據(jù)庫資源，分析烯醇化酶2(enolase 2，ENO2)在ccRCC中的表達(dá)情況及其與ccRCC的臨床分期、分級(jí)及預(yù)后的關(guān)系，為進(jìn)一步研究ENO2在ccRCC中發(fā)生發(fā)展的分子作用機(jī)制提供線索和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料Oncomine數(shù)據(jù)庫(https://www.oncomine.org)中根據(jù)作者需求設(shè)定篩選和挖掘數(shù)據(jù)的條件。本研究中，①“Gene：ENO2”；②“Cancer Type：Clear Cell Renal Cell Carcinoma”；③“Analysis Type：Cancervs.Normal Analysis”；④臨界值設(shè)定條件(Pvalue<1E-4，fold change>2，gene rank=top 10%)作為篩選差異表達(dá)的條件。共篩選出腎透明細(xì)胞癌與正常腎組織的基因表達(dá)譜數(shù)據(jù)(6項(xiàng)研究7個(gè)子數(shù)據(jù)集)，ENO2在腎透明細(xì)胞癌組織和正常組織中存在顯著差異。然后我們?cè)谥昂Y選的基礎(chǔ)上，選擇“Clinical Outcome：Survival Status”進(jìn)行進(jìn)一步篩選，最后根據(jù)Group By的下拉菜單選擇我們需要分析的腎透明細(xì)胞癌臨床因素，包括T分期、N分期、M分期、TNM總分期、5年生存時(shí)間。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法由于Oncomine數(shù)據(jù)庫非免費(fèi)，我們先選擇需要的數(shù)據(jù)庫的柱狀圖，然后右擊鼠標(biāo)，選擇“審查元素”，將map處的數(shù)據(jù)拷貝保存到data.txt文件中。然后利用R語言中的devtools和Oncomine包提取data.txt文件中的相關(guān)臨床數(shù)據(jù)，具體代碼如下：①library(devtools)；②install_github("yikeshu0611/Oncomine")；③library(Oncomine)；④a=Oncomine_bar("data.txt")；⑤head(a)；⑥write.table(a,"a.txt",sep=" ",quote=FALSE)，最后對(duì)新得到的a.txt文件中的數(shù)據(jù)進(jìn)一步分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)采用SPSS 23進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間的比較采用t檢驗(yàn)，多組間的比較采用One-way ANOVA方法，預(yù)后分析采用Kaplan-Meier模型，以雙側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ENO2在不同腫瘤中的表達(dá)情況Oncomine 數(shù)據(jù)庫中共收集了447項(xiàng)有關(guān)ENO2在腫瘤與正常對(duì)照之間比較的研究，有 42項(xiàng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中29項(xiàng)ENO2高表達(dá)，13項(xiàng)ENO2低表達(dá)。有7項(xiàng)腎癌相關(guān)的研究均表明ENO2表達(dá)升高(表 1)。

2.2 ENO2在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)情況利用Oncomine數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步分析ENO2在腎透明細(xì)胞癌中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)自2003年起共有6項(xiàng)研究，7個(gè)腎透明細(xì)胞癌數(shù)據(jù)集涉及ENO2在腎透明細(xì)胞癌和正常組織中的表達(dá)，共包括1 126例標(biāo)本。相關(guān)研究分別發(fā)表于Cancer Res[5]、Clin Cancer Res[6-7]、BMC Cancer[8-9]、TCGA。接著我們利用R語言分別提取Oncomine 數(shù)據(jù)庫中7個(gè)ENO2相關(guān)的腎透明細(xì)胞癌數(shù)據(jù)集的數(shù)據(jù)，并對(duì)ENO2在腫瘤與對(duì)照組的差異表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示在 BEROUKHIM等[5]、GUMZ等[6]、JONES等[7]、LENBURG等[8]、YUSENKO等[9]、TCGA等6項(xiàng)研究7個(gè)數(shù)據(jù)集研究中，ENO2在腎透明細(xì)胞癌中均顯著高表達(dá) (圖1，P<0.001)。

表1 Onconime 數(shù)據(jù)庫中ENO2在不同腫瘤中的表達(dá)

腫瘤類型研究數(shù)(癌癥vs.正常)ENO2高表達(dá)ENO2低表達(dá)腦及中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤09宮頸癌30食管癌20腎癌70白血病22肺癌40淋巴瘤01黑色素瘤10肉瘤40胰腺癌20前列腺癌01其他腫瘤40顯著性差異的研究2913

圖1 Oncomine 數(shù)據(jù)庫中ENO2在不同腎透明細(xì)胞癌數(shù)據(jù)集中的表達(dá)

A：Beroukhim研究，癌癥組1為遺傳性ccRCC，癌癥組2為非遺傳性ccRCC；B：Gumz研究；C：Lenburg研究；D：Yusenko研究；E：Jones研究；F：TCGA數(shù)據(jù)庫。*P<0.001。

2.3 ENO2與腎透明細(xì)胞癌臨床分期分級(jí)及預(yù)后的關(guān)系為明確ENO2與腎透明細(xì)胞癌的臨床相關(guān)性，我們利用R語言提取Oncomine數(shù)據(jù)庫中ENO2基因表達(dá)與分期、分級(jí)及預(yù)后的數(shù)據(jù)，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)ENO2基因的表達(dá)水平與腎透明細(xì)胞癌的分期和分級(jí)呈正相關(guān)，而與5年總生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)(圖 2)。

圖2 ENO2表達(dá)與ccRCC分期、分級(jí)及預(yù)后之間的關(guān)系

A：ENO2與ccRCC T分期之間的關(guān)系；B：ENO2與ccRCC N分期之間的關(guān)系；C：ENO2與ccRCC M分期之間的關(guān)系；D：ENO2與ccRCC TNM總分期之間的關(guān)系；E：ENO2與ccRCC 分級(jí)之間的關(guān)系；F：ENO2與ccRCC 5年總生存時(shí)間之間的關(guān)系。

3 討 論

ENO2，又稱神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)，是一種含433個(gè)氨基酸的長鏈酸性二聚體蛋白，包括兩種烯醇化同工酶，γγ和αγ，主要分布在神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞及由此來源的腫瘤細(xì)胞[10]，但在紅細(xì)胞、血小板、乳腺組織、前列腺和子宮中也有少量表達(dá)[11]。它在糖酵解中起重要的作用，可促進(jìn)β-甘油磷酸酯轉(zhuǎn)化為二羥磷酸丙酮。而糖酵解可通過提供腫瘤所需的能量從而顯著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，在腫瘤的進(jìn)展中起重要的作用[12-13]。

ENO2在多種腫瘤中過度表達(dá)，如胃癌[14]、前列腺癌[15]、膠質(zhì)瘤[16]、肺癌[17]等。膠質(zhì)瘤細(xì)胞在低氧和血清饑餓的情況下，ENO2表達(dá)顯著升高，而抑制其表達(dá)后可抑制腫瘤細(xì)胞的生長，證實(shí)在應(yīng)激狀態(tài)下腫瘤細(xì)胞通過糖酵解維持腫瘤細(xì)胞的生長[16]。由此可見，通過抑制ENO2參與的糖酵解，可作為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，ENO2與腫瘤的轉(zhuǎn)移相關(guān)，ENO2的C末端的肽可通過RhoA激酶來調(diào)控肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)，參與膠質(zhì)瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[16]。近幾年ENO2的研究主要集中在分子標(biāo)志物的研究[18]，臨床上已用于肺癌等腫瘤的協(xié)助診斷。有研究發(fā)現(xiàn)，組織及血清中的ENO2水平在多種腫瘤中起著重要的作用，如在小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌中ENO2可作為診斷、預(yù)后、隨訪及治療有效性的標(biāo)志物[19-21]；在精原細(xì)胞瘤中可作為診斷的標(biāo)志物；在類癌中可作為診斷、復(fù)發(fā)及治療有效性的標(biāo)志物；在甲狀腺髓樣癌中可作為復(fù)發(fā)及治療有效性的標(biāo)志物；在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中可作為診斷、預(yù)后、復(fù)發(fā)和治療有效性的標(biāo)志物[12]。最近研究發(fā)現(xiàn)，血清中ENO2的水平與急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)的免疫類型、風(fēng)險(xiǎn)分層和血清中乳酸脫氫酶含量密切相關(guān)。多因素分析發(fā)現(xiàn)ENO2高表達(dá)可作為成人ALL的獨(dú)立預(yù)后因素。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)ALL患者接受化療后ENO2 mRNA表達(dá)水平降低，然而復(fù)發(fā)時(shí)表達(dá)顯著升高。ENO2 mRNA表達(dá)升高，可通過上調(diào)糖酵解相關(guān)基因的表達(dá)和促進(jìn)Akt活性誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、糖酵解和糖皮質(zhì)激素耐受。因此，ENO2可作為ALL患者化療有效性及復(fù)發(fā)的標(biāo)志物，為ALL的治療提供潛在的治療方案[22]。

那么ENO2是否與腎透明細(xì)胞癌相關(guān)，是否可作為腎透明細(xì)胞癌的診斷、預(yù)后、復(fù)發(fā)及治療有效性的標(biāo)志物，目前尚不明確。為此，我們首先利用Oncomine數(shù)據(jù)庫挖掘ENO2基因在不同腫瘤組織中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的42項(xiàng)研究中，有29項(xiàng)研究顯示ENO2在腫瘤中高表達(dá)，其中包括肺癌、腎癌、淋巴瘤、白血病等。隨后進(jìn)一步分析了7個(gè)腎透明細(xì)胞癌數(shù)據(jù)集中1126例標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)ENO2在ccRCC中高表達(dá)，而且與ccRCC的分期分級(jí)及預(yù)后密切關(guān)系。研究結(jié)果顯示，ENO2的表達(dá)量越高，ccRCC分期分級(jí)越高，兩者密切相關(guān)，P<0.05；同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)ENO2表達(dá)高的患者，其總生存時(shí)間顯著降低。

綜上所述，我們通過Oncomine數(shù)據(jù)庫中的大樣本數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)ENO2在ccRCC組織中表達(dá)升高，且與ccRCC分期、分級(jí)及預(yù)后密切相關(guān)，為我們進(jìn)一步深入研究腎透明細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制、診斷預(yù)后標(biāo)志物及靶向治療藥物提供可靠的理論依據(jù)，有利于我們深入研究ENO2在腎透明細(xì)胞癌中的作用機(jī)制。但是由于本研究主要基于Oncomine數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)，不同的研究之間存在一定的差異性，而且有些研究的樣本量過小，分析得到的結(jié)果可能與實(shí)際結(jié)果有一定的差異性。因此，單純地利用Oncomine數(shù)據(jù)庫存在一定的缺陷和局限性，在未來的研究中我們將進(jìn)一步在腎癌手術(shù)標(biāo)本中驗(yàn)證其表達(dá)及在細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中探索ENO2的作用及調(diào)控機(jī)制。