彌志偉 孫忠義 趙 鵬 田平芳

(北京化工大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 北京 100029)

引 言

聚乙烯醇(PVA)廣泛用于紡織、造紙和涂料等行業(yè)，紡織工業(yè)產(chǎn)生的退漿廢水殘留大量PVA，造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。相比于高溫堿法，采用PVA生物降解法進(jìn)行退漿，一方面有利于減少?gòu)U物排放，另一方面有利于保護(hù)織物組織[1-2]。目前報(bào)道的PVA生物降解方式主要有兩種：一種是PVA氧化酶(SAO)與氧化型PVA水解酶(OPH)組合降解，另一種是PVA脫氫酶(PVADH)與OPH組合降解[3-4]。

目前，已有Pseudomonassp. VM15C和Sphingopyxissp. 113P3兩個(gè)菌株的pvadh基因得到確認(rèn)[5-6]，后者在大腸桿菌和畢赤酵母中表達(dá)后酶活分別達(dá)到194 U/mL[7]和8 464 U/mL[8]，但是在大腸桿菌中易形成包涵體，需進(jìn)行復(fù)雜的包涵體溶解和蛋白復(fù)性，而近一半蛋白無(wú)法恢復(fù)活性[7]；在畢赤酵母中則會(huì)因?yàn)轶w內(nèi)蛋白酶的作用發(fā)生血紅素結(jié)構(gòu)域的切割，無(wú)法得到完整的PVADH[8]。成熟的PVADH位于周質(zhì)空間，屬于吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinone，PQQ)依賴性醌酶，而大腸桿菌和畢赤酵母中生產(chǎn)的PVADH不含輔酶，需要結(jié)合其他菌株或人為提供的PQQ才具有催化活性。由于PQQ價(jià)格昂貴，增加了PVADH使用的成本，限制了其工業(yè)化應(yīng)用。

作為一種熱點(diǎn)工業(yè)微生物[9]，肺炎克雷伯桿菌(Klebsiellapneumoniae)具有如下優(yōu)勢(shì)：(1)含有pqqABCDEF基因簇(簡(jiǎn)稱pqq)，能夠天然生產(chǎn)輔酶PQQ[10]，節(jié)省外源添加PQQ的成本[11]；(2)作為原核宿主菌，在生產(chǎn)過(guò)程中發(fā)生蛋白酶切割PVADH的可能性?。?3)發(fā)酵成本低，生長(zhǎng)快，能高效利用甘油生產(chǎn)1, 3-丙二醇、3-羥基丙酸等大宗化學(xué)品[12-13]，附加產(chǎn)值高。本文擬采用K.pneumoniae作為PVADH的生產(chǎn)菌株，實(shí)現(xiàn)PQQ- PVADH全酶的高效生物合成。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料

1.1.1菌株與載體

K.pneumoniaeDSM2026，大腸桿菌E.coliDH5α，表達(dá)載體pET- 3tac(將pET- 28a的T7啟動(dòng)子替換為3個(gè)串聯(lián)的tac啟動(dòng)子)，pET- 15A- cm(將pET- 28a的復(fù)制子替換為15A，抗性基因替換為氯霉素(cm)抗性基因)，均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L；酵母粉5 g/L；NaCl 10 g/L；pH 7.0。固體培養(yǎng)基添加15 g/L瓊脂。

甘油發(fā)酵培養(yǎng)基：甘油30 g/L，酵母粉3 g/L，KH2PO41.3 g/L，K2HPO4·3H2O 3.4 g/L，(NH4)2SO44.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，CaCO30.1 g/L，微量元素1.25 mL/L[14]。

抗性培養(yǎng)基中加入50 μg/mL硫酸卡那霉素(kan)或17 μg/mL cm。

1.1.3主要試劑

限制性內(nèi)切酶和DNA連接酶購(gòu)買自NEB(北京)有限公司；Taq DNA聚合酶、質(zhì)粒提取試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒和DNA marker購(gòu)買自北京博邁德基因技術(shù)有限公司；BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)買自北京全式金生物技術(shù)有限公司；引物和優(yōu)化后的pvadh由華大基因(北京)合成。DNA測(cè)序由北京睿博興科生物技術(shù)有限公司完成。其余常規(guī)化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1重組菌構(gòu)建

以National Center for Biotechnology Information(NCBI)報(bào)道的Sphingopyxissp. 113P3pvadh基因序列(GenBank accession No. JQ235753)為模板，使用DNAMAN軟件按照K.pneumoniae密碼子偏好性優(yōu)化，并添加EcoR I和XhoI兩個(gè)酶切位點(diǎn)。將優(yōu)化后的pvadh與pET- 3tac質(zhì)粒雙酶切，經(jīng)T4連接酶催化連接后，得到重組質(zhì)粒pET- 3tac-pvadh。

待重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliDH5α經(jīng)抗性篩選、菌落PCR驗(yàn)證和測(cè)序確認(rèn)后，將正確的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至感受態(tài)K.pneumoniaeDSM2026，得到重組菌Kp(pET- 3tac-pvadh)。

為了解決超表達(dá)PVADH后PQQ供應(yīng)不足的問(wèn)題，構(gòu)建另一個(gè)超表達(dá)PQQ的載體。根據(jù)GenBank報(bào)道的pqq基因序列設(shè)計(jì)引物，兩端引入EcoR I和Hind III 酶切位點(diǎn)(表1)，克隆K.pneumoniae的pqq基因簇，PCR反應(yīng)參數(shù)：94 ℃，5 min；94 ℃，40 s；55 ℃，40 s；72 ℃，6 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min，16 ℃保存。將PCR產(chǎn)物和質(zhì)粒pET- 15A-cm通過(guò)EcoR I和Hind III雙酶切，經(jīng)T4連接酶催化連接后，得到重組質(zhì)粒pET- 15A-cm-pqq，將其轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α感受態(tài)，抗性篩選得到的單菌落采用pET載體通用上游引物pET- up和pqqB基因下游引物pqqB- R進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，經(jīng)測(cè)序確認(rèn)后，將pET- 15A-cm-pqq電轉(zhuǎn)至Kp(pET- 3tac-pvadh)中，得到同時(shí)超表達(dá)pvadh和pqq的雙質(zhì)粒菌株Kp(pvadh+pqq)，在含50 μg/mL kan和17 μg/mL cm的LB雙抗固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，通過(guò)菌落PCR篩選同時(shí)含有兩個(gè)質(zhì)粒的單菌落。

表1 引物序列

小寫字母表示酶切位點(diǎn)；F為上游引物，R為下游引物。

1.2.2搖瓶發(fā)酵及優(yōu)化

菌株活化培養(yǎng) 在含4 mL LB培養(yǎng)基的試管中，按1%接種量(體積分?jǐn)?shù))加入保存的菌液，37 ℃，200 r/min，恒溫震蕩培養(yǎng)12 h。

搖瓶發(fā)酵培養(yǎng) 在含100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角搖瓶中，按1%接種量(體積分?jǐn)?shù))加入活化后菌液，37 ℃，200 r/min，微氧發(fā)酵。接種2 h后，加入0.5 mmol/L(異丙基硫代半乳糖苷)到發(fā)酵液中。

數(shù)據(jù)采集 每3 h取樣，測(cè)定菌液在600 nm波長(zhǎng)處的吸光值A(chǔ)600，24 h后取菌液制備粗酶液，測(cè)PVADH酶活。

發(fā)酵優(yōu)化 通過(guò)單因素試驗(yàn)依次對(duì)甘油添加量、IPTG添加量、IPTG添加時(shí)間、發(fā)酵溫度進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.3PVADH粗酶液制備和優(yōu)化

PVADH前體含由25個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽，在幫助PVADH跨膜之后被切除。成熟的PVADH屬于周質(zhì)蛋白，獲得周質(zhì)蛋白的方法有超聲破碎法和滲透休克法[15]。本文對(duì)比了兩種方法的效果。

(1)超聲破碎法獲得PVADH粗酶液搖瓶發(fā)酵24 h后，取500 mL發(fā)酵液于4 ℃ 12 000 r/min下離心10 min，收集菌體，用PBS緩沖液洗滌1次后重懸于含1 mmol/L蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(PMSF)的50 mL PBS緩沖液中。取25 mL重懸液置于50 mL離心管中，冰浴30 min，在冰水保護(hù)下進(jìn)行間歇式超聲處理，超聲15 s，暫停45 s，反復(fù)10次左右，直至菌液變?yōu)槌吻寰|(zhì)溶液。

(2)滲透休克法獲得PVADH粗酶液500 mL發(fā)酵液，離心去上清液，菌體用PBS緩沖液洗滌1次后重懸于50 mL 30%蔗糖溶液中，室溫放置10 min，4 ℃離心收集菌體，再重懸于50 mL預(yù)冷的5 mmol/L MgSO4溶液中(含1 mmol/L PMSF)，吸打混勻后置于冰上20 min，4 ℃離心，得上清液，即周質(zhì)蛋白溶液。

1.2.4PVADH酶活性檢測(cè)

參考文獻(xiàn)[16]中的方法對(duì)PVADH的酶活性進(jìn)行檢測(cè)，PVADH酶活定義為酶活檢測(cè)體系中，每min減少1 nmoL 2, 6-二氯酚靛酚鈉(DCIP)(ε=1.91×104mmol/(L·cm))所需要的酶量為一個(gè)活力單位，單位U/mL。

2 結(jié)果與討論

2.1 pvadh密碼子的優(yōu)化及其在K. pneumoniae中的異源表達(dá)

不同物種對(duì)同義密碼子的使用具有偏好，利用這一特點(diǎn)，有針對(duì)性地進(jìn)行密碼子優(yōu)化，可幫助外源蛋白高效表達(dá)。為此，將Sphingopyxissp. 113P3的pvadh序列根據(jù)K.pneumoniae的密碼子偏好性進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的pvadh密碼子適應(yīng)指數(shù)(CAI)從0.7提升到0.95，理論上有利于提高蛋白的合成速率和數(shù)量。

提取pET- 3tac質(zhì)粒(圖1(a))，與合成的pvadh經(jīng)EcoR I和XhoI雙酶切并連接后，轉(zhuǎn)入E.coliDH5α感受態(tài)。菌落PCR采用pET載體的通用引物pET- up與pvadh的下游引物pvadh-XhoI- R，圖1(b)中3號(hào)菌株為陽(yáng)性重組菌。經(jīng)測(cè)序確認(rèn)后，將質(zhì)粒pET- 3tac-pvadh電轉(zhuǎn)至K.pneumoniae感受態(tài)中，經(jīng)菌落PCR確認(rèn)(圖1(c))，即得到重組菌Kp(pET- 3tac-pvadh)。

圖1 重組菌株Kp(pET- 3tac- pvadh)的構(gòu)建Fig.1 Construction of the recombinant strain Kp(pET- 3tac- pvadh)

發(fā)酵培養(yǎng)Kp(pET- 3tac-pvadh)，15 h取樣作SDS- PAGE蛋白電泳。如圖2所示，重組菌在67 kDa的位置出現(xiàn)特異性條帶，符合切除信號(hào)肽之后PVADH蛋白的大小，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)成功實(shí)現(xiàn)了PVADH在K.pneumoniae中的異源表達(dá)。

M—Marker； 1—K. pneumoniae wild-type (wt)； 2—Kp(pET- 3tac)； 3—Kp(pET- 3tac- pvadh)。圖2 超表達(dá)pavdh肺炎克雷伯重組菌的SDS- PAGE蛋白電泳結(jié)果Fig.2 SDS- PAGE analysis of recombinant K. pneumoniae strain overexpressing pavdh

2.2 PVADH粗酶液制備及酶活測(cè)定結(jié)果

將滲透休克法和超聲破碎法分離PVADH蛋白的效果進(jìn)行比較(表2)，可以看出，滲透休克法獲得粗酶液的總蛋白和酶活都不如超聲法，但是因?yàn)闈B透休克法獲得的上清液中主要是周質(zhì)蛋白，PVADH比活是超聲破碎法得到的粗酶液的3.7倍，所以后

表2 滲透休克法和超聲破碎法獲得PVADH粗酶液的效果比較續(xù)選擇滲透休克法制備PVADH粗酶液。

Table 2 Characteristics of the PVADH crude enzyme obtained by osmotic shock and ultrasonic fragmentation

提取方法ρ(總蛋白)/(mg·mL-1)總酶活/(U·mL-1)比活/(U·mg-1)超聲破碎法16.0751.313.07滲透休克法3.9545.4711.52

2.3 輔酶PQQ的再生

搖瓶發(fā)酵Kp(pET- 3tac-pvadh)，24 h的PVADH酶活為45.47 U/mL(圖3)。前人在K.pneumoniae中超表達(dá)可溶性葡萄糖脫氫酶(sGDH)后發(fā)現(xiàn)輔酶PQQ不能滿足sGDH的需求，額外添加PQQ能明顯提升酶活[12]。

圖3 添加或不添加PQQ時(shí)PVADH的酶活Fig.3 PVADH activity with or without PQQ addition

本文實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，添加6 μmol/L的PQQ有助于提高Kp(pET- 3tac-pvadh)酶活，相比不添加PQQ的粗酶液，添加PQQ的粗酶液酶活提高了55.6%(69.6 U/mL)，這說(shuō)明超表達(dá)pvadh之后，輔酶PQQ的供給相對(duì)不足，所以考慮通過(guò)輔酶再生提高Kp(pET- 3tac-pvadh)中PQQ產(chǎn)量。為了避免相同復(fù)制子在同一宿主中發(fā)生質(zhì)粒不相容問(wèn)題，采用了本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的pET- 15A-cm載體超表達(dá)pqq。提取K.pneumoniae基因組(圖4(a))，克隆pqq(圖4(b))，通過(guò)EcoR I和Hind III位點(diǎn)插入pET- 15A-cm，獲得pET- 15A-cm-pqq質(zhì)粒，將其電轉(zhuǎn)入Kp(pET- 3tac-pvadh)感受態(tài)中，通過(guò)兩組菌落PCR分別驗(yàn)證兩個(gè)質(zhì)粒的存在：①采用通用上游引物 pET- up和pqqB- R驗(yàn)證pET- 15A-cm-pqq質(zhì)粒，正確條帶大小為1 500 bp(圖4(c))；②采用pET- up與pvadh- xhoI- R驗(yàn)證pET- 3tac-pvadh質(zhì)粒，正確條帶大小為2 300 bp(圖4(d))。包含兩個(gè)質(zhì)粒的菌株即為Kp(pvadh+pqq)。

圖4 同時(shí)超表達(dá)pvadh和pqq的K. pneumoniae重組菌構(gòu)建Fig.4 Construction of recombinant K. pneumoniae strain coexpressing genes pvadh and pqq

在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)階段，與野生型K.pneumoniae及Kp(pET- 3tac-pvadh)相比，Kp(pvadh+pqq)在開(kāi)始時(shí)顯示出明顯的生長(zhǎng)負(fù)荷，但隨著時(shí)間的延長(zhǎng)其生長(zhǎng)速度加快，9 h后生物量接近野生型和Kp(pET- 3tac-pvadh)(圖5(a))。24 h時(shí)檢測(cè)酶活，發(fā)現(xiàn)Kp(pvadh+pqq)的PVADH酶活明顯提高，在沒(méi)有添加PQQ的情況下酶活達(dá)到了67.5 U/mL(圖5(b))。以上結(jié)果說(shuō)明輔酶再生很好地滿足了PVADH對(duì)PQQ的需求。

圖5 Kp(pET- 3tac- pvadh)和Kp(pvadh+pqq)的生長(zhǎng)情況與PVADH酶活Fig.5 Growth and PVADH activities of Kp(pvadh+pqq) and Kp(pET- 3tac- pvadh)

2.4 發(fā)酵優(yōu)化提高酶活

為進(jìn)一步提高K.pneumoniae中PQQ- PVADH產(chǎn)量，對(duì)Kp(pvadh+pqq)的發(fā)酵體系進(jìn)行單因素優(yōu)化，具體參數(shù)包括甘油濃度、IPTG添加量和添加時(shí)間及溫度。

首先是甘油濃度的優(yōu)化。K.pneumoniae能高效代謝甘油[13]，因此選擇甘油作為Kp(pvadh+pqq)的碳源。實(shí)驗(yàn)對(duì)比了不同甘油濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)和PVADH酶活的影響，結(jié)果如圖6所示，發(fā)現(xiàn)隨著甘油質(zhì)量濃度從10 g/L升至40 g/L，Kp(pvadh+pqq)的生長(zhǎng)量持續(xù)攀升，PVADH酶活也隨著生物量一同升高；但當(dāng)甘油質(zhì)量濃度超過(guò)40 g/L后，Kp(pvadh+pqq)的生長(zhǎng)量和PVADH酶活不升反降，推測(cè)可能是高濃度甘油增加了培養(yǎng)基黏度，影響了菌體生長(zhǎng)。

圖6 Kp(pvadh+pqq)發(fā)酵中甘油濃度的優(yōu)化Fig.6 Optimization of glycerol concentration in fermentation of Kp(pvadh+pqq)

然后是IPTG添加量的優(yōu)化。構(gòu)建的兩個(gè)質(zhì)粒分別超表達(dá)pvadh和pqq，都需要IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，適度增加IPTG濃度有助于提升兩個(gè)基因的表達(dá)量。從圖7可知，隨著IPTG添加量的升高，菌體生物量持續(xù)下降，表明IPTG對(duì)菌體生長(zhǎng)有明顯抑制作用；但PVADH的酶活卻有明顯提升，說(shuō)明IPTG誘導(dǎo)對(duì)pvadh和pqq的高效表達(dá)至關(guān)重要，結(jié)果顯示加入0.6 mmol/L IPTG時(shí)PVADH酶活最高。

圖7 Kp(pvadh+pqq)發(fā)酵中IPTG添加量的優(yōu)化Fig.7 Optimization of IPTG addition in Kp(pvadh+pqq) fermentation

圖8 Kp(pvadh+pqq)發(fā)酵中IPTG添加時(shí)間的優(yōu)化Fig.8 Optimization of time to add IPTG in Kp(pvadh+pqq) fermentation

之后是誘導(dǎo)劑添加時(shí)間的優(yōu)化。如圖8所示，接種后1 h到3 h，Kp(pvadh+pqq)的生物量A600從0.11緩慢提升到0.67，在A600=0.1～0.4區(qū)間內(nèi)，生物量越大，添加IPTG對(duì)24 h后PVADH酶活的提升效果越明顯，但當(dāng)A600達(dá)到0.67時(shí)添加IPTG，PVADH酶活明顯降低，所以選擇發(fā)酵后2.5 h(A600=0.4)添加IPTG。

最后是發(fā)酵溫度的優(yōu)化。如圖9所示，隨著溫度從25 ℃升高到37 ℃，Kp(pvadh+pqq)的生物量和PVADH酶活均有明顯提高；但當(dāng)溫度升至42 ℃后，菌體生長(zhǎng)嚴(yán)重受阻，生長(zhǎng)量和PVADH酶活驟降，所以選擇37 ℃作為Kp(pvadh+pqq)的發(fā)酵溫度。

圖9 Kp(pvadh+pqq)發(fā)酵溫度的優(yōu)化Fig.9 Optimization of temperature in Kp(pvadh+pqq) fermentation

綜合以上結(jié)果，優(yōu)化后的條件為：40 g/L甘油，37 ℃，2.5 h后添加0.6 mmol/L IPTG進(jìn)行發(fā)酵，24 h時(shí)PVADH酶活可達(dá)到80.7 U/mL。

3 結(jié)論

成功在PQQ天然生產(chǎn)菌K.pneumoniae中異源表達(dá)了pvadh，通過(guò)密碼子優(yōu)化實(shí)現(xiàn)了PVADH的高效表達(dá)，PVADH酶活達(dá)到45.47 U/mL；為解決PQQ供應(yīng)不足的問(wèn)題，構(gòu)建雙質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)同時(shí)超表達(dá)pqq基因簇，提高宿主菌的PQQ合成量，進(jìn)一步補(bǔ)充了輔酶PQQ，PVADH酶活達(dá)到67.5 U/mL；最后通過(guò)發(fā)酵條件優(yōu)化，PVADH酶活達(dá)到80.7 U/mL。

目前K.pneumoniae尚未通過(guò)基因工程優(yōu)化其基因組，不具備商業(yè)化底盤微生物如E.coli和P.pastoris在基因表達(dá)方面的優(yōu)勢(shì)，因此其PVADH產(chǎn)量相對(duì)較低。但作為一種PQQ天然生產(chǎn)菌，K.pneumoniae在生產(chǎn)PVADH的同時(shí)節(jié)省了添加輔酶PQQ的高昂成本，為PQQ- PVADH的生產(chǎn)提供了另一個(gè)選擇方案。隨著K.pneumoniae表達(dá)體系的不斷優(yōu)化，PQQ- PVADH產(chǎn)量還將進(jìn)一步提升。