復(fù)方感冒靈顆粒HPLC 指紋圖譜建立及化學(xué)成分鑒定

陳 丹， 李 柯， 符國成， 侯 茜， 沈冰冰， 龔小兵， 李若存

［1.湘潭醫(yī)衛(wèi)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 湘潭411102；2.湖南省中醫(yī)藥研究院，湖南 長沙410013；3.華潤三九（郴州） 制藥有限公司，湖南 郴州423000］

復(fù)方感冒靈顆粒由山銀花、五指柑、野菊花、三叉苦、南板藍根、崗梅6 味中藥，以及對乙酰氨基酚、咖啡因、馬來酸氯苯那敏3 種西藥組成的中西藥復(fù)方制劑，用于治療風(fēng)熱感冒及溫病之發(fā)熱、微惡風(fēng)寒、頭身痛、口干而渴、鼻塞涕濁、咽喉紅腫疼痛、咳嗽、痰黃黏稠，療效確切，市場需求量大，現(xiàn)有藥品標(biāo)準(zhǔn)（國家食品藥品監(jiān)督管理總局國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS3-B-2384-97-2017） 定性采用TLC法鑒別其中對乙酰氨基酚和馬來酸氯苯那敏，滴定法測定對乙酰氨基酚含有量［1］，但對中藥相關(guān)質(zhì)量控制與藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的闡釋仍為空白，導(dǎo)致質(zhì)量有差異，藥效不穩(wěn)定，成為制約相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展亟待解決的問題。

中藥指紋圖譜作為復(fù)方制劑質(zhì)量控制及中藥化學(xué)組分闡釋的一種重要方法， 得到了廣泛應(yīng)用［2-8］。本實驗建立復(fù)方感冒靈顆粒HPLC 指紋圖譜，并對其色譜峰進行指認(rèn)，鑒定出主要化學(xué)成分，以期為該制劑藥效物質(zhì)基礎(chǔ)闡明和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1290 型高效液相色譜系統(tǒng)，配置6530Accurate-Mass Q-TOF-LC-MS／MS、Qualitative Analysis B.05.00 色譜處理軟件（美國安捷倫科技公司）；KQ5200DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；XPE105 型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）。

1.2 試藥 對乙酰氨基酚 （批號 100018-201409）、咖啡因（批號171215-201211）、綠原酸（批號110753-201716）、原兒茶酸（批號110809-200604）、咖啡酸（批號110885-200102）、蒙花苷（批號111528-201710） 對照品均購自中國食品藥品檢定研究院； 異綠原酸 A （批號 MUST-18032601）、異綠原酸B（批號MUST-18031602）、新綠原酸（批號MUST-18031001）、隱綠原酸（批號MUST-18032403）、 異綠原酸C （批號MUST-18031603） 對照品均購自成都曼思特有限公司。乙腈、甲醇為色譜純（美國Tedia 公司）；甲酸為分析純（長沙市匯虹化玻儀器設(shè)備有限公司）；水為怡寶純凈水。復(fù)方感冒靈顆粒由華潤三九（郴州） 制藥有限公司提供，共10 批，批號分別為1709026N、1709027N、1709028N、1806254N、1806255N、1806256N、 1806257、 1806258N、 1806259N、 1806260N，編號S1～S10。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液制備 精密稱取各對照品適量，50%甲醇定容，即得，每1 mL 分別含對乙酰氨基酚2.6 mg、原兒茶酸10 μg、新綠原酸80 μg、綠原酸100 μg、咖啡因0.18 mg、隱綠原酸80 μg、咖啡酸5 μg、 異綠原酸B 40 μg、 異綠原酸A 20 μg、異綠原酸C 45 μg、蒙花苷100 μg。

2.2 供試品溶液制備 精密稱取顆粒粉末9.0 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入50 mL 50%甲醇，稱定質(zhì)量， 超聲 （功率250 W、 頻率50 kHz）30 min，冷卻，50%甲醇溶液補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜條件 Kromasil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈 （A） -0.1%甲酸（B），梯度洗脫（0 ～20 min，5%→18%A；20 ～45 min，18%→26%A；45 ～55 min，26%→35%A；55～60 min，35%→5%A；60 ～65 min，5%A）；檢測 波 長 290 nm； 柱 溫 30 ℃； 體 積 流 量1.0 mL／min；進樣量10 μL。色譜圖見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.4 質(zhì)譜條件 電噴霧電離源離子化（ESI），負(fù)離子模式采集；輔助噴霧電離、脫溶劑氣體高純N2；干燥氣體積流量6.8 L／min；鞘氣溫度350 ℃；毛細管電壓4.0 kV；碎片電壓130 V；m／z 50 ～1 000。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度試驗 取顆粒 （S1） 適量， 按“2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.3” 項色譜條件下進樣測定6 次，以綠原酸保留時間、峰面積為參照，測得各共有峰相對保留時間、相對峰面積RSD 均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 重復(fù)性試驗 取顆粒 （S1） 適量， 按“2.2” 項下方法平行制備6 份供試品溶液， 在“2.3” 項色譜條件下進樣測定，測得各共有峰相對保留時間、相對峰面積RSD 均小于3%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗 取供試品（S1） 溶液，于0、3、6、9、12、15、24 h 在“2.3” 項色譜條件下進樣測定，測得各共有峰相對保留時間、相對峰面積RSD 均小于3%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 HPLC 指紋圖譜建立及相似度計算 取10 批顆粒，按“2.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.3” 項色譜條件下進樣測定，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)” 軟件處理數(shù)據(jù)，選擇S1 作為參照圖譜，多點校正后自動匹配，生成對照圖譜（R），由于綠原酸（4 號峰） 分離度較好，峰面積適中，對照品易得， 故將其作為參照峰（S），測定相對保留時間、相對峰面積，確定有11個共有峰。見圖2，相似度見表1。

圖2 10 批樣品HPLC 指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprints of ten batches of samples

表1 10 批樣品相似度Tab.1 Similarities of ten batches of samples

2.7 化學(xué)成分鑒定 通過對照品鑒定出11 種成分，分別為對乙酰氨基酚、原兒茶酸、新綠原酸、綠原酸、咖啡因、隱綠原酸、咖啡酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、蒙花苷。再通過HPLC-Q-TOF-MS／MS 法對指紋圖譜色譜峰進行指認(rèn)，比對精確相對分子質(zhì)量、特征碎片峰，并結(jié)合Mass Fragment TM 確定相對分子質(zhì)量和分子式，結(jié)合已建立的目標(biāo)數(shù)據(jù)庫和文獻，鑒定出6 種成分，分別為奎尼酸、丁香酸、咖啡因、松柏醛、二咖啡?？崴?、斷氧化馬錢子苷、毛冬青酸。見圖3 ～4、表2。

圖3 各成分HPLC-Q-TOF-MS／MS 負(fù)離子流圖Fig.3 HPLC-Q-TOF-MS／MS anion current chromatogram of various constituents

圖4 樣品（S1） HPLC 指紋圖譜Fig.4 HPLC fingerprint of sample（S1）

2.8 藥材歸屬 圖4 中共有27 個色譜峰，通過比對相應(yīng)對照品、指紋圖譜，確定峰7 為奎尼酸，是五指柑特征峰；峰8 為丁香酸，是山銀花特征峰；峰10 為原兒茶酸，是山銀花、五指柑、野菊花共有峰；峰11 為新綠原酸，是崗梅、山銀花、五指柑、野菊花共有峰；峰13 為綠原酸，是崗梅、山銀花、五指柑、野菊花共有峰；峰15 為隱綠原酸，是崗梅、三叉苦、山銀花、五指柑、野菊花共有峰；峰16 為松柏醛，是崗梅、南板藍根、三叉苦、山銀花、五指柑共有峰；峰17 為咖啡酸，是崗梅、五指柑、野菊花共有峰；峰18 為二咖啡酰奎寧酸，是南板藍根、三叉苦、山銀花、野菊花共有峰；峰21 為斷氧化馬錢子苷，是山銀花特征峰；峰22 為毛冬青酸，是崗梅、南板藍根、三叉苦、山銀花、五指柑共有峰；峰24 為異綠原酸B，是崗梅、山銀花、五指柑、野菊花共有峰；峰25 為異綠原酸A，是崗梅、山銀花、五指柑、野菊花共有峰；峰26 為異綠原酸C，是崗梅、山銀花、五指柑、野菊花共有峰；峰27 為蒙花苷，是野菊花特征峰。見圖5。

表2 主要共有峰HPLC-Q-TOF-MS／MS 分析Tab.2 HPLC-Q-TOF-MS／MS analysis of main common peaks

圖5 樣品與單味藥HPLC 特征圖譜Fig.5 Characteristic HPLC chromatograms of sample and single drugs

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法選擇 本實驗考察了超聲提取、回流提取，發(fā)現(xiàn)兩者對測定結(jié)果無明顯影響，故選擇操作簡便的前者，再比較了提取溶劑（甲醇、乙醇、50%甲醇、50%乙醇）、溶劑用量（25、 50、 100 mL）、 提 取 時 間 （20、 30、40 min），綜合考慮色譜峰數(shù)、分離度、對稱因子、相對內(nèi)參比峰面積和，最終確定供試品溶液制備方法為50 mL 50%甲醇超聲提取30 min。

3.2 檢測波長選擇 本實驗利用二極管陣列檢測器全波長掃描，重點考察了245、256、260、273、290、325、330、334 nm 波長下的指紋圖譜，綜合考慮色譜峰數(shù)、分離度、相對內(nèi)參比峰面積和，發(fā)現(xiàn)290 nm 處效果較好，故選擇其作為檢測波長。

3.3 流動相優(yōu)化 由于復(fù)方感冒靈顆粒中野菊花、山銀花等藥材所含成分呈略偏酸性，故流動相也應(yīng)略偏酸。文獻［17-20］ 報道，山銀花、野菊花中主要成分的HPLC 分離溶劑一般采用乙腈，而液質(zhì)采用甲酸，故水相為0.1%甲酸。再選擇5 種流動相比例來優(yōu)化梯度洗脫條件，發(fā)現(xiàn)以“2.3” 項下流動相洗脫時基線較平穩(wěn)，色譜峰分離良好，而且數(shù)量多，高度適中。

3.4 參照峰選擇 現(xiàn)代研究表明，綠原酸具有抗菌、抗炎、抗氧化、補腎、保肝、抗高血壓、抗腫瘤、抗輻射等多種藥理作用［21］。圖3 中13 號峰綠原酸為復(fù)方感冒靈顆粒中山銀花、崗梅、五指柑、野菊花共有成分，其峰面積大小適中，與前后色譜峰分離度較好，而且保留時間穩(wěn)定，故選擇其作為參照峰。

4 結(jié)論

中藥指紋圖譜既能較全面地反映成品與原料所含化學(xué)成分的相對關(guān)系，也能真正對中藥內(nèi)在質(zhì)量進行有效表征、綜合評價、全面控制，與傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論相適應(yīng)。本實驗建立10 批復(fù)方感冒靈顆粒HPLC 指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)有11 個共有峰，同時采用UPLC-Q-TOF-MS 法分析其化學(xué)成分，根據(jù)負(fù)離子模式下準(zhǔn)分子離子峰結(jié)合裂解規(guī)律，共鑒定出17種，可為該制劑藥效物質(zhì)闡釋及相關(guān)基礎(chǔ)研究開展奠定基礎(chǔ)。