艾葉揮發(fā)油對A549 細(xì)胞的抑制作用

丁圓平， 劉靖怡， 田 洋， 李艷麗， 吳明哲， 趙志鴻

［1.鄭州大學(xué)藥物研究院，河南 鄭州450001；2.中國礦業(yè)大學(xué)（北京） 化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，北京100083；3.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州450052；4.河南?。ㄠ嵵荽髮W(xué)） 醫(yī)藥科學(xué)研究院，河南鄭州450052］

肺癌是目前發(fā)病率、死亡率增長最快的惡性腫瘤［1］，大多數(shù)情況下由于癌細(xì)胞高侵襲性，手術(shù)無法達(dá)到預(yù)期效果，而化療通常會產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用，并且近年來新型靶向藥物價(jià)格昂貴，大大限制了臨床推廣。前期報(bào)道［2-4］，中成藥毒副反應(yīng)少，對中晚期肺癌患者具有提高機(jī)體免疫力、改善臨床癥狀等作用，正成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。

艾葉為菊科植物艾Artemisia argyi Lévl.et Vant.的干燥葉，具有抗炎、抗菌、抗病毒、鎮(zhèn)咳平喘等多種藥理作用［5-8］，廣泛應(yīng)用于臨床，其主要有效成分為艾葉揮發(fā)油，前期證實(shí)它具有抗HBV、抗肝癌活性［9-10］，但尚無其抗肺癌作用的報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)研究艾葉揮發(fā)油體內(nèi)外抗肺癌A549 細(xì)胞活性，并初步探討其作用機(jī)制，為相關(guān)抗腫瘤新藥研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 試藥 艾葉產(chǎn)自河南駐馬店，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)董誠明教授鑒定為正品，其揮發(fā)油為實(shí)驗(yàn)室自提。RPMI 1640（北京索萊寶科技有限公司）；胎牛血清、MTT（美國Sigma 公司）；AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、細(xì)胞周期檢測試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；5-氟尿嘧啶注射液（上海旭東海普藥業(yè)有限公司）。

1.2 儀器 IL-161CT CO2培養(yǎng)箱［施都凱儀器設(shè)備（上海） 有限公司］；168-1000XC 酶標(biāo)儀（美國Bio-Rad 公司）； XL-MCL 流式細(xì)胞儀 （美國Beckman Coulter 公司）。

1.3 動物 SPF 級雌性BALB／c-nu 裸鼠，周齡5～6周，體質(zhì)量18～20 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供， 合格證號SCXK （京）2016-0006，在溫度20 ～25 ℃、相對濕度40%～60%的無菌籠中飼養(yǎng)，定期喂食。

2 方法

2.1 揮發(fā)油提取 稱取艾葉500 g，粉碎后置于10 000 mL 圓底燒瓶中，加入5 000 mL 蒸餾水浸泡過夜，水蒸氣蒸餾法提取6 h，收集揮發(fā)油，無水硫酸鈉除水后密封貯存于-20 ℃下，測得揮發(fā)油產(chǎn)率為0.39%。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng) A549 細(xì)胞貼壁生長，RPMI 1640、胎牛血清以9 ∶1 比例配制成完全培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.3 供試品溶液制備 1 mL 揮發(fā)油質(zhì)量為944 mg。體外藥效實(shí)驗(yàn)中，取揮發(fā)油16 μL，加入24 μL DMSO 混合均勻，培養(yǎng)基逐步稀釋，即得（DMSO 最高含有量為0.1%）；體內(nèi)藥效實(shí)驗(yàn)中，取揮發(fā)油1 mL，加入20 μL 吐溫-80，混合均勻，生理鹽水逐步稀釋，即得。

2.4 揮發(fā)油對A549 細(xì)胞增殖影響 胰酶消化處于對數(shù)生長期的A549 細(xì)胞，離心，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至5×104～6×104／mL，按每孔100 μL 接種于96 孔板中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，吸去原培 養(yǎng) 基， 加 入 188.8、 283.2、 377.6、 472.0、566.4、660.8 μg／mL 揮發(fā)油， 陽性對照組加入10 μg／mL 5-氟尿嘧啶，陰性對照組加入100 μL 空白培養(yǎng)基，每個質(zhì)量濃度4 個復(fù)孔。于24、48、72 h 各加入20 μL MTT 溶液，置于培養(yǎng)箱中孵育4 h，吸去原培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO，微量振蕩器上振蕩10 min 后上機(jī)檢測，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，增殖抑制率＝ （1-給藥孔吸光度／空白孔吸光度） ×100%［11］， 重 復(fù)3 次， SPSS 軟 件 計(jì) 算IC50值。

2.5 細(xì)胞凋亡率檢測 采用Annerxin V-FITC／PI雙染法。胰酶消化處于對數(shù)生長期的A549 細(xì)胞，離心，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至1×105／mL，按每孔2 mL 接種于6 孔板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，吸去原培養(yǎng)基，加入188.8、236.0、283.2、330.4、377.6、424.8 μg／mL 揮發(fā)油培養(yǎng)48 h，不含EDTA 的胰酶消化收集細(xì)胞，PBS 緩沖液洗滌2次，加入Annerxin V-FITC、PI 各5 μL，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，重復(fù)3 次。

2.6 細(xì)胞周期檢測 采用PI 單染法。胰酶消化處于對數(shù)生長期的A549 細(xì)胞，離心，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至1×105／mL， 按每孔2 mL 接種于6 孔板中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，吸去原培養(yǎng)基，加入188.8、236.0、283.2、330.4 μg／mL 揮發(fā)油培養(yǎng)48 h，胰酶消化收集細(xì)胞，PBS 緩沖液洗滌1 次，70%冷乙醇固定，4 ℃下過夜，PBS 緩沖液洗去固定液，加入PI／RNase A 后室溫下避光30 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期，重復(fù)3 次。

2.7 艾葉揮發(fā)油對A549 荷瘤裸鼠腫瘤生長及體質(zhì)量的影響 裸鼠右背部皮下注射1×107個A549細(xì)胞（0.2 mL／只），建立肺癌模型，當(dāng)腫瘤體積增加到約100 mm3時(shí)隨機(jī)分為5 組，每組5 只，實(shí)驗(yàn)組（3 組） 分別腹腔注射230、115、57.5 mg／kg揮發(fā)油，陽性組給予5-氟尿嘧啶（10 mg／kg），對照組給予等量生理鹽水，連續(xù)15 d，每2 d 測量1次腫瘤體積和體質(zhì)量。第15 天，裸鼠稱定質(zhì)量，測量腫瘤體積后處死，稱定瘤重，計(jì)算腫瘤生長抑制率，公式為體積＝1／2×a×b2（a、b 分別表示腫瘤長徑、短徑）、抑制率＝ ［ （陰性對照組平均瘤重-實(shí)驗(yàn)組平均瘤重） ／陰性對照組平均瘤重］ ×100%［12］。

2.8 病理組織切片 每組隨機(jī)取2 只裸鼠，剖離組織器官，生理鹽水清洗表面，吸水紙吸干水分，4%甲醛固定，HE 染色法制備病理組織切片，顯微鏡下觀察、拍照。

3 結(jié)果

3.1 揮發(fā)油對A549 細(xì)胞增殖影響 圖1 顯示，揮發(fā)油對A549 細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，并呈濃度依賴性。當(dāng)其質(zhì)量濃度為660.8 μg／mL 時(shí)，48、72 h 細(xì)胞生長抑制率均在80%以上，24、48、72 h的IC50值分別為513.54、495.60、484.27 μg／mL。

圖1 揮發(fā)油對A549 細(xì)胞抑制率的影響Fig.1 Effect of volatile oils on the inhibition rate of A549 cells

3.2 揮發(fā)油對A549 細(xì)胞凋亡的影響 圖2～3 顯示，揮發(fā)油作用A549 細(xì)胞48 h 后隨著其質(zhì)量濃度增加，細(xì)胞凋亡率也逐漸升高。188.8 ～330.4 μg／mL 時(shí)，細(xì)胞早期凋亡率無明顯變化； 繼續(xù)增加至377.6 μg／mL時(shí)，早期凋亡率驟增；424.8 μg／mL時(shí)凋亡率最高，為67.1%。

3.3 揮發(fā)油對A549 細(xì)胞周期的影響 圖4 ～5 顯示，揮發(fā)油作用于A549 細(xì)胞48 h 后，G0／G1 期細(xì)胞比例降低，G2／M 期無明顯變化，S 期細(xì)胞比例增加。隨著其質(zhì)量濃度增加，S 期細(xì)胞比例逐漸增加，具有濃度依賴性。

3.4 揮發(fā)油對腫瘤生長的影響 表1、圖6 ～8 顯示，230、115、57.5 mg／kg 揮發(fā)油的抑瘤率分別為55.54%、33.85%、19.20%，低于5-氟尿嘧啶組的71.10%，但連續(xù)給藥5 d 后，5-氟尿嘧啶組裸鼠出現(xiàn)食欲不振、體質(zhì)量明顯下降的現(xiàn)象；揮發(fā)油組無明顯變化，并較陰性對照組能明顯抑制腫瘤生長。

圖3 A549 細(xì)胞凋亡曲線Fig.3 Apoptosis curves for A549 cells

表1 各組腫瘤質(zhì)量、抑瘤率的比較Tab.1 Comparison of tumor weights and tumor inhibition rates among various groups

表1 各組腫瘤質(zhì)量、抑瘤率的比較Tab.1 Comparison of tumor weights and tumor inhibition rates among various groups

注：與陰性對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 （m劑g·量kg／-1） 腫瘤質(zhì)量／g 抑瘤率／%陰性對照組 — 2.22±0.36 —艾葉揮發(fā)油組 230 0.99±0.08** 55.54艾葉揮發(fā)油組 115 1.47±0.10* 33.85艾葉揮發(fā)油組 57.5 1.79±0.21* 19.20 5-氟尿嘧啶組 10 0.64±0.06** 71.10

圖4 各組A549 細(xì)胞48 h 周期分布（Ⅰ）Fig.4 Cycle distributions of A549 cells at 48 h in various groups（Ⅰ）

圖5 各組A549 細(xì)胞48 h 周期分布（Ⅱ）Fig.5 Cycle distributions of A549 cells at 48 h in various groups（Ⅱ）

圖6 各組裸鼠腫瘤體積Fig.6 Tumor volumes of nude mice in various groups

圖7 裸鼠腫瘤體積變化曲線Fig.7 Variation curves for tumor volumes of nude mice

圖8 裸鼠體質(zhì)量變化曲線Fig.8 Variation curves for body weights of nude mice

3.5 病理組織分析 圖9 顯示，陰性組裸鼠腫瘤細(xì)胞排列紊亂緊密，片塊狀彌散分布，細(xì)胞胞漿豐富，細(xì)胞核增大，深染，具有明顯的異型性；5-氟尿嘧啶組裸鼠腫瘤組織出現(xiàn)明顯局灶性壞死，腫瘤細(xì)胞核分裂相減少，核固縮、碎裂、溶解，出現(xiàn)大片壞死；艾葉揮發(fā)油低劑量組裸鼠腫瘤細(xì)胞細(xì)胞排列緊密，部分出現(xiàn)萎縮，細(xì)胞界限模糊，未呈現(xiàn)典型凋亡狀態(tài)；艾葉揮發(fā)油高劑量組裸鼠腫瘤細(xì)胞體積減小，細(xì)胞間隙增大，核漿比例縮小，細(xì)胞胞核染色變淺，核分裂相減少，出現(xiàn)大量凋亡小體，呈現(xiàn)凋亡狀態(tài)。與陰性對照組比較，5-氟尿嘧啶組裸鼠肺泡壁明顯增生變厚，而艾葉揮發(fā)油組無明顯變化，但出現(xiàn)肺大泡，表明肺部組織發(fā)生了病理變化；5-氟尿嘧啶組、艾葉揮發(fā)油高劑量組裸鼠肝組織切片中均出現(xiàn)細(xì)微裂縫，表明也有部分病變；各組裸鼠心、脾、腎組織HE 病理組織切片顯示，各組織內(nèi)細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊湊，界限清晰，均未見明顯病理學(xué)病變和轉(zhuǎn)移瘤灶。

圖9 各組裸鼠組織病理學(xué)切片F(xiàn)ig.9 Histopathological sections of nude mice in various groups

4 討論

肺癌具有惡化程度高、治療效果差、早期癥狀體征不典型等特點(diǎn)，化療是最常用的方法，但其自身毒副作用和耐藥性又妨礙臨床療效［13-14］，臨床常見的類型是非小細(xì)胞肺癌，其中肺腺癌所占比例最大。A549 細(xì)胞屬于人肺腺癌細(xì)胞系，細(xì)胞學(xué)水平實(shí)驗(yàn)中常被作為標(biāo)準(zhǔn)模式細(xì)胞［15］。

艾葉揮發(fā)油為小分子物質(zhì)，能被機(jī)體快速吸收，成分復(fù)雜，具有多種藥理作用，故應(yīng)用廣泛，如呼吸系統(tǒng)、抗菌、抗炎、抗腫瘤等［16-18］。本實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)，艾葉揮發(fā)油能明顯抑制體外培養(yǎng)人肺癌A549 細(xì)胞生長，并呈劑量-時(shí)間依賴關(guān)系；可通過抑制DNA 合成來使細(xì)胞阻滯于S 期，可能是誘導(dǎo)A549 細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一；對裸鼠皮下接種的A549 細(xì)胞生長具有抑制作用，其機(jī)制可能為誘導(dǎo)A549 細(xì)胞凋亡。

在本實(shí)驗(yàn)所測濃度范圍內(nèi)，艾葉揮發(fā)油抗腫瘤活性雖不如5-氟尿嘧啶，但其對正常細(xì)胞毒性較低，而且與陰性對照組相比能明顯抑制人肺癌A549 細(xì)胞生長速度。故綜合考慮，該成分體現(xiàn)出了安全有效、低毒的優(yōu)勢，具有廣闊的開發(fā)前景，為肺癌治療提供了新選擇。