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      補(bǔ)益強(qiáng)心片對(duì)慢性心力衰竭大鼠的保護(hù)作用

      2019-10-16 12:48:00馮慶濤呂尚增苗華為
      中成藥 2019年9期
      關(guān)鍵詞:補(bǔ)益強(qiáng)心低劑量

      馮慶濤, 楊 靜, 張 燕, 呂尚增, 苗華為

      (河北省中醫(yī)院,河北 石家莊050011)

      慢性心衰是由多因素所致的病理過程[1],傳統(tǒng)中醫(yī)藥在治療過程中顯示出整體辨證和調(diào)節(jié)的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。補(bǔ)益強(qiáng)心片是由人參、黃芪、五加皮等組成的復(fù)方中藥制劑,臨床上用于治療冠心病、高血壓性心臟病所致慢性充血性心力衰竭[2-3],并在《慢性心力衰竭中醫(yī)診療專家共識(shí)》 中推薦用于慢性心衰患者的治療。

      PI3K-Akt 信號(hào)通路是與細(xì)胞生長、增殖密切相關(guān)的一條典型信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,激活后可抑制細(xì)胞凋亡,改善心臟功能[4]。本實(shí)驗(yàn)通過結(jié)扎心臟左冠狀動(dòng)脈前降支的方法制備慢性心力衰竭大鼠模型,觀察補(bǔ)益強(qiáng)心片對(duì)其作用,并初步探討該制劑對(duì)PI3K-Akt 信號(hào)通路及凋亡的影響,從而為其臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

      1 材料

      1.1 動(dòng)物 雄性SD 大鼠60 只,體質(zhì)量200~220 g,購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,許可證號(hào)SCXK(京) 2016-0011。實(shí)驗(yàn)期間大鼠于籠中飼養(yǎng),每籠5 只,每天光照12 h,溫度20 ~26 ℃,相對(duì)濕度40%~70%。

      1.2 試藥 補(bǔ)益強(qiáng)心片購自蘇州滋露藥業(yè)有限公司(國藥準(zhǔn)字Z20050077)。大鼠N-端前腦鈉肽(BNP)、大鼠N-端前心鈉肽 (ANP) 酶聯(lián)免疫(ELISA) 試劑盒購自上海易利生物科技有限公司;B 細(xì)胞白血病/淋巴瘤抗原-2(Bcl-2)、白血病/淋巴瘤抗原相關(guān)X 蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶(caspase-3)、磷脂酰肌醇-3 羥基激酶(PI3K) 及磷酸化(p-PI3K)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Akt) 及磷酸化(p-Akt) 兔多克隆抗體均購自英國Abcam 公司。

      1.3 儀器 POWERLAB-420E 生理記錄儀購自澳大利亞ADInstruments 公司;HX-300 動(dòng)物呼吸機(jī)購自成都泰盟科技有限公司;小動(dòng)物超聲儀超聲診斷系統(tǒng)購自意大利百勝集團(tuán)公司;Epics XL 流式細(xì)胞儀購自美國Beckman Coulter 公司;SpectraMax M2酶標(biāo)儀購自美國分子儀器公司;ABI 300 熒光定量PCR 儀購自美國ABI 公司。

      2 方法

      2.1 分組及給藥 60 只大鼠隨機(jī)為正常對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組及補(bǔ)益強(qiáng)心片低、中、高劑量組(0.18、0.36、0.72 g/kg), 每組10 只。 手術(shù)后24 h開始給藥,補(bǔ)益強(qiáng)心組大鼠每天灌胃給藥,持續(xù)4 周,藥物分別用純水配制成0.018、0.036、0.072 g/mL 混懸液,而正常對(duì)照組、假手術(shù)組、模型組大鼠灌胃給予等體積純水,各組給藥量均為1 mL/100 g。

      2.2 模型建立[5]大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉后,仰臥位固定,連接生理記錄儀,經(jīng)口氣管插管,連接動(dòng)物呼吸機(jī),打開胸腔,第2、3 肋骨之間鈍性分離胸膜,在左心耳下與肺動(dòng)脈根部約1.5 mm 處迅速穿線結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支,關(guān)閉胸腔后縫合,生理記錄儀可觀察到ST-T 弓背上抬,提示造模成功;假手術(shù)組大鼠只穿線而并不結(jié)扎;正常對(duì)照組大鼠不作任何處理。

      2.3 血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)檢測(cè) 給藥結(jié)束后,大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉,仰臥位固定,備皮,應(yīng)用超聲儀超聲診斷系統(tǒng),二維超聲引導(dǎo),根據(jù)心室波群的M 型曲線測(cè)量大鼠左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDd)、左室收縮末期內(nèi)徑(LVESd)、射血分?jǐn)?shù)(LVEF)。

      2.4 BNP、ANP 水平檢測(cè) 采用ELISA 法。大鼠頸動(dòng)脈取血,離心后取上清液,按照ELISA 試劑盒說明書步驟操作, 酶標(biāo)儀測(cè)定OD 值, 計(jì)算BNP、ANP 水平。

      2.5 心肌細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)。取大鼠心臟左室壁心肌組織,剪碎后充分研磨,PBS緩沖液洗滌, 加入膜聯(lián)蛋白 V 和碘化丙啶(Annexin V-PI) 進(jìn)行聯(lián)合染色,混勻后置于冰浴中溫育,上機(jī)檢測(cè)凋亡率,流式細(xì)胞儀激發(fā)光波長為488 nm。

      2.6 大鼠心肌Bcl-2、Bax、caspase-3 mRNA 表達(dá)檢測(cè) 采用RT-PCR 法。取大鼠心臟左室壁心肌組織,加入Trizol Reagent 冰浴勻漿,離心,提取總RNA,按試劑盒要求進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,加入引物等反應(yīng)體 系, PCR 儀 擴(kuò) 增。 Bcl-2 正 向5′-GGATGACTTCTCTCGTCGCTAC-3′, 反 向5′-TGACATCTCCCTGTTGACGCT-3′,產(chǎn)物片段100 bp;Bax 正向5′-GGTTGCCCTCTTCTACTTTGC-3′, 反 向 5′-TCTTCCAGATGGTGAGCGAG-3′, 產(chǎn) 物 片 段 239 bp;caspase-3 正向5′-GCGGTATTGAGACAGACAGTG-3′,反向5′-GGGTGCGGTAGAGTAAGCATA-3′,產(chǎn)物片段95 bp; 內(nèi) 參GAPDH 正 向5′-TGCTGAGTATGTCGTGGAGTC-3′, 反 向 5′-TGCTGAGTATGTCG TGGAGTC-3′,產(chǎn)物片段143 bp。采用RT-PCR 自帶的分析軟件,將正常對(duì)照組設(shè)定為1,以目的基因/GAPDH 相對(duì)定量值反映目的基因表達(dá)。

      2.7 大鼠心肌Bcl-2、Bax、caspase-3、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt 蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot 法。取大鼠心臟左室壁心肌組織,加入預(yù)冷的組織裂解液充分勻漿,離心后取上清,BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白濃度,聚丙烯酰胺凝膠電泳變性,將分離蛋白經(jīng)轉(zhuǎn)移裝置轉(zhuǎn)移至膜,PVDF膜在脫脂奶粉溶液中孵育, 加入一抗或內(nèi)參GAPDH 進(jìn)行抗原抗體結(jié)合,再加入相應(yīng)二抗以結(jié)合一抗,采用化學(xué)發(fā)光法,X 膠片曝光顯影,分析軟件將掃描圖片進(jìn)行條帶灰度值數(shù)字化,以Bcl-2、Bax、caspase-3、PI3K、 p-PI3K、 Akt、 p-Akt 灰度值/GAPDH 灰度值來校正誤差,所得比值反映目的蛋白相對(duì)表達(dá)。

      2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 11.5 軟件進(jìn)行處理,數(shù)據(jù)以() 表示,2 組間比較采用SNK-q 法,多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

      3 結(jié)果

      3.1 補(bǔ)益強(qiáng)心片對(duì)血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響 表1、圖1 顯示, 與假手術(shù)組比較, 模型組LVEDd、LVESd 顯著升高,LVEF 顯著降低(P<0.01);與模型組比較,補(bǔ)益強(qiáng)心片低劑量組LVESd 顯著降低,LVEF 顯著升高(P<0.05,P<0.01),中、高劑量組LVEDd、LVESd 顯著降低,LVEF 顯著升高(P<0.01)。

      表1 各組血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較(,n=10)Tab.1 Comparison of hemodynamic parameters among various groups(,n=10)

      表1 各組血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較(,n=10)Tab.1 Comparison of hemodynamic parameters among various groups(,n=10)

      注:與假手術(shù)組比較,##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01

      組別 劑量/(g·kg-1) LVEDd/mm LVESd/mm LVEF/%正常對(duì)照組 — 5.33±0.91 3.21±0.68 79.02±9.22假手術(shù)組 — 5.41±0.93 3.29±0.73 72.59±10.08模型組 — 7.89±1.14## 7.11±1.23## 35.16±7.39##補(bǔ)益強(qiáng)心片低劑量組 0.18 6.79±1.18 5.91±0.97* 47.41±6.26**補(bǔ)益強(qiáng)心片中劑量組 0.36 6.28±0.93** 5.86±0.81* 53.87±7.08**補(bǔ)益強(qiáng)心片高劑量組 0.72 6.12±0.89** 5.15±0.77** 57.81±7.79**

      3.2 補(bǔ)益強(qiáng)心片對(duì)BNP、ANP 水平的影響 表2顯示,與假手術(shù)組比較,模型組BNP、ANP 水平顯著升高(P<0.01);與模型組比較,補(bǔ)益強(qiáng)心片組兩者水平顯著降低(P<0.01)。

      圖1 各組大鼠超聲心電圖Fig.1 Ultrasonic lectrocardiograms of rats in various groups

      表2 各組BNP、ANP 水平比較(n=10)Tab.2 Comparison of BNP and ANP levels among various groups,n=10)

      表2 各組BNP、ANP 水平比較(n=10)Tab.2 Comparison of BNP and ANP levels among various groups,n=10)

      注:與假手術(shù)組比較,##P<0.01;與模型組比較,**P<0.01

      組別 (g劑·k量g-/1) (n B g·NLP-/1) (n A g·NLP-/1)正常對(duì)照組 — 125.86±23.27 35.89±6.01假手術(shù)組 — 127.05±19.35 38.54±6.30模型組 — 265.57±30.72## 69.05±9.52##補(bǔ)益強(qiáng)心片低劑量組 0.18 182.72±20.27** 52.84±8.87**補(bǔ)益強(qiáng)心片中劑量組 0.36 167.48±19.33** 49.27±8.59**補(bǔ)益強(qiáng)心片高劑量組 0.72 165.81±19.22** 48.89±7.08**

      3.3 補(bǔ)益強(qiáng)心片對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響 表3、圖2顯示,與假手術(shù)組比較,模型組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.01);與模型組比較,補(bǔ)益強(qiáng)心片組其凋亡率顯著降低(P<0.01)。

      表3 各組細(xì)胞凋亡率比較,n=10)Tab.3 Comparison of cell apoptosis rates among various groupsn=10)

      表3 各組細(xì)胞凋亡率比較,n=10)Tab.3 Comparison of cell apoptosis rates among various groupsn=10)

      注:與假手術(shù)組比較,##P<0.01;與模型組比較,**P<0.01

      組別 劑量/(g·kg-1) 凋亡率/%正常對(duì)照組 — 5.23±1.11假手術(shù)組 — 6.01±1.08模型組 — 13.05±2.19##補(bǔ)益強(qiáng)心片低劑量組 0.18 10.23±2.05**補(bǔ)益強(qiáng)心片中劑量組 0.36 9.44±1.38**補(bǔ)益強(qiáng)心片高劑量組 0.72 8.19±1.03**

      3.4 補(bǔ)益強(qiáng)心片對(duì)Bcl-2、Bax、caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)的影響 表4~5、圖3 顯示,與假手術(shù)組比較,模型組Bcl-2、Bax、caspase-3 mRNA 和蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01);與模型組比較,補(bǔ)益強(qiáng)心片組Bcl-2 mRNA 和蛋白表達(dá)顯著升高,Bax、Caspase-3 mRNA 和蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.05,P<0.01)。

      表4 各組Bcl-2、Bax、caspase-3 mRNA 表達(dá)比較n=5)Tab.4 Comparison of Bcl-2,Bax and caspase-3 mRNA expressions among various groupsn=5)

      表4 各組Bcl-2、Bax、caspase-3 mRNA 表達(dá)比較n=5)Tab.4 Comparison of Bcl-2,Bax and caspase-3 mRNA expressions among various groupsn=5)

      注:與假手術(shù)組比較,##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01

      組別 劑量/(g·kg-1) Bcl-2 Bax caspase-3正常對(duì)照組 — 0.96±0.16 1.03±0.14 0.89±0.09假手術(shù)組 — 1.02±0.17 1.09±0.21 0.93±0.11模型組 — 1.21±0.18## 2.89±0.23## 3.01±0.37##補(bǔ)益強(qiáng)心片低劑量組 0.18 1.55±0.21* 1.92±0.19** 2.19±0.21**補(bǔ)益強(qiáng)心片中劑量組 0.36 2.13±0.25** 1.69±0.17** 1.95±0.28**補(bǔ)益強(qiáng)心片高劑量組 0.72 2.91±0.28** 1.51±0.15** 1.68±0.19**

      圖2 各組大鼠細(xì)胞凋亡圖Fig.2 Cell apoptosis maps of rats in various groups

      表5 各組Bcl-2、Bax、caspase-3 蛋白表達(dá)比較(n=5)Tab.5 Comparison of Bcl-2,Bax and caspase-3 protein expressions among various groups(,n=5)

      表5 各組Bcl-2、Bax、caspase-3 蛋白表達(dá)比較(n=5)Tab.5 Comparison of Bcl-2,Bax and caspase-3 protein expressions among various groups(,n=5)

      注:與假手術(shù)組比較,##P<0.01;與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01

      組別 劑量/(g·kg-1) Bcl-2 Bax caspase-3正常對(duì)照組 — 0.34±0.06 0.29±0.04 0.41±0.05假手術(shù)組 — 0.36±0.07 0.22±0.03 0.45±0.07模型組 — 0.48±0.07## 0.93±0.20## 1.09±0.15##補(bǔ)益強(qiáng)心片低劑量組 0.18 0.54±0.09 0.71±0.15** 0.79±0.11**補(bǔ)益強(qiáng)心片中劑量組 0.36 0.62±0.15* 0.66±0.12** 0.75±0.18**補(bǔ)益強(qiáng)心片高劑量組 0.72 0.71±0.13** 0.42±0.05** 0.60±0.08**

      圖3 各組大鼠心肌組織免疫印跡條帶圖Fig.3 Immunoblot band diagrams for rat myocardial tissues in various groups

      3.5 補(bǔ)益強(qiáng)心片對(duì)p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 的影響 表6、圖3 顯示,與假手術(shù)組比較,模型組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 顯著降低(P <0.01);與模型組比較,補(bǔ)益強(qiáng)心片組兩者顯著升高 (P <0.01)。

      表6 各組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 水平比較 n=5)Tab.6 Comparison of p-PI3K/PI3K and p-Akt/Akt levels among various groups,n=5)

      表6 各組p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 水平比較 n=5)Tab.6 Comparison of p-PI3K/PI3K and p-Akt/Akt levels among various groups,n=5)

      注:與假手術(shù)組比較,##P<0.01;與模型組比較,**P<0.01

      組別 (g劑·k量g-/1) p-PI3K/PI3K p-AKT/AKT正常對(duì)照組 — 0.69±0.13 0.91±0.15假手術(shù)組 — 0.65±0.18 0.93±0.20模型組 — 0.21±0.04## 0.22±0.03##補(bǔ)益強(qiáng)心片低劑量組 0.18 0.37±0.06** 0.42±0.05**補(bǔ)益強(qiáng)心片中劑量組 0.36 0.54±0.09** 0.66±0.12**補(bǔ)益強(qiáng)心片高劑量組 0.72 0.59±0.11** 0.71±0.15**

      4 討論

      導(dǎo)致慢性心力衰竭的病因很多,其中心肌梗死所致心力衰竭是重要促發(fā)因素,發(fā)生率高達(dá)32%~48%[6-7]。本實(shí)驗(yàn)采用結(jié)扎心臟左冠狀動(dòng)脈前降支的方法制備急性心肌梗死大鼠模型,4 周后測(cè)定其心功能參數(shù),發(fā)現(xiàn)心室腔擴(kuò)大,心尖區(qū)或心前壁變薄,LVEDd、LVESd 明顯升高,左室射血分?jǐn)?shù)降低至45%以下,表明造模成功[8]。補(bǔ)益強(qiáng)心片由人參、黃芪、五加皮、丹參、麥冬、葶藶子組成[2],其中人參具有大補(bǔ)元?dú)?、?fù)脈固脫之功效[9],黃芪具有益腎補(bǔ)血、泄虛補(bǔ)陽之功效,五加皮具有補(bǔ)中益精、堅(jiān)筋骨之功效,葶藶子具有行水化痰、理肝順氣之功效,給予該制劑后大鼠心室腔明顯縮小,LVEDd、LVESd 降低,射血分?jǐn)?shù)升高,表明它能改善慢性心衰大鼠心功能。

      心鈉肽(ANP)、腦鈉肽(BNP) 是心臟分泌的重要多肽類激素,在正常生理狀態(tài)下機(jī)體少量分泌,而急性心肌梗死后心肌細(xì)胞會(huì)合成釋放大量該激素,故檢測(cè)兩者水平對(duì)心力衰竭診斷、治療、預(yù)后評(píng)估至關(guān)重要[10],與慢性心衰嚴(yán)重程度密切相關(guān)[11]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),慢性心力衰竭大鼠血漿中ANP、BNP 水平高于正常組2 倍以上,;給予補(bǔ)益強(qiáng)心片后,它能在很大程度上降低兩者水平。

      PI3K-Akt 信號(hào)通路是生命活動(dòng)中的關(guān)鍵信號(hào)分子,也是許多效應(yīng)分子(如胰島素、生長因子等) 共用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,參與機(jī)體多種細(xì)胞生長、分化、凋亡等[12-13],被認(rèn)為是一條重要的內(nèi)源性心肌肥大調(diào)節(jié)通路[14],心肌梗死后缺血缺氧,誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡,平滑肌細(xì)胞異常增生,心臟正常結(jié)構(gòu)及功能極大受損;PI3K 被激活后,能使其下游信號(hào)分子Akt 磷酸化為p-Akt,轉(zhuǎn)膜至細(xì)胞核,發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)生長、維持細(xì)胞生存等功能。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),補(bǔ)益強(qiáng)心片能降低細(xì)胞凋亡率,抑制凋亡因子Bax、caspase-3 表達(dá),升高Bcl-2 表達(dá),p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt 比值升高, 表明它可激活PI3K-Akt 信號(hào)通路,抑制心衰后的心肌細(xì)胞凋亡及Bax、caspase-3 表達(dá),上調(diào)Bcl-2 表達(dá),從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用。

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