六味安消散對MFC 胃癌荷瘤小鼠的抑瘤作用

李洪清， 齊 欣

（1.內(nèi)蒙古民族大學附屬醫(yī)院消化科，內(nèi)蒙古 通遼028007；2.中國人民解放軍總醫(yī)院海南醫(yī)院消化科，海南 三亞572013）

胃癌以高發(fā)病率、高病死率、高隱匿性為主要特征，是常見的惡性腫瘤，發(fā)病率僅次于肺癌［1］，患者確診時大多為中晚期，已經(jīng)失去了最佳手術(shù)的機會；化療藥物由于嚴重的毒副作用，很多患者不能耐受，并且免疫抑制、腫瘤耐藥等因素也是限制療效的主要原因［2］，故越來越多的研究者將目光轉(zhuǎn)移到傳統(tǒng)醫(yī)學領(lǐng)域，以期找到低毒副作用、高療效的藥物。六味安消散由堿花、大黃、山柰、訶子、藏木香、寒水石6 味藥材組成，具有解痙、化積消食之功效，臨床上主要用于胃痙攣、胎衣滯留、大便秘結(jié)、胃腹脹滿、食積不化等癥狀的治療［3］，方中大黃、山柰、藏木香、寒水石具有抗腫瘤作用，而堿花、訶子具有調(diào)節(jié)免疫功能，但其抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)作用尚無報道。

MFC 細胞來源于小鼠前胃鱗癌移植瘤組織，易于培養(yǎng)，生長能力旺盛，接種至小鼠體內(nèi)后更容易形成腫瘤，是建立相關(guān)模型最常用的細胞株之一［4］。因此，本實驗以MFC 胃癌荷瘤小鼠為模型，探討六味安消散抑瘤作用及免疫調(diào)節(jié)作用，為其在胃癌治療方面的開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動物與細胞株 BalB／C 小鼠，清潔級，體質(zhì)量（20±2） g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號SYXK（京）2017-0033。小鼠胃癌MFC 細胞株由上海拜格生物公司提供。

1.2 試藥 六味安消散購于內(nèi)蒙古民族大學附屬醫(yī)院蒙藥制劑室，內(nèi)藥制字M13060034。噻唑藍（MTT） 檢測試劑盒購于美國Sigma 公司；堿性磷酸酶抗堿性磷酸酶免疫復合物（APAAP） 購于上海鈺博生物科技有限公司；CD4、CD25 單克隆抗體購于美國BD 公司；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細胞介素-2（IL-2） 檢測試劑盒購于上海紀寧生物科技有限公司。

1.3 儀器 分析天平（型號BSM-120，上海卓精電子科技有限公司）；細胞培養(yǎng)箱（型號HPX-9052MBE，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；紫外可見分光光度計（型號UV-2102PCS，美國尤尼柯公司），全自動酶標儀（型號ELx800，美國寶特公司）。

2 方法

2.1 分組及給藥 取對數(shù)生長期MFC 細胞，調(diào)整密度為2×106／mL，在小鼠右側(cè)腋下接種0.2 mL，1 周后可見米粒大小腫瘤，提示建模成功。取建模成功的小鼠60 只，隨機分為模型組、5-氟尿嘧啶組（0.02 g／kg） 及六味安消散高、中、低劑量組（8、4、2 g／kg），每組12 只，灌胃給藥，1 次／d。給藥期間，每天稱定小鼠體質(zhì)量，并觀察小鼠毛發(fā)、食欲、精神等一般狀態(tài)。

2.2 瘤重、抑瘤率及脾臟、胸腺指數(shù)測定 給藥14 d 后，頸椎脫臼處死小鼠，小心剖取腫瘤、脾臟、胸腺，磷酸鹽緩沖液沖洗殘留血跡，濾紙吸干，精密稱定質(zhì)量，計算抑瘤率及脾臟、胸腺指數(shù)。抑瘤率＝ ［ （模型組瘤重-給藥組瘤重） ／模型組瘤重］ ×100%，脾臟指數(shù)＝脾臟重／體質(zhì)量，胸腺指數(shù)＝胸腺重／體質(zhì)量。

2.3 CD4＋、CD4＋CD25＋T 細胞比例測定 取各組小鼠脾臟，去除脂肪和結(jié)締組織，剪碎，置于含10%小牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液中，過200 目細胞篩。低溫條件下加紅細胞裂解液離心，Hank’s漂洗3 次后，重懸于含10%小牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液中，APAAP 法測定細胞比例。

2.4 炎性因子水平測定 給藥14 d 后，小鼠摘眼球取血，酶聯(lián)免疫吸附（ELISA） 法檢測外周血TNF-α、IL-2 水平。

2.5 統(tǒng)計學分析 通過SPSS17.0 軟件進行處理，數(shù)據(jù)以表示，2 組間比較采用LDS-t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

表1 六味安消散對小鼠體質(zhì)量的影響n＝12）

表1 六味安消散對小鼠體質(zhì)量的影響n＝12）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 （g劑·k量g-／1） 給藥前體質(zhì)量／g給藥后模型組 — 21.75±1.32 20.90±2.04 5-氟尿嘧啶組 0.02 22.13±1.45 17.61±3.23**六味安消散高劑量組 8 22.05±1.18 26.33±3.20**六味安消散中劑量組 4 21.81±0.97 24.29±2.62**六味安消散低劑量組 2 22.26±1.24 23.68±2.71*

3.1 六味安消散對小鼠體質(zhì)量的影響 表1 顯示，給藥前各組小鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；給藥后，與模型組比較，5-氟尿嘧啶組小鼠體質(zhì)量顯著下降，而六味安消散組顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）。此外，模型組、5-氟尿嘧啶組小鼠毛發(fā)暗淡，食欲不佳，精神萎靡；六味安消散組小鼠毛發(fā)光澤，食欲佳，精神良好。

3.2 六味安消散對瘤重的影響 表2 顯示，與模型組比較，六味安消散組小鼠瘤重顯著下降（P＜0.01），并呈明顯的劑量依賴關(guān)系。

表2 六味安消散對小鼠瘤重的影響，n＝12）

表2 六味安消散對小鼠瘤重的影響，n＝12）

注：與模型組比較，**P＜0.01

組別 劑量／（g·kg-1） 瘤重／g 抑瘤率／%模型組 — 0.74±0.11 —5-氟尿嘧啶組 0.02 0.33±0.05** 55.4六味安消散高劑量組 8 0.49±0.06** 33.8六味安消散中劑量組 4 0.55±0.07** 25.6六味安消散低劑量組 2 0.58±0.06** 21.6

3.3 六味安消散對小鼠免疫器官的影響 表3 顯示，與模型組比較，5-氟尿嘧啶組脾臟、胸腺指數(shù)均有不同程度的下降（P＜0.01），而六味安消散組2 種指數(shù)顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）。

表3 六味安消散對小鼠免疫器官的影響n＝12）

表3 六味安消散對小鼠免疫器官的影響n＝12）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 劑量／（g·kg-1） 脾臟指數(shù)／（mg·g-1） 胸腺指數(shù)／（mg·g-1）模型組 — 4.75±0.61 1.75±0.22 5-氟尿嘧啶組 0.02 3.01±0.47** 1.64±0.14六味安消散高劑量組 8 6.44±0.83** 2.18±0.33**六味安消散中劑量組 4 6.23±0.65** 1.97±0.21*六味安消散低劑量組 2 5.84±0.76** 1.91±0.37*

3.4 六味安消散對CD4＋、CD4＋CD25＋T 細胞表達的影響 表4 顯示，與模型組比較，5-氟尿嘧啶組CD4＋T 細胞比例顯著降低（P＜0.01），CD4＋CD25＋T 細胞比例有所升高，但差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；六味安消散組前者比例顯著增加，后者比例顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）。

表4 六味安消散對CD4＋、CD4＋CD25＋T 細胞表達的影響n＝12）

表4 六味安消散對CD4＋、CD4＋CD25＋T 細胞表達的影響n＝12）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 劑量／（g·kg-1） CD4＋T 細胞／% CD4＋CD25＋T 細胞／%模型組 — 41.08±4.39 1.87±0.25 5-氟尿嘧啶組 0.02 35.51±4.24** 1.96±0.28六味安消散高劑量組 8 49.65±6.53** 0.95±0.17**六味安消散中劑量組 4 47.52±5.22** 1.24±0.12**六味安消散低劑量組 2 46.30±5.41* 1.61±0.20*

3.5 六味安消散對TNF-α、IL-2 水平的影響 表5 顯示，與模型組比較，5-氟尿嘧啶組TNF-α、IL-2 水平顯著下降（P＜0.01），而六味安消散組兩者水平顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。

4 討論

本實驗采用移植性腫瘤模型，它可保持機體完整性，不影響外界環(huán)境和機體的正常聯(lián)系，是評價藥物抑瘤作用及調(diào)節(jié)免疫功能的經(jīng)典模型［5］。給予MFC 胃癌荷瘤小鼠六味安消散后發(fā)現(xiàn)，小鼠一般狀態(tài)好于模型組，體質(zhì)量明顯增加，瘤重下降，提示該藥物具有較好的抗腫瘤作用。惡性腫瘤患者往往會出現(xiàn)免疫抑制情況，免疫抑制與預后、臨床分期等關(guān)系密切，故提高機體免疫功能有利于增加抗腫瘤效果。脾臟和胸腺對機體的免疫能力有標示作用，是機體細胞、體液免疫的主要器官，其臟器指數(shù)能在一定水平上評價機體免疫功能的高低［6］，本實驗發(fā)現(xiàn)六味安消散組小鼠脾臟、胸腺指數(shù)明顯增加，初步判斷六味安消散具有提高免疫功能的作用。

表5 六味安消散對TNF-α、IL-2 水平的影響（n＝12）

表5 六味安消散對TNF-α、IL-2 水平的影響（n＝12）

注：與模型組比較，**P＜0.01

組別 劑量／（g·kg-1） TNF-α／（mg·g-1） IL-2／（mg·g-1）模型組 — 62.61±8.22 97.78±13.51 5-氟尿嘧啶組 0.02 47.46±6.94** 66.61±9.67**六味安消散高劑量組 8 123.80±15.86** 137.25±16.03**六味安消散中劑量組 4 108.19±12.52** 128.44±14.50**六味安消散低劑量組 2 92.52±10.14** 119.65±11.54**

調(diào)節(jié)性T 細胞包括CD4＋T 細胞、CD4＋CD25＋T 細胞、CD8＋T 細胞、NK 細胞等多種類型，是保持機體免疫功能的重要因素［7］。其中，CD4＋T 細胞在機體免疫中起到正向調(diào)節(jié)的作用，可根據(jù)分化效應(yīng)細胞的不同分為Treg 細胞、Th1 細胞、Th2 細胞亞群，既往的研究發(fā)現(xiàn)，山慈菇多糖可通過提高S180 荷瘤小鼠免疫功能，發(fā)揮抗腫瘤作用［8］；盧曉婷等［9］報道， 胃癌、 肝癌、 食管癌等惡性腫瘤患者CD4＋CD25＋T細胞明顯多于健康者，它對機體免疫起負向調(diào)節(jié)作用，而紅景天提取物能通過降低腫瘤組織中其比例來增強機體的抗腫瘤免疫應(yīng)答效果，起到抑制小鼠Lewis 肺癌生長的作用［10］。本實驗發(fā)現(xiàn)，給予MFC 胃癌荷瘤小鼠六味安消散后CD4＋T 細胞比例明顯增加，CD4＋CD25＋T細胞比例明顯下降，進一步表明它具有增強免疫功能的作用。

TNF-α、IL-2 是由T 淋巴細胞分泌的、具有免疫調(diào)節(jié)作用的細胞因子，可反映腫瘤的生長狀況，也能體現(xiàn)腫瘤相關(guān)的免疫調(diào)節(jié)活動水平［11］。其中，TNF-α 是目前已知最強的具有抗腫瘤作用的細胞因子，在體內(nèi)外環(huán)境中表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤作用；IL-2 是細胞免疫因子網(wǎng)絡(luò)的重要成員，具有增強殺傷細胞功能、促進淋巴細胞有絲分裂、輔助抗體生成等生物學作用［12］。劉亞麗等［13］報道，銀杏酚可提升Heps 荷瘤小鼠血清中TNF-α、IL-2 水平，進而改善免疫功能抑制，最終通過提高免疫功能來發(fā)揮抗腫瘤作用；本實驗同樣證實，給予MFC 胃癌荷瘤小鼠六味安消散后2 者水平明顯增加，表明其抗腫瘤作用與增加小鼠外周血2 者水平有關(guān)。

綜上所述，六味安消散可通過提高MFC 胃癌荷瘤小鼠免疫功能來發(fā)揮抗腫瘤作用，但具體機制還有待深入研究。