干姜HPLC 指紋圖譜建立及5 種成分測定

李鵬輝， 嚴(yán) 輝*， 朱邵晴， 郭 盛， 吳啟南*， 黃勝良， 汪國強

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，國家中醫(yī)藥管理局中藥資源循環(huán)利用重點研究室，國家中藥材產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系鹽城綜合試驗站，江蘇 南京210023；2.江蘇融昱藥業(yè)有限公司，江蘇 淮安223001）

干姜為姜科植物姜Zingiber officinale Rose.的干燥根莖［1］，主產(chǎn)于四川、云南、貴州、山東等地，是我國傳統(tǒng)的中藥材［2］。干姜始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》［3］，列為中品。味辛、無毒、性熱，入脾、胃、肺經(jīng)，具有溫中散寒、回陽通脈、溫肺化飲的功效［4-6］，臨床上常用于脘腹冷痛、嘔吐泄瀉、肢冷脈微、寒飲喘咳等癥，為中醫(yī)臨床常用溫里藥［7-11］。

姜在全國范圍內(nèi)均有種植，但市場上干姜的質(zhì)量參差不齊，硫熏一直也是難以解決的問題。2015 年版《中國藥典》 中，將6-姜辣素作為干姜質(zhì)量控制的指標(biāo)性成分，但中藥的藥效是由多種成分共同作用的結(jié)果，單一的指標(biāo)成分對藥材的品質(zhì)評價存在一定的局限性，難以從整體上反映藥材的內(nèi)在質(zhì)量，中藥指紋圖譜是一種綜合的、可量化的鑒定手段，可從整體上鑒別評價中藥材以及中藥制劑半成品質(zhì)量的真實性、優(yōu)良性、穩(wěn)定性［12-14］。本研究采用HPLC 指紋圖譜結(jié)合含有量測定對不同產(chǎn)地、不同規(guī)格等級和硫熏干姜進行分析，以期更為全面、系統(tǒng)地評價干姜的質(zhì)量，為干姜的質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Waters 2695 Alliance 高效液相色譜系統(tǒng)（美國Waters 公司）；BT125 型電子分析天平（德國賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；EPED 超純水系統(tǒng)（南京易普達易科技發(fā)展有限公司）；KH5200B 型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）；D2012 高速臺式離心機（大龍興創(chuàng)實驗儀器北京有限公司）；BJ-150 型高速多功能粉碎機（浙江德清拜杰電器有限公司）。

1.2 試 藥 6-姜 酚 （6-JF20161004）、 8-姜 酚 （8-JF20161223）、10-姜 酚 （10-JF20170201）、 6-姜 烯 酚 （6-JXF20170111） 均購自南京春秋生物有限公司，含有量≥98%；（E） -β-金合歡烯（DSH1499，日本和光純藥工業(yè)株式會社）；乙腈（色譜純，美國Tedia 公司）；甲醇（HPLC專用，山東禹王實業(yè)有限公司化工分公司）。

1.3 材料 2017 年4 月從云南省羅平縣小黃姜交易市場收集到來自云南、貴州、廣西的鮮姜6 份，以及云南省羅平縣硫熏干姜藥材10 份；2017 年5 月收集到來自四川省犍為縣的筠姜藥材1 份；從成都荷花池中藥材交易市場購買到產(chǎn)自四川省宜賓市的筠姜藥材1 份以及川產(chǎn)粉姜藥材1份；從亳州市場購得緬甸姜1 份和山東姜2 份，并通過云南省農(nóng)業(yè)局收集到來自云南省羅平縣的干姜藥材6 份。各樣品等級均按照干姜商品規(guī)格等級標(biāo)準(zhǔn)，主要依據(jù)其質(zhì)量量和個頭進行劃分。所有樣品經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)嚴(yán)輝副教授鑒定為正品，信息見表1。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Waters SymmetryShieldTMRP18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈（A） -水（B），梯度洗脫（0 ～30 min，35%～70%A；30 ～50 min，70%～90%A；50 ～60 min，90%A）；體積流量1 mL／min；柱溫30 ℃；進樣量20 μL。色譜圖見圖1。

圖1 各成分HPLC 色譜圖

2.2 混合對照品溶液制備 精密稱取6-姜酚、8-姜酚、6-姜烯酚、10-姜酚、 （E）-β-金合歡烯對照品適量，置于10 mL量瓶中，加75%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成質(zhì)量濃度分別為0.212、0.087、0.219、0.146、0.265 mg／mL的對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備 取本品粉末（過3 號篩） 約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加入75%甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理40 min，取出，放冷，再稱定質(zhì)量，用75%甲醇補足減失質(zhì)量，提取液經(jīng)13 000 r／min 條件下離心10 min，上清液過0.45 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 將“2.2” 項下溶液分別稀釋2、4、8、16、32、64 倍，在“2.1” 項色譜條件下進樣，以各對照品峰面積為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），進行回歸，結(jié)果見表2。表明各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系

2.4.2 精密度試驗 取“2.2” 項下溶液，在“2.1” 項色譜條件下連續(xù)進樣6 次，每次進樣20 μL，記錄色譜圖，測得各對照品的保留時間和峰面積RSD 值均小于2.13%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下，分別于0、2、4、8、12 h 進樣。測得各待測成分的保留時間和峰面積RSD 值均小于1.66%，表明供試品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗 取同一干姜樣品5 份，按“2.3” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣，測得各待測成分保留時間和峰面積RSD 均小于1.92%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗 精密稱定已知含有量的樣品粉末9 份，每3 份為1 組，分別加入樣品中各成分含有量的80%、100%、120%3 個水平的對照品溶液，按“2.3” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣。測得各待測成分平均加樣回收率97.47%～102.36%，RSD 均小于1.97%。

2.5 樣品含有量測定 取28 批干姜樣品，按“2.3” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣，檢測波長280 nm，結(jié)果見表3。

數(shù)據(jù)顯示，不同產(chǎn)地干姜的多元成分含有量具有一定的差異性，以云南丘北縣和貴州盤縣所產(chǎn)干姜各成分含有量相對較高；S7 ～S12 樣品各等級之間成分含有量差別較小，可認(rèn)為干姜多元成分含有量與等級之間并無明顯的關(guān)聯(lián)性；S19～S23 樣品中6-姜烯酚含有量明顯低于其他干姜，暗示硫熏過程可能對6-姜烯酚進行了分解轉(zhuǎn)化，由于測定的化合物有限，所以硫熏對干姜成分的影響有待進一步的探討；姜絲（S24） 和姜片（S26～S28） 中（E） -β-金合歡烯含有量相對較低，姜皮（S25） 中6-姜酚和10-姜酚含有量相對較高。

表3 各成分含有量測定結(jié)果（%）

2.6 指紋圖譜建立及質(zhì)量評價

2.6.1 指紋圖譜建立 分別取28 批干姜樣品按“2.3” 項下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項色譜條件下進樣，檢測波長240 nm，所得色譜圖導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A 版，采用中位數(shù)法，時間寬度0.1 min，自動匹配生成28 批干姜樣品的指紋圖譜和對照圖譜，結(jié)果見圖2～3。

圖2 28 批樣品HPLC 指紋圖譜

2.6.2 色譜峰歸屬 通過數(shù)據(jù)匹配，共可以獲得24 個共有峰，同時和混合對照品圖譜進行比較，發(fā)現(xiàn)其中5 個共有峰分別為6-姜酚（1 號峰）、8-姜酚（2 號峰）、6-姜烯酚（3 號峰）、10-姜酚（4 號峰） 和（E） -β-金合歡烯（9 號峰）。選擇色譜峰峰度相對較大，且分離度較好的共有峰（峰1～峰12） 作為干姜的特征峰，且以峰1（6-姜酚） 作為參照峰（S），各批樣品特征峰相對保留時間RSD 均小于0.12%，相對峰面積RSD 較大，結(jié)果見表3，特征峰的峰面積占各樣品所有峰峰面積總和（除前5 min 出現(xiàn)的溶劑峰）的比例超過92%。

圖3 干姜HPLC 對照圖譜

2.6.3 相似度分析 中藥指紋圖譜是一種可量化的，綜合的鑒定手段，可從整體上評價中藥材以及中藥制劑半成品質(zhì)量的優(yōu)良性和穩(wěn)定性。利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A 版對28 批干姜樣品進行相似度計算，見表4。結(jié)果顯示，自制干姜藥材相似度0.951 ～0.996，相似度整體較高，表明標(biāo)準(zhǔn)化自制所得干姜較穩(wěn)定、規(guī)范；就產(chǎn)地而言，云南 （S10）、 山 東 （S17）、 四 川 （S14） 和 緬 甸（S18） 所產(chǎn)干姜相似度差別較大，可認(rèn)為不同產(chǎn)地干姜質(zhì)量有一定的差異；就等級而言，干姜藥材商品規(guī)格等級與相似度之間并無明顯的關(guān)聯(lián)性；硫熏干姜（S19 ～S23） 的相似度0.846～0.878，與無硫干姜相似度差異較大，可認(rèn)為硫熏對干姜的質(zhì)量具有一定的影響；姜絲（S24）、姜皮（S225）、姜片（S25） 和姜塊（S12） 相似度之間差別較大，可認(rèn)為不同規(guī)格干姜之間差異較大。

表4 28 批樣品相似度

2.6.4 聚類分析 將28 批干姜樣品的12 個特征峰的峰面積導(dǎo)入SPSS.21 進行聚類分析，聚類方法采用組間連接法，距離度采用歐式距離，分析得到的樣品聚類樹狀圖見圖4。

聚類分析圖反映的是各樣品間的相似程度，樣品間的分類距離越大則樣品間的差異越明顯。結(jié)果表明，緬甸（S18）、云南（S10）、四川（S14） 和山東（S17） 所產(chǎn)干姜距離較遠，暗示不同產(chǎn)地干姜質(zhì)量有一定的差異，這與相似度分析結(jié)果一致；當(dāng)干姜樣品分為3 類時，硫熏干姜分為Ⅰ類，表明硫熏干姜和無硫干姜具有較大差異，可認(rèn)為硫熏對干姜品質(zhì)具有顯著影響，此結(jié)果與指紋圖譜相似度分析結(jié)果一致；姜絲、姜皮和姜片分為Ⅱ類，表明姜絲、姜皮、姜片與姜塊的差異性較大，與相似度分析結(jié)果一致。其他無硫姜塊分為Ⅲ類，當(dāng)歐式距離為3 時，S1～S12 聚為一類，表明其整體較為一致。

圖4 28 批樣品聚類樹狀圖

2.6.5 主成分分析 將28 批干姜樣品的12 個特征峰的峰面積導(dǎo)入SPSS.21 進行主成分分析，得到相關(guān)矩陣的特征值及方差貢獻率、主成分載荷矩陣，結(jié)果見表5 ～6。以主成分特征值大于1 為基準(zhǔn)，前3 個特征值大于1 且累積貢獻率達90.962%，表明前3 個主成分能夠客觀、全面地反映干姜樣品的內(nèi)在品質(zhì)，故選取前3 個主成分進行分析。

表5 主成分的初始特征值和貢獻率

表6 樣品因子載荷矩陣

主成分各因子載荷系數(shù)綜合反映了各成分對主成分的影響，結(jié)果顯示，第一主成分的特征值6.139，累計方差貢獻率達51.159%，主要代表了峰12、 （E） -β-金合歡烯、峰10、10-姜酚、峰8、6-姜烯酚、8 姜酚、峰2、峰3 共9個特征峰的信息；第二主成分的特征值3.549，累計方差貢獻率達80.734%，主要代表了峰2、峰3、8-姜酚、6-姜烯酚、峰8、峰10 共6 個特征峰的信息；第三主成分的特征值1.227，累計方差貢獻率達90.962%，主要代表了峰9、6-姜酚、8 姜酚、10 姜酚、峰7 共5 個特征峰的信息；以3 個主成分各個特征峰因子得分為坐標(biāo)，得到28 批干姜樣品的散點圖，見圖5。由圖可以看出，硫熏干姜樣品（S19～S23） 聚集在一塊，其與無硫干姜樣品距離較遠，可認(rèn)為硫熏對干姜內(nèi)在品質(zhì)具有一定影響，與相似度和聚類分析結(jié)果一致；姜片、姜皮、姜絲整體較為接近，與相似度分析結(jié)果一致；不同產(chǎn)地干姜距離相對較遠，可認(rèn)為生境特征對干姜的質(zhì)量具有一定的影響。

圖5 主成分分析散點圖

2.6.6 硫熏影響 由于測定的化合物數(shù)量有限，難以準(zhǔn)確分析硫熏對干姜的影響，指紋圖譜可以從整理上分析其原理，見圖6，對比硫熏干姜和無硫干姜，無硫干姜的5 號峰（6-姜烯酚） 峰面積明顯比硫熏干姜大，而2、3 號峰峰面積則明顯小于硫熏干姜，9 號峰峰面積也小于硫熏干姜，初步推測干姜經(jīng)歷硫熏之后，將6-姜烯酚轉(zhuǎn)化分解為2、3、9 號峰的化合物。

圖6 硫熏與無硫樣品HPLC 指紋圖譜

3 討論與結(jié)論

3.1 波長選擇 在檢測波長的選擇上，分別比較了220、240、280 nm 下色譜圖中峰數(shù)、峰形等的變化，結(jié)果顯示以檢測波長240 nm 所得色譜圖中溶劑峰相對較小，峰數(shù)目相對較多，峰面積較大，故選擇240 nm 為檢測波長。

3.2 提取溶劑與方法選擇 分別比較25%、50%、75%、100%甲醇對干姜色譜圖基線及峰數(shù)等的影響，結(jié)果顯示以75%甲醇對干姜藥材中多數(shù)成分提取效率較高，色譜峰的數(shù)目較多，且基線平滑，故選擇75%甲醇為提取溶劑。同時比較了超聲提取20、40、60 min 對色譜圖的影響，結(jié)果顯示，不同超聲提取時間對色譜圖均無顯著影響，超聲提取40、60 min 對各代表性色譜峰峰面積未見顯著差異。最終確定為75%甲醇，超聲提取40 min。

3.3 色譜條件考察 分別考察了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸溶液3 組流動相，結(jié)果表明，乙腈-水所得色譜峰形及分離度均較好，且考慮色譜柱使用壽命，故選擇乙腈-水為流動相，梯度洗脫。

3.4 色譜柱與柱溫選擇 分別對不同柱溫 （28、30、32 ℃） 和不同品牌的色譜柱進行考察，結(jié)果顯示，色譜柱溫度輕微變化，色譜圖整體特征未發(fā)生顯著變化。因此，小幅變動色譜柱溫度，不會影響色譜整體特征。而不同色譜柱對色譜整體特征影響較大， 其中 Waters SymmetryShieldTMRP18色譜柱與Alltima C18色譜柱形成的色譜圖整體特征相似一些，而phenomenonex Luna C18所呈現(xiàn)的色譜峰形較差，因此應(yīng)固定色譜柱型號。

選取的特征峰相對峰面積RSD 較大，表明不同產(chǎn)地不同批次的干姜個體各成分存在一定差異，這可能與藥材自身生長的土壤、氣候、降水量等環(huán)境因素及藥材的采收加工有關(guān)，但指紋圖譜是從整體上辨識樣品，之間的差異并未影響到干姜指紋圖譜整體的相似性。本研究選擇干姜指紋圖譜中的12 個共有特征峰作為指標(biāo)，進行主成分分析，更加全面系統(tǒng)的對不同產(chǎn)地干姜的質(zhì)量進行評價分析，比僅以6-姜辣素作為指標(biāo)性成分當(dāng)作評價標(biāo)準(zhǔn)更加全面。硫熏干姜對干姜的質(zhì)量影響較明顯，對比指紋圖譜發(fā)現(xiàn)，硫熏干姜的6-姜烯酚含有量明顯較低，推測可能對6-姜烯酚進行了分解轉(zhuǎn)化，具體情況有待進一步探討。本實驗采用指紋圖譜結(jié)合含有量測定對不同產(chǎn)地、不同規(guī)格等級干姜進行品質(zhì)評價，能夠有效的區(qū)分硫熏干姜，為其質(zhì)量控制提供可靠簡便的方法。然干姜指紋圖譜中還有許多尚不明確的成分，有待進一步研究，同時硫熏對干姜的影響仍有待進一步探討。