組培脫毒嘉定白蒜原原種生產(chǎn)的技術(shù)關(guān)鍵點(diǎn)試驗(yàn)研究

趙 碩 黃丹楓* 高 暢 楊 飛 趙穎雷 郟穎杰 郟惠彪

（1上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240；2上海蔬菜研究所，上海 201899；3上海惠和種業(yè)有限公司，上海 201899）

嘉定白蒜（Aillum sativumL.）是我國著名的大蒜品種之一，已有近百年的種植歷史，以其色澤潔白，蒜頭肥大，鱗芽6～8瓣，肉質(zhì)脆嫩，辣味濃烈，貯藏性好而著稱，已被國外許多國家作為貴重藥品、滋補(bǔ)飲料、保健食品以及美容化妝品的制作原料。嘉定白蒜在國際市場上享有盛譽(yù)，特別是其種蒜在國際市場上一直有較強(qiáng)的競爭力，需求旺盛（薛友英，1999；李賢 等，2018；高暢 等，2019）。

大蒜雖然種質(zhì)資源豐富，但由于其花器官不能正常進(jìn)行減數(shù)分裂（彭愛芳 等，2014），無法形成可育的種子，因此在生產(chǎn)實(shí)踐中主要采用前一年收獲的鱗莖（蒜瓣）作為營養(yǎng)體繁殖播種，但鱗莖同時(shí)又是大蒜的產(chǎn)品器官，病毒極易通過其積累和傳播（陳世儒和黃菊輝，1991；杜永芹 等，2004；高暉和王振英，2017）。采用組織培養(yǎng)的方法可以有效脫除大蒜主要病毒（李賢 等，2018），還可以解決因連年種植大蒜而造成的種性退化等問題，提高繁殖系數(shù)，達(dá)到高效、增產(chǎn)的目的（王學(xué)利 等，2002；高暢 等，2019）。為了最終實(shí)現(xiàn)大蒜脫毒種苗產(chǎn)業(yè)化的目標(biāo)，還需要對(duì)脫毒后的組培苗或組培鱗莖培育成大蒜原原種（嘉定白蒜經(jīng)組培脫毒后以組培苗或組培鱗莖的形式進(jìn)入田間繁育，生產(chǎn)上將一代稱為原原種，二代稱為原種，三代稱為生產(chǎn)種）的關(guān)鍵技術(shù)開展研究，分析大蒜組培脫毒后原原種繁育的影響因素以及脫毒種蒜生產(chǎn)的技術(shù)關(guān)鍵點(diǎn)。

本試驗(yàn)以脫毒嘉定白蒜為試材，重點(diǎn)研究了水肥供給對(duì)組培苗和組培鱗莖的大蒜苗長勢及原原種質(zhì)量的影響，同時(shí)研究了繼代次數(shù)和組培鱗莖播期對(duì)原原種質(zhì)量的影響，然后進(jìn)行了脫毒原種和常規(guī)出口蒜種的生產(chǎn)比較試驗(yàn)，以期為實(shí)現(xiàn)嘉定白蒜脫毒種苗的產(chǎn)業(yè)化提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

本試驗(yàn)中的脫毒組培苗、鱗莖等所用品種均為嘉定白蒜，由上海惠和種業(yè)有限公司提供。

1.1 水肥供給試驗(yàn)

1.1.1 試驗(yàn)材料 篩選獲得相近規(guī)格的組培苗：具有3片以上綠葉，莖粗2.5～3.5 cm；篩選獲得相近規(guī)格的組培鱗莖：直徑0.5～0.8 cm。

1.1.2 試驗(yàn)方法和測定項(xiàng)目 采用四因素兩水平完全區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)。每個(gè)處理1個(gè)穴盤，5次重復(fù)，脫毒組培苗與組培鱗莖各820株。田間處理組合與編號(hào)如表1所示。

表1 試驗(yàn)處理組合與編號(hào)

試驗(yàn)在上?；莺头N業(yè)有限公司連棟溫室中進(jìn)行。使用潮汐式肥水一體化灌溉系統(tǒng)進(jìn)行育苗水肥的精準(zhǔn)控制。補(bǔ)水頻次通過盤重控制，潮汐式灌溉液面高度3 cm，記錄灌溉日期。使用水溶肥（上海永通化工公司生產(chǎn)的花無缺大量元素水溶肥：總氮20%，水溶性磷20%，水溶性鉀20%）配制營養(yǎng)液，EC值控制在1.2～1.8 mS·cm-1，補(bǔ)肥時(shí)人工定量澆灌，不施肥的處理同時(shí)澆清水。

2018年4月3日將試驗(yàn)材料移栽至穴盤并擺入苗床，于4月17日、5月2日、5月17日每盤隨機(jī)取5株，用直尺測定株高，以植株地上部分垂直高度為株高，在距地面2 cm處用游標(biāo)卡尺測定假莖粗。6月27日精準(zhǔn)收獲全部鱗莖，測定鱗莖的鮮質(zhì)量。

1.2 繼代次數(shù)試驗(yàn)

1.2.1 試驗(yàn)材料 8代和15代組培鱗莖，直徑0.8～1.0 cm。

1.2.2 試驗(yàn)方法和測定項(xiàng)目 采用完全區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，3次重復(fù)，每次重復(fù)包括2個(gè)穴盤，共移栽組培鱗莖600株。試驗(yàn)在上海惠和種業(yè)有限公司青岡基地塑料大棚中進(jìn)行。分別將8代和15代組培鱗莖在4～10 ℃低溫條件下處理20 d，然后于2018年10月13日播于50孔穴盤中，將品氏泥炭、珍珠巖和蛭石按照7∶2∶1的體積比混拌成育苗基質(zhì)，并在育苗基質(zhì)中加入10%的有機(jī)肥。

2019年3月3日、4月2日、5月2日分別統(tǒng)計(jì)腋芽生長現(xiàn)象（次生生長）發(fā)生的比例，計(jì)算次生生長率，同時(shí)每盤隨機(jī)取5株分別統(tǒng)計(jì)總?cè)~片數(shù)和綠葉數(shù)（綠葉數(shù)為總?cè)~片數(shù)減去干枯葉片數(shù)），測定株高、假莖粗、全株以及鱗莖的干鮮質(zhì)量，將樣品置于105 ℃烘箱中烘20 min，然后烘箱溫度調(diào)至80 ℃將樣品烘至恒重測定干質(zhì)量。

其中，全部植株數(shù)為長成的植株數(shù)，部分穴孔的鱗莖未長成大蒜苗則未計(jì)入。

2019年5月20日精準(zhǔn)收獲全部鱗莖，分別測定各處理鱗莖的直徑和干鮮質(zhì)量，并統(tǒng)計(jì)全部鱗莖中正常分瓣、次生分瓣以及獨(dú)頭蒜現(xiàn)象的比例。

1.3 組培鱗莖播期試驗(yàn)

1.3.1 試驗(yàn)材料 8代組培鱗莖，直徑0.6～0.8 cm。

1.3.2 試驗(yàn)方法和測定項(xiàng)目 采用完全區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，3次重復(fù)，每次重復(fù)包括2個(gè)穴盤，共移栽組培鱗莖1 200株。試驗(yàn)在上海惠和種業(yè)有限公司青岡基地塑料大棚中進(jìn)行。組培鱗莖先在4～10 ℃低溫條件下處理20 d，然后分別于2018年9月28日、10月13日、10月28日、11月12日播于50孔穴盤中，將品氏泥炭、珍珠巖以及蛭石按照7∶2∶1的體積比混拌成育苗基質(zhì)，在育苗基質(zhì)中加入10%的有機(jī)肥。2019年5月20日統(tǒng)計(jì)次生生長發(fā)生的比例，并精準(zhǔn)收獲全部鱗莖，分別測定各處理鱗莖的干鮮質(zhì)量和直徑，并統(tǒng)計(jì)全部鱗莖中正常分瓣、次生分瓣以及獨(dú)頭蒜現(xiàn)象的比例。

1.4 原種生產(chǎn)的商品性比較試驗(yàn)

1.4.1 試驗(yàn)材料 常規(guī)大蒜種：常規(guī)用于出口的蒜種，單瓣質(zhì)量≥5 g；脫毒大蒜原種：單瓣質(zhì)量≥5 g；脫毒大蒜原原種：單瓣質(zhì)量≥5 g。

1.4.2 試驗(yàn)方法和測定項(xiàng)目 不同處理一次重復(fù)包含60株樣本，3次重復(fù)，共移栽540株。試驗(yàn)在上海惠和種業(yè)有限公司青岡基地塑料大棚中進(jìn)行。試驗(yàn)地每667 m2施加有機(jī)肥1 000 kg，2018年9月26日播種。分別于2018年12月5日和2019年1月4日、2月3日、3月5日、4月4日，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取5株分別統(tǒng)計(jì)總?cè)~片數(shù)和綠葉數(shù)、株高、假莖粗，4月5日（抽蒜薹之前）每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取5株統(tǒng)計(jì)鱗莖分瓣數(shù)并測定全株和鱗莖的干鮮質(zhì)量；5月20日收獲后每個(gè)重復(fù)隨機(jī)取5株統(tǒng)計(jì)大蒜鱗莖的分瓣數(shù)、直徑以及干鮮質(zhì)量。

1.5 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 19.0軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)并進(jìn)行差異顯著性分析，處理間均值多重比較利用Duncan’s新復(fù)極差法，采用Excel 2016軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理。

2 結(jié)果與分析

2.1 水肥供給對(duì)大蒜苗生長及原原種鱗莖質(zhì)量的影響

由表2和表3可見，不同組織類型培育的大蒜苗在生長上表現(xiàn)出顯著的差異，穴盤規(guī)格、灌溉時(shí)間以及補(bǔ)肥間隔也均對(duì)原原種鱗莖鮮質(zhì)量有顯著影響，其中灌溉時(shí)間和補(bǔ)肥間隔對(duì)4月17日統(tǒng)計(jì)的株高也有顯著影響。由表2可見，組培鱗莖獲得原原種的鱗莖鮮質(zhì)量均顯著高于組培苗，在其他因素一致的情況下，穴盤孔徑為32孔的T1、T2、T3、T4、T9、T11、T12處理獲得的原原種鱗莖鮮質(zhì)量分別顯著高于50孔的T5、T6、T7、T8、T13、T15、T16處理；灌溉時(shí)間為30 min的T7、T12、T16處理獲得的原原種鱗莖鮮質(zhì)量分別顯著高于灌溉時(shí)間為10 min的T5、T10、T14處理；補(bǔ)肥間隔為7 d的T7、T9處理獲得的原原種鱗莖鮮質(zhì)量分別顯著高于補(bǔ)肥間隔為14 d的T8、T10處理。原原種鱗莖鮮質(zhì)量較大的處理為T9、T11、T12處理，由于T12處理和T9、T11處理相比更加節(jié)肥，所以，選擇T12處理（組織類型為組培鱗莖、32孔穴盤、灌溉時(shí)間30 min、補(bǔ)肥間隔14 d）為最佳組合。

表2 水肥供給對(duì)兩種組織類型大蒜苗生長及原原種鱗莖質(zhì)量的影響

表3 處理因素對(duì)大蒜生長指標(biāo)影響的顯著值

2.2 繼代次數(shù)對(duì)大蒜苗生長及原原種鱗莖質(zhì)量的影響

由表4可見，從3次統(tǒng)計(jì)的株高、假莖粗、總?cè)~片數(shù)、綠葉數(shù)以及干鮮質(zhì)量等生長指標(biāo)來看，3月3日統(tǒng)計(jì)的15代組培鱗莖的全株鮮質(zhì)量、鱗莖鮮質(zhì)量、全株干質(zhì)量和鱗莖干質(zhì)量分別比8代組培鱗莖低17%、24%、27%和27%，差異顯著；而4月2日統(tǒng)計(jì)的指標(biāo)在處理間差異不顯著；5月2日最后一次統(tǒng)計(jì)的15代組培鱗莖的株高、全株鮮質(zhì)量及全株干質(zhì)量均顯著低于8代組培鱗莖，分別低13%、13%和20%。2種繼代次數(shù)組培鱗莖的次生生長率在3次統(tǒng)計(jì)中差異均不顯著。

由表5可見，15代組培鱗莖獲得的原原種鱗莖中正常分瓣比例和獨(dú)頭蒜比例顯著高于8代組培鱗莖，分別高11.34、10.66個(gè)百分點(diǎn)；次生分瓣比例則顯著低于8代組培鱗莖，比8代組培鱗莖低22.33個(gè)百分點(diǎn)。

2.3 組培鱗莖播期對(duì)大蒜原原種鱗莖質(zhì)量的影響

由表6可見，組培鱗莖播期對(duì)次生生長率有顯著影響，次生生長率隨著播期的延后呈下降趨勢。9月28日播種的次生生長率顯著高于其他3個(gè)播期，11月12日播種的次生生長率最低，分別比其他3個(gè)播期低22.00、11.66、5.00個(gè)百分點(diǎn)。不同播期也對(duì)原原種鱗莖質(zhì)量產(chǎn)生了顯著影響，9月28日和10月13日播種得到原原種的鱗莖干鮮質(zhì)量以及直徑均顯著高于后播的10月28日和11月12日2個(gè)處理，且原原種鱗莖中正常分瓣的比例顯著低于后播的2個(gè)處理，11月12日播種得到的原原種中正常分瓣的比例比9月28日高出5.50個(gè)百分點(diǎn)，次生分瓣比例則比9月28日低11.98個(gè)百分點(diǎn)。

2.4 脫毒原種生產(chǎn)的商品性比較試驗(yàn)

由表7可見，在5次田間統(tǒng)計(jì)中，脫毒大蒜原種和原原種的株高、假莖粗、總?cè)~片數(shù)和綠葉數(shù)均顯著高于常規(guī)大蒜種。由表8可見，抽薹前（4月5日）統(tǒng)計(jì)的脫毒大蒜原種和原原種的全株干鮮質(zhì)量、鱗莖的干鮮質(zhì)量、分瓣數(shù)也顯著高于常規(guī)大蒜種，以脫毒大蒜原原種為例，其全株鮮質(zhì)量、鱗莖鮮質(zhì)量、全株干質(zhì)量、鱗莖干質(zhì)量、分瓣數(shù)分別比常規(guī)大蒜種高出49%、38%、85%、38%、127%。

由表9可見，5月20日收獲時(shí)統(tǒng)計(jì)的脫毒大蒜原種和脫毒大蒜原原種的鱗莖干鮮質(zhì)量以及直徑均顯著高于常規(guī)大蒜種，以脫毒大蒜原原種為例，其獲得的鱗莖的鮮質(zhì)量、干質(zhì)量以及直徑分別比常規(guī)大蒜種高出86%、124%和30%，而脫毒大蒜原種最終得到鱗莖的分瓣數(shù)顯著低于常規(guī)大蒜種。

表4 繼代次數(shù)對(duì)大蒜苗生長的影響

表5 繼代次數(shù)對(duì)大蒜原原種鱗莖質(zhì)量的影響

表6 不同播期對(duì)大蒜苗次生生長及原原種鱗莖質(zhì)量的影響

表7 不同蒜種類型對(duì)大蒜苗生長的影響

表8 不同蒜種類型對(duì)抽薹前大蒜苗生長和鱗莖質(zhì)量的影響

表9 不同蒜種類型對(duì)收獲鱗莖質(zhì)量的影響

3 討論與結(jié)論

大蒜生產(chǎn)受水分、肥料的影響較大（王飛 等，2017），穴盤規(guī)格、灌溉時(shí)間和補(bǔ)肥間隔都影響著大蒜生長的水肥供給狀況。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)32孔穴盤比50孔穴盤更有利于原原種鱗莖鮮質(zhì)量的提高。在工廠化育苗過程中，穴盤的選擇應(yīng)從生產(chǎn)管理、經(jīng)濟(jì)效益、作物特性和生長發(fā)育等方面加以綜合考慮（Styer &Koranski，1997），從本試驗(yàn)結(jié)果來看，2種組織類型中最終獲得原原種鱗莖鮮質(zhì)量最大的處理均出現(xiàn)在32孔穴盤，鱗莖的質(zhì)量相對(duì)大更符合生產(chǎn)的要求，因此，在大蒜原原種繁育過程中可以選擇孔徑相對(duì)大的穴盤。本試驗(yàn)結(jié)果表明，較短的補(bǔ)肥間隔和較長的灌溉時(shí)間有利于原原種鱗莖質(zhì)量的提高。有研究表明適當(dāng)提高追肥頻率可以使施肥量在作物生長期內(nèi)分布更加均勻，持續(xù)為作物提供營養(yǎng)（陳高聽，2016），而潮汐灌溉過程中較長的灌溉時(shí)間能夠促進(jìn)幼苗的生長（高艷明 等，2016）。

繼代培養(yǎng)是植物組織培養(yǎng)過程中的重要環(huán)節(jié)，也是離體保存種質(zhì)資源的必要手段（齊靜靜 等，2014）。前人研究認(rèn)為，影響植物離體快繁的因素除了培養(yǎng)條件、外植體類型外，繼代次數(shù)也是一個(gè)重要因素（Duncan，1996）。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，15代組培大蒜鱗莖在3月3日和5月2日測定的部分生長指標(biāo)（全株鮮質(zhì)量、全株干質(zhì)量）要顯著低于8代組培鱗莖，這和前人的研究結(jié)果類似。李招文等（1989）研究發(fā)現(xiàn)黃蝦花試管苗在第1、2代生長正常，而第3代后試管苗生長矮小、細(xì)弱、分化率逐步下降；齊靜靜等（2014）研究發(fā)現(xiàn)，第3代除蟲菊組培苗總體植株生長健壯，而第5代組培苗則表現(xiàn)出了枝葉纖細(xì)和生長緩慢現(xiàn)象。在本試驗(yàn)中，15代組培鱗莖獲得原原種的正常分瓣比例顯著高于8代組培鱗莖，而次生分瓣的比例則顯著低于8代組培鱗莖。次生分瓣主要是由于大蒜的次生生長造成的，這可能是由于8代組培鱗莖長勢旺盛，伴隨著次生生長現(xiàn)象的多發(fā)從而導(dǎo)致了鱗莖次生分瓣比例增加。通過綜合比較，15代組培鱗莖盡管長勢弱于8代組培鱗莖，但是次生分瓣比例低，且獲得的原原種鱗莖干鮮質(zhì)量和8代組培鱗莖差異不顯著，所以在脫毒嘉定白蒜原原種繁育中推薦使用15代組培鱗莖。

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)不同播期對(duì)大蒜的次生生長率產(chǎn)生了顯著影響。次生生長是大蒜的生理畸形現(xiàn)象，會(huì)導(dǎo)致大蒜鱗莖的次生分瓣，在我國南、北各地均有不同程度的發(fā)生（陸幗一 等，1992）。大蒜次生生長發(fā)生的影響因素可歸結(jié)為環(huán)境因子、栽培措施及遺傳特性3個(gè)方面（陳廣平，2008）。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)次生生長率隨著播期的延后呈下降趨勢，且相對(duì)晚播（10月28日和11月12日）得到的原原種鱗莖中正常分瓣比例也要顯著高于相對(duì)早播（9月28日和10月13日）的處理。程智慧和陸幗一（1991）在對(duì)蒼山蒜的研究中也發(fā)現(xiàn)早播造成了次生生長的增加，但是有利于大蒜的初級(jí)生長和產(chǎn)量的提高。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)相對(duì)早播的2個(gè)處理得到的原原種鱗莖的干鮮質(zhì)量及直徑都要顯著高于相對(duì)晚播的2個(gè)處理。已有研究指出，大蒜早播，冬前積溫高，大蒜生育進(jìn)程加快，植株個(gè)體大，為花鱗芽的提早分化創(chuàng)造了物質(zhì)條件，一定程度上有利于后期產(chǎn)量提高，但是同時(shí)也為大蒜發(fā)生次生生長創(chuàng)造了條件（嚴(yán)根元 等，1990）。因此推薦將嘉定白蒜的播期定于每年10月中下旬，此時(shí)播種有助于獲得較高的產(chǎn)量，且可以減少大蒜次生生長現(xiàn)象的發(fā)生，從而提高收獲大蒜中正常分瓣的比率。

國際市場對(duì)大蒜鱗莖有外形完整、皮色潔白、無霉變、無蟲蛀以及含水量低等標(biāo)準(zhǔn)，這就對(duì)大蒜的鱗莖生產(chǎn)提出了更高的質(zhì)量要求（陳廣平，2008）。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)脫毒大蒜原種和原原種在生長期的各項(xiàng)生長指標(biāo)以及收獲得到的鱗莖質(zhì)量均顯著好于常規(guī)大蒜種，這和前人的研究結(jié)果一致。周緒元等（2003）研究發(fā)現(xiàn)脫毒的3個(gè)蒼山大蒜品種的蒜頭產(chǎn)量均比未脫毒對(duì)照顯著增產(chǎn)，且脫毒大蒜蒜頭的經(jīng)濟(jì)性狀表現(xiàn)優(yōu)于對(duì)照。徐培文（1998）也發(fā)現(xiàn)脫毒蒜生長繁茂，蒜頭平均增產(chǎn)32%～78%。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，水肥供給、繼代次數(shù)以及播期均對(duì)嘉定白蒜原原種的鱗莖質(zhì)量有顯著影響。通過水肥供給試驗(yàn)篩選出了最佳處理組合：組織類型為組培鱗莖、32孔穴盤、灌溉時(shí)間30 min、補(bǔ)肥間隔14 d；繼代次數(shù)試驗(yàn)表明，15代組培鱗莖相比8代組培鱗莖更適合用于嘉定白蒜原原種繁育；將嘉定白蒜的播期定于每年10月中下旬更有利于獲得較高的收益。通過生產(chǎn)比較試驗(yàn)，脫毒大蒜種相比常規(guī)大蒜種在生產(chǎn)上均表現(xiàn)出突出的優(yōu)勢。