譚偉源 陳軍平 宋若愚 陳詩迪

遵義醫(yī)科大學第五附屬(珠海)醫(yī)院骨二科，廣東 珠海 519100

糖尿病性骨質疏松(diabetic osteoporosis，DOP)是繼發(fā)性骨質疏松癥的一種，亦是糖尿病嚴重的骨骼并發(fā)癥[1]，是因糖尿病所并發(fā)的骨量減少、骨組織微結構異常、骨脆性增加并且易發(fā)生骨折的一種全身性、代謝性骨病[2]。有研究指出，糖尿病患者中合并有骨質疏松的比例可達50%以上[3]。DOP的發(fā)病率呈逐年上升趨勢，其高致殘率大大降低患者的生活質量，同時也帶來極大的社會經(jīng)濟負擔[4]。目前DOP的治療主要以控制血糖及抗骨質疏松治療為主，尋求更有效的、專門針對DOP的治療方法是目前DOP研究的重點[5]。干細胞治療技術的發(fā)展為DOP的治療帶來曙光。脂肪干細胞(adipose-derived mesenchymal stem cells，ADSCs)是一種獲取容易、來源豐富的干細胞，已被用于多種疾病的治療[6]，有學者指出自體ADSCs移植可用于骨質疏松的治療，并得到良好的療效[7]。但DOP個體自身的ADSCs成骨能力如何，能否應用于DOP的治療，目前相關的研究較欠缺。于2018年4月至2019年1月，本研究觀察了2型糖尿病性骨質疏松大鼠ADSCs的體外成骨能力，旨在探討DOP患者應用自體ADSCs治療DOP的可能性，為未來本方向醫(yī)學領域的發(fā)展提供借鑒，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

動物：健康12周齡SD大鼠60只，雌性，體重210～230 g，由廣東省實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(粵)2013-0002。各大鼠分籠飼養(yǎng)，自由飲食。主要實驗試劑：DMEM高糖液體培養(yǎng)基、胎牛血清、青-鏈霉素雙抗(廣州璽美生物科技有限公司)；Trizol (美國Invitrogen公司)；鏈脲霉素(streptozocin，STZ)(Sigama公司)；RT-PCR試劑盒(TAKARA公司)。主要實驗器材：Hema9600基因擴增儀(珠海黑馬醫(yī)學儀器有限公司)；微量分光光度計K2800(北京凱奧科技有限公司)；雙能X線骨密度儀OSTEOCORE(法國MEDILINK)。

1.2 DOP及OP大鼠模型的建立

60只SD大鼠隨機分為對照組、骨質疏松組(OP組)、2型糖尿病性骨質疏松組(DOP組)3組，每組20只。DOP組大鼠適應環(huán)境飼養(yǎng)1周后，給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)，連續(xù)喂養(yǎng)8周后，禁食12 h，于大鼠左下腹部經(jīng)腹腔注射2% STZ 30 mg/kg，每兩周注射1次，共兩次。于最后一次注射STZ 72 h后于大鼠尾靜脈取血，采用血糖檢測儀測量空腹血糖值，血糖≥16.7 mmol/L為2型糖尿病大鼠模型造模成功[8]。2型糖尿病大鼠造模成功后，各大鼠給予10%水合氯醛1.5 mL/kg，經(jīng)腹腔注射麻醉，麻醉滿意后，腹正中切開切除大鼠雙側卵巢。卵巢切除術后各大鼠每天肌注青霉素鈉(5萬U / d)預防感染，連續(xù)3 d。OP組大鼠同法切除雙側卵巢，對照組同法僅切除雙側卵巢周圍脂肪。3組大鼠正常飼養(yǎng)3個月后，使用雙能X線骨密儀測定各組大鼠腰4、5椎骨密度(bone mineral density，BMD)，以BMD<對照組BMD均值的2.5個標準差確認OP組骨質疏松大鼠模型及DOP組2型DOP大鼠模型建立成功[9]。建模完成后，對照組隨機選取10只大鼠，DOP組及OP組從建模成功的大鼠中各隨機選取10只作研究。

1.3 大鼠脂肪干細胞的分離與傳代

將3組各大鼠分別用10%水合氯醛經(jīng)腹腔注射充分麻醉后，取仰臥位，剪除雙側腹股溝區(qū)鼠毛，消毒鋪洞巾，每只大鼠切除腹股溝區(qū)脂肪組織約2 g，剔去脂肪組織中可見的血管及淺筋膜，予PBS液多次清冼后剪至糊狀。用0.1%Ⅰ型膠原酶消化后離心，棄上清液后加入完全培養(yǎng)基重懸，將細胞懸液置于T25培養(yǎng)瓶中接種，于細胞培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)中培養(yǎng)。2 d后首次換液，此后每3天換液。每天使用倒置顯微鏡觀察各組大鼠ADSCs生長情況，當細胞匯合度達80%時，進行傳代，取各組大鼠第3代ADSCs備用。應用CCK-8法檢測3組大鼠第3代ADSCs增殖情況，酶標儀檢測3組ADSCs 450 nm處吸光度，計算光密度(optical density，OD)值，連續(xù)檢測10 h。以天數(shù)為橫軸，OD值為縱軸繪制第3代ADSCs生長曲線。

1.4 各組大鼠ADSCs成骨能力測定

1.4.1ADSCs成骨結節(jié)染色及定量分析：取各組大鼠第3代ADSCs接種于6孔板，密度為1×105/孔，無菌載玻片覆蓋。細胞培養(yǎng)至匯合度達80%時，加入成骨誘導液(高糖DMEM液體培養(yǎng)基+10%胎牛血清+1%青-鏈霉素雙抗+1 mol/L地塞米松+50 mmol/L抗壞血酸+10 mmol/Lβ-甘油磷酸鈉)置于細胞培養(yǎng)箱(37 ℃、5% CO2)中培養(yǎng)，每3天換液1次，在成骨誘導13 d后行茜素紅染色，倒置顯微鏡下觀察成骨鈣結節(jié)并拍照。拍照后，使用氯化十六烷基吡啶析出成骨結節(jié)中與茜素紅結合的鈣離子，應用酶標儀檢測3組ADSCs 620 nm處的OD值，以OD值作成骨定量分析。

圖1 大鼠原代ADSCs生長情況(×100)Fig.1 Growth of primary generation ADSCs in rats of three groups (× 100)

1.4.2RT-PCR檢測各組大鼠ADSCs成骨相關基因的表達：取各組大鼠經(jīng)成骨誘導后的第3代ADSCs，予PBS液沖冼3次后，加入至含Trizol液的離心管，經(jīng)相分離、RNA沉淀洗滌及溶解提取ADSCs總RNA，檢測純度合格后反轉錄成cDNA，以ACTB作為內參，在熒光定量儀上使用實時PCR試劑盒進行PCR反應，檢測各組ADSCs成骨相關基因mRNA的表達，包括：核心結合因子(runt-related transcription factor 2，RUNX2)、骨鈣蛋白(osteocalcin，OCN)、骨橋蛋白(osteopontin，OPN)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)。各基因引物由蘇州泓迅生物科技有限公司設計及合成，各引物序列為：RUNX2上游引物：5′-CGCCTCACAAACAACCACAG-3′，RUNX2下游引物：5′-AATGACTCGGTTGGTCTCGG-3′；OCN上游引物：5′-CAACCCCAATTGTGACGAGC-3′，OCN下游引物：5′-AACGGTGGTGCCATAGATGC-3′；OPN上游引物：5′-AGACTGGCAGTGGTTTGCTT-3′，OPN下游引物：5′-AGTGTTTGCTGTAATGCGCC-3′；ALP上游引物：5′-CGTTTTCACGTTTGGTGGCT-3′，ALP下游引物：5′-ACCGTCCACCACCTTGTAAC-3′；內參基因ACTB上游引物：5′-CCCTAAGGCCAACCGTGAAAA-3′，下游引物：5′-GTACGACCAGGCATACAGG-3′。PCR反應條件為：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性25 s，60 ℃退火35 s,共40個循環(huán)。應用2-ΔΔCT法計算各基因的表達量。

1.5 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 DOP及OP大鼠模型建立情況

20只DOP組大鼠經(jīng)腹腔注射2% STZ后共19只發(fā)生2型糖尿病，19只2型糖尿病大鼠行卵巢切除術后共有15只出現(xiàn)骨質疏松，共15只DOP大鼠建模成功，符合入組條件，從中隨機選取10只建模成功的DOP大鼠作研究；20只OP組大鼠行卵巢切除術后共有12只出現(xiàn)骨質疏松，符合入組條件，從中隨機選取10只建模成功的OP組大鼠作研究；對照組中隨機選取10只大鼠入組作研究。3組大鼠在造模過程中均未出現(xiàn)死亡。

2.2 3組大鼠造模后骨密度情況

造模后DOP組大鼠與OP組大鼠BMD明顯低于對照組(P<0.05)，并且DOP組大鼠BMD更明顯低于OP組(P<0.05)(見表1)。

組別nBMD對照組100.325±0.017OP組100.193±0.021?DOP組100.157±0.015?#

注：與對照組比較，*P<0.05；與OP組比較，#P<0.05。

2.3 3組大鼠ADSCs的生物活性

顯微鏡下觀察3組大鼠的ADSCs原代細胞生長情況，發(fā)現(xiàn)接種于培養(yǎng)瓶后12 h開始貼壁，約24 h全部貼壁。3組大鼠ADSCs生長狀態(tài)良好，外觀無明顯差異，均呈現(xiàn)長梭型，邊緣透明，胞內無深色顆粒和雜點，細胞外環(huán)境無漂浮深色顆粒及細胞碎片(見圖1)。經(jīng)消化、傳代，繪制第3代ADSCs生長曲線，見3組ADSCs均于前兩天緩慢增長，于第三天起增殖速度加快，4至6 d DOP組與OP組細胞增殖速度較對照組快，于6天后細胞增殖平緩，至第10天3組細胞均鋪滿培養(yǎng)瓶瓶底(見圖2)。

圖2 3組大鼠第三代ADSCs生長曲線Fig.2 Growth curves of the third generation ADSCs in rats of three groups

2.4 3組大鼠ADSCs成骨結節(jié)檢測

3組大鼠第3代ADSCs在成骨誘導13 d后進行茜素紅染色，顯微鏡下可見DOP組與OP組大鼠的鈣化結節(jié)量較對照組少，DOP組鈣化結節(jié)最少，并且缺少大片狀結節(jié)，染色較淺(見圖3)。從成骨定量分析結果可見，DOP組與OP組的OD值均低于對照組(P<0.05)，并且DOP組明顯低于OP組(P<0.05)(見表2)。

2.5 RT-PCR檢測三組ADSCs成骨相關基因的表達

于成骨誘導13 d后，RT-PCR檢測3組ADSCs成骨基因RUNX2、OCN、OPN、ALP mRNA的表達，DOP組與OP組四基因mRNA的表達量均低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；DOP組與OP組相比較，OCN與OPNmRNA的表達量無明顯差異(P>0.05)，而DOP組RUNX2與ALPmRNA的表達量明顯低于OP組(P<0.05)(見表3)。

表3 成骨誘導后各組ADSCs成骨相關基因mRNA的表達Table 3 Osteogenesis-related gene expression of ADSCs in each group after osteogenesis

注：與對照組比較，*P<0.05；與OP組比較，#P<0.05。

圖3 三組大鼠第三代ADSCs成骨誘導后茜素紅染色結果Fig.3 Alizarin red staining after osteogenic induction of the third generation of ADSCs in rats of three groups

組別nOD值(620 nm)對照組100.143±0.032OP組100.097±0.015?DOP組100.053±0.011?#

注：與對照組比較，*P<0.05；與OP組比較，#P<0.05。

3 討論

隨著2型糖尿病發(fā)病率的逐年增高，DOP在臨床上也愈發(fā)常見[10]。DOP的發(fā)病機制目前仍未完全明確，目前考慮與糖尿病高血糖狀態(tài)下出現(xiàn)骨代謝異常、成骨細胞活性減弱、破骨細胞活增強、血鈣水平下降等方面有關[11]。本研究采用喂食高脂高糖飼料加腹腔注射STZ聯(lián)合雙側卵巢切除術的方法成功建立2型DOP大鼠，從造模腰椎骨密度檢測結果可得，DOP組大鼠BMD明顯低于OP組，說明高血糖狀態(tài)下出現(xiàn)骨質疏松骨量丟失會更嚴重，糖尿病性骨質疏松比單純骨質疏松具有更大的危害性。進一步明確DOP的發(fā)病機制，尋找有效的防治DOP的方法刻不容緩。

目前，已有研究表明通過移植自體ADSCs對2型糖尿病有一定治療作用[12-13]，亦有學者通過實驗得出經(jīng)靜脈移植ADSCs能減少單純骨質疏松大鼠的骨量丟失[14]。但DOP患者同時存在糖尿病和骨質疏松癥兩種病理狀態(tài)，其自身ADSCs成骨分化能力是否比單純OP差，應用自體ADSCs干預DOP能否也能起到一定作用，目前相關的研究尚欠缺。本研究將DOP組大鼠ADSCs成骨分化情況與OP組、對照組作比較，探討2型DOP大鼠ADSCs成骨分化的能力，從而為應用自體ADSCs移植治療2型DOP打下基礎。

從研究結果可得，從DOP組大鼠脂肪組織中可成功分離并傳代 ADSCs，并且DOP組ADSCs細胞形態(tài)和增殖情況與OP組、對照組無明顯差異，提示從DOP大鼠中可提取豐富的ADSCs。但從成骨誘導后顯微鏡下觀察結果及定量分析結果可得，DOP組大鼠ADSCs的成骨分化能力要低于對照組，甚至低于單純OP組。從RT-PCR檢測3組ADSCs成骨基因表達的結果可得，DOP組與OP組RUNX2、OCN、OPN、ALP mRNA的表達量均低于對照組，并且DOP組與OP組作比較，DOP組RUNX2與ALP mRNA的表達量明顯低于OP組，進一步體現(xiàn)了DOP組ADSCs的成骨分化能力要低于OP組，為3組中最弱。進一步分析RT-PCR結果可得，DOP組與OP組OCN、OPN mRNA的表達量并無明顯差異，可以推測兩組ADSCs成骨能力的差異可能與RUNX2、ALP的表達水平密切相關。ALP與RUNX2均是反映干細胞早期成骨能力的重要基因[15]。ALP是細胞早期成骨的重要標志物，其表達量影響著骨代謝的發(fā)生發(fā)展[16]。RUNX2則是影響干細胞成骨分化的特異轉錄因子，可促進細胞成骨分化及誘導軟骨形成[17-18]。RUNX2和ALP基因目前被認為對干細胞的成骨能力具有重大作用[19]，以二者為核心的信號通路直接控制骨組織的建立[20]。從PCR結果可以推測，DOP組在高血糖狀態(tài)下自身ADSCs中RUNX2、ALP基因會較OP組進一步降低，這可能是DOP組ADSCs成骨能力弱于OP組的直接原因，通過上調ADSCs中RUNX2、ALP的表達有望提高其成骨分化能力，從而為DOP患者自體ADSCs移植治療帶來希望。至于2型DOP大鼠體內存在何種機制能夠加重ALP和RUNX2基因水平的急劇下調，這需要進一步研究探討。

綜上所述，2型DOP大鼠ADSCs體外成骨分化能力較弱，弱于單純骨質疏松大鼠，原因可能與高血糖狀態(tài)下其ADSCs中ALP和RUNX2的表達進一步減少有關。單純移植自體ADSCs干預自身DOP可能療效較差，提高其ADSCs成骨分化能力，未來有望實現(xiàn)應用自體ADSCs完成自身DOP的治療。