從基質代謝角度探討扶正化瘀方抗心肌纖維化的細胞分子機制

朱珂 婁利霞 祁軼斐

[摘要] 目的 通過觀察扶正化瘀方（FZHY）對血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導的心肌成纖維細胞（CFs）細胞外基質（ECM）代謝的影響，探討其抗心肌纖維化（MF）的分子機制。 方法 差速貼壁法提取乳鼠原代CFs，傳代培養(yǎng)。將細胞分為3組，每組6個樣本，分別加入2% FBS-DMEM（空白對照組），1×10-7mol/L AngⅡ（AngⅡ組），1×10-7mol/L AngⅡ+100 μg/mL FZHY（FZHY組）。干預48 h后，采用ELISA法檢測Ⅰ型膠原（ColⅠ）、ColⅢ、基質金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2的分泌情況;采用實時熒光定量PCR法檢測ColⅠ、ColⅢ、MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2 mRNA的表達情況。 結果 與空白對照組比較，AngⅡ組ColⅠ、ColⅢ含量及mRNA的表達增加（P < 0.01）;與AngⅡ組比較，F(xiàn)ZHY組ColⅠ、ColⅢ含量及其mRNA表達下降（P < 0.05或P < 0.01）。與空白對照組比較，AngⅡ組MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2及其mRNA表達增加（P < 0.05），MMP-2/TIMP-2和MMP-9/TIMP-1有降低趨勢;與AngⅡ組比較，F(xiàn)ZHY組MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2及其mRNA表達下降，MMP-2/TIMP-2降低（P < 0.05或P < 0.01），MMP-9/TIMP-1有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。 結論 FZHY可減少CFs ColⅠ、ColⅢ的表達，其機制可能與下調MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2及其mRNA表達，降低MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1比值，調控ECM代謝有關。

[關鍵詞] 扶正化瘀方;心肌纖維化;心肌成纖維細胞;細胞外基質;金屬基質蛋白酶

[中圖分類號] R541? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）08（b）-0012-04

[Abstract] Objective To observe the effect of Fuzheng Huayu Recipe （FZHY） on the extracellular matrix （ECM） metabolism of rat cardiac fibroblasts （CFs） induced by angiotensin Ⅱ （Ang Ⅱ）， and to explore the mechanism of FZHY in treating myocardial fibrosis. Methods Differential adherent method was used to extract primary CFs from neonatal rats and subculture them. Cells can be divided into three groups， each group of 6 samples， add 2% FBS-DMEM （blank control group）， 1 × 10-7 mol/L Ang Ⅱ （Ang Ⅱ group）， 1 × 10-7 mol/L Ang Ⅱ + 100 μg/mL FZHY （FZHY group）. Intervention after 48 h， collagentype Ⅰ（ColⅠ）， ColⅢ， matrix metalloproteinases （MMP）-2， MMP-9 and TIMP-1 and TIMP-2 secretion were detected by the method of ELISA; ColⅠ， ColⅢ， MMP-2 and MMP-9 and TIMP 1 and TIMP-2 mRNA expression were detected by real-time fluorescent quantitative PCR method. Results Compared with blank control group， Col Ⅰ， Col Ⅲ content and mRNA expression of Ang Ⅱ group increased （P < 0.01）. Compared with Ang Ⅱ group， Col Ⅰ， Col Ⅲ content and its mRNA of FZHY group expression decreased （P < 0.05 or P < 0.01）. Compared with blank control group，? MMP-2， MMP-9 and TIMP 1 and TIMP-2 and its mRNA expression of Ang Ⅱ group increased （P < 0.05）. MMP-2/TIMP-2 and MMP-9/TIMP-1 showed a decreasing trend. Compared with Ang Ⅱ group， MMP-2， MMP-9 and TIMP 1 and TIMP-2 and its mRNA expression， and its MMP-2/TIMP-2 of FZHY group decreased （P < 0.05 or P < 0.01）， and MMP-9/TIMP-1 had a tendency to decrease， but there was no statistical significance （P > 0.05）. Conclusion FZHY can reduce the CFs ColⅠ， ColⅢ expression， its mechanism may be related to downgrade MMP-2， MMP-9 and TIMP 1 and TIMP-2 and its mRNA expression， reduce the MMP-2/TIMP-2， MMP-9/TIMP-1 ratio， regulating the metabolism of ECM.

[Key words] Fuzheng Huayu Recipe; Myocardial fibrosis; Myocardial fibroblast; Extracellular matrix; Metalloproteinase

心肌纖維化（MF）是由心肌成纖維細胞（CFs）增殖和細胞外基質（ECM）合成與降解失衡所導致的病理改變[1-2]?；|金屬蛋白酶（MMPs）是調控ECM代謝的重要酶系[3]，MMPs及其組織抑制劑（TIMPs）比例失衡導致的ECM代謝紊亂是MF的重要原因之一[4]。前期研究證實，扶正化瘀方（FZHY）可改善MF[5-6]，但其具體的細胞分子機制尚不明確。本研究采用差速貼壁法提取乳鼠原代CFs，觀察FZHY對血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）誘導的CFs基質代謝的影響，探討其抗MF的可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物

3日齡Wistar乳鼠20只，雌雄不限，由北京維通利華實驗動物技術有限公司購進，許可證號：SCXK（京）2016-0006，合格證號：11400700277357。

1.2 試劑

Neonatal Heart Dissociation Kit（美天旎公司，貨號：130-098-373）;Vimentin抗體（武漢博士德生物工程有限公司，貨號：BM0135）;a-SMA抗體（武漢博士德生物工程有限公司，貨號：BM4172）;AngⅡ（中肽公司，貨號：CJ-04-01164）;ELISA試劑盒（Elisa Biotech公司，貨號：EIA-3504）;RNAprep pure Cell/Bacteria Kit（TIANGEN公司，貨號：DP430）;FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix（TIANGEN公司，貨號：KR118-02）;SuperReal PreMix Plus（TIANGEN公司，貨號：FP205-02）。

扶正化瘀方由丹參8 g、蟲草4 g、桃仁2 g、絞股藍6 g、松花粉2 g、五味子2 g 六味中藥組成。本實驗所用扶正化瘀方浸膏由上海黃海制藥有限責任公司提供，得膏率為13.75%，用2%FBS-DMEM稀釋1000倍后使用。

1.3 儀器

超凈工作臺（北京半導體一廠）;二氧化碳培養(yǎng)箱（德國，Heraeus）;全自動組織處理系統(tǒng)（美天旎公司）;紫外分光光度計（Pharmacia Biotech公司）;Agilent Mx3000P PCR儀（美國ABI）。

1.4 CFs的培養(yǎng)和鑒定

根據Neonatal Heart Dissociation Kit說明書操作，無菌條件下取Wistar乳鼠心臟，采用差速貼壁法獲取CFs，實驗用3～5代CFs，10%FBS-DMEM常規(guī)培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察CFs形態(tài)，采用免疫細胞化學法進行鑒定。

1.5 分組及處理

以7.5×104個/mL濃度接種CFs于6孔板中，每孔2 mL。待細胞生長至60%～70%，換無血清DMEM孵育24 h。分別加入2%FBS-DMEM（空白對照組），1×10-7mol/L AngⅡ（AngⅡ組），1×10-7mol/L AngⅡ+100 μg/mL FZHY（FZHY組）。干預48 h后，收集細胞上清及細胞進行相關實驗。

1.6 ColⅠ、ColⅢ、MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2含量的檢測

采用ELISA法，取上清按試劑盒說明書操作。在樣本孔和標準品孔中分別加入40 μL待測樣本和不同濃度的標準品;每孔加入100 μL抗體，37℃孵育1 h;吸棄殘液，加入底物A、B各50 μL，37℃避光15 min;加入50 μL終止液，在450 nm處測定各孔OD值，根據標準曲線計算樣本濃度。

1.7 ColⅠ、ColⅢ、MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2 mRNA的表達

采用實時熒光定量PCR法檢測。根據RNAprep pure Cell/Bacteria Kit、FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix說明書操作提取細胞總RNA，并反轉錄為cDNA。PCR反應條件為95℃預變性15 min，95℃ 變性10 s，60℃退火-延伸32 s共40個循環(huán)，以GAPDH為內參。所得CT值按照2-△△ct的方法，進行均一化處理后進行統(tǒng)計學分析。見表1。

1.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件進行分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較先進行方差齊性檢驗，滿足方差齊性采用單因素方差分析，總體有差異用LSD-t法進行兩兩比較，不滿足方差齊性用Welch法及Dunnett′s T3法進行多重比較。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 CFs的鑒定

顯微鏡下觀察，CFs生長迅速，細胞多呈梭形或三角形，折光性弱，無自發(fā)搏動。免疫細胞化學鑒定結果顯示，Vimentin染色呈陽性，a-SMA染色呈陰性。細胞純度達95%以上。

2.2 各組對ColⅠ、ColⅢ含量的影響

與空白對照組比較，AngⅡ組ColⅠ、ColⅢ含量增加（P < 0.01）;與AngⅡ比較，F(xiàn)ZHY組ColⅠ、ColⅢ含量減少（P < 0.01或P < 0.05）。見表2。

2.3 各組對ColⅠ、ColⅢ mRNA表達的影響

與空白對照組比較，AngⅡ組ColⅠ、ColⅢ mRNA表達水平升高（P < 0.01）;與AngⅡ比較，F(xiàn)ZHY組ColⅠ、ColⅢ mRNA表達水平下降（P < 0.05）。見表3。

2.4 各組對MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2表達及MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1的影響

與空白對照組比較，AngⅡ組MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2含量增加（P < 0.01），MMP-2/TIMP-2和MMP-9/TIMP-1有下降趨勢;與AngⅡ比較，F(xiàn)ZHY組MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2含量以及MMP-2/TIMP-2減少（P < 0.05或P < 0.01），MMP-9/TIMP-1有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見表4。

2.5 各組對MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2 mRNA表達的影響

與空白對照組比較，AngⅡ組MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TIMP-2 mRNA表達水平升高（P < 0.05）;與AngⅡ比較，F(xiàn)ZHY組MMP-2、MMP-9、TIMP1和TIMP2 mRNA表達水平下降（P < 0.05或P < 0.01）。見表5。

3 討論

FZHY由丹參、桃仁、五味子、絞股藍、蟲草、松花粉組成，具有活血化瘀，益氣扶正的功效。前期研究[7]顯示，MF過程中同樣存在成纖維細胞增殖，ECM合成降解失衡的病理及正虛血瘀的病機。在“異病同治”理論指導研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ZHY可抑制心肌膠原表達，改善心梗后MF[8]。

ECM主要由ColⅠ、ColⅢ組成[9]，其過度沉積是MF形成的重要原因[5]。CFs是合成ColⅠ、ColⅢ的主要場所，某些病理條件刺激下，CFs過度增殖并大量分泌ColⅠ、ColⅢ[10]，導致ECM合成增多，心肌僵硬度增加，MF發(fā)生[11]。AngⅡ通過激活CFs的AT1-R，影響CFs增殖和膠原表達[12]。故本研究采用AngⅡ建立CFs的MF細胞模型，結果顯示，AngⅡ可誘導CFs的ColⅠ、ColⅢ表達升高，經FZHY處理后其表達明顯降低，提示FZHY可通過抑制AngⅡ誘導的CFs膠原表達，減少ECM沉積，改善MF。

MF形成不僅包括ECM合成增多，還包括ECM降解失衡及膠原網絡破壞等[13]。MMPs是一組由CFs等分泌，參與ECM降解與破壞的蛋白水解酶家族[14]。MMPs不僅能直接降解ECM并活化其他類型MMPs產生級聯(lián)效應[15]，還能調節(jié)膠原的合成，使正常膠原被缺乏連接結構的纖維間質代替[16-17]。MMP-2和MMP-9是其重要成員，過量表達可破壞膠原網絡，促進CFs增殖、分化及遷移，致ECM沉積和MF形成[18-19]。TIMPs是MMPs的特異性抑制劑，以1∶1的比例與MMPs形成復合體，阻斷MMPs與底物結合，抑制其活性[20]。TIMP-2與MMP-2，TIMP-1與MMP-9能分別形成酶原復合物，其比例失衡可促進MF的發(fā)展[21]。結果顯示，AngⅡ組MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2表達升高，MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1有升高趨勢，提示AngⅡ誘導了CFs MMP-2、MMP-9表達的相對升高，使ECM代謝紊亂，促進了MF發(fā)展。經FZHY干預后，CFs的MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2表達及MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1比值降低，提示FZHY可通過降低CFs的MMP-2/TIMP-2和MMP-9/TIMP-1水平，調控ECM代謝平衡，改善MF。

本研究從ECM代謝角度探討了FZHY抗MF的細胞分子機制，證實FZHY可減少CFs ColⅠ、ColⅢ的表達，其機制可能與下調MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2及其mRNA表達，降低MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1，調控ECM代謝有關。研究結果為FZHY治療MF提供了新的理論依據。然而MF的分子機制復雜，纖維化過程中ECM代謝還受TGF-β、非編碼RNA等眾多因素的調控。今后我們將在這些方面做進一步探討。

[參考文獻]

[1]? 朱錦星，凌望，程大雁，等.中藥干預心臟成纖維細胞活化防治心肌纖維化研究進展[J].時珍國醫(yī)國藥，2018，29（8）：1971-1974.

[2]? 馬金，丁春華.心臟成纖維細胞與心肌纖維化[J].中華心血管病雜志，2014，42（3）：269-272.

[3]? López B，González A，Díez J. Role of matrix metalloproteinases in hypertension-associated cardiac fibrosis [J]. Curr Opin Nephrol Hypertens，2004，13（2）：197-204.

[4]? 馬雙陶，楊大春，唐兵，等.白藜蘆醇抑制基質金屬蛋白酶抗酒精性心肌纖維化[J].中國動脈硬化雜志，2012，20（1）：21-24.

[5]? 祁軼斐，任學嬌，婁利霞，等.FZHY對心肌梗死后心肌纖維化大鼠細胞外基質代謝的影響[J].中醫(yī)雜志，2018， 59（7）：607-611.

[6]? 任學嬌，祁軼斐，婁利霞，等.FZHY對心肌梗死大鼠心肌纖維化及TGF-β1/Smads信號通路的影響[J].中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2018，16（9）：1185-1189.

[7]? 吳愛明，趙明鏡，張冬梅，等.心梗后心力衰竭模型大鼠中醫(yī)證候特點及心臟的超聲評價[J].中國中西醫(yī)結合雜志，2007，27（3）：227-230.

[8]? 吳愛明，翟建英，張冬梅，等.扶正化瘀膠囊對心肌梗死大鼠心肌纖維化的影響[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學進展，2013，13（14）：2618-2621.

[9]? 卓小楨，劉懿，李娜，等.白藜蘆醇通過TGF-β1/Smad3信號通路抑制心肌成纖維細胞中AngⅡ誘導的Ⅰ/Ⅲ型膠原合成[J].西安交通大學學報：醫(yī)學版，2018，39（4）：525-529，557.

[10]? 于婷，王小梅.通心絡對高糖培養(yǎng)下心肌成纖維細胞增殖和凋亡的影響[J].中國醫(yī)科大學學報，2018，47（2）：132-136.

[11]? Tang M，Zhong M，Shang Y，et al. Differential regulation of collagen typesⅠandⅢexpression in cardiac fibroblasts by AGEs through TRB3/MAPK signaling pathway [J]. Cell Mol Life Sci，2008，65（18）：2924-2932.

[12]? Chi JY，Wang L，Zhang XH，et al. Activation of calcium-sensing receptor-mediated autophagy in angiotensinII-induced cardiac fibrosis in vitro [J]. Biochem. Biophys. Res. Commun.，2018，497（2）：571-576.

[13]? 劉軍鋒，賈克剛，劉運德.基質金屬蛋白酶與心臟重構及心肌病理損害的研究進展[J].中華老年心腦血管病雜志，2007，9（7）：499-500.

[14]? 王娟，程志清.基質金屬蛋白酶及其組織抑制劑與病毒性心肌炎心肌纖維化[J].中國心血管雜志，2007（06）：467-469.

[15]? Trim JE，Samra SK，Arthur MJ，et al. Upstream tissue inhibitor of metalloproteinases-1 （TIMP-1） element-1，a novel and essential regulatory DNA motif in the human TIMP-1 gene promoter，directly interacts with a 30-kDa nuclear protein [J]. J Biol Chem，2000，275（9）：6657-6663.

[16]? 陳漫天，魏盟.心室重構中細胞外基質合成與降解失平衡的研究進展[J].同濟大學學報：醫(yī)學版，2004，25（3）：261-264.

[17]? Briest W，H？觟lzl A，Rassler B，et al. Significance of matrix metalloproteinases in norepinephrine-induced remodelling of rat hearts [J]. Cardiovasc Res，2003，57（2）：379-387.

[18]? Dong J，Gao C，Liu J，et al. TSH inhibits SERCA2a and thePKA/PLN pathway in rat cardiomyocytes [J]. Oncotarget，2016，7（26）：39 207-39 215.

[19]? Gao C，Li T，Liu J，et al. Endothelial Functioning and HemodynamicParameters in Rats with Subclinical Hypothyroid and the Effects ofThyroxine Replacement [J]. PLoS One，2015，10（7）：1-14.

[20]? Fan D，Takawale A，Basu R，et al. Differential role of TIMP2 and TIMP3 in cardiac hypertrophy，fibrosis and diastolic dysfunction [J]. Cardiovasc Res，2014，103（2）：268-280.

[21]? 劉焱，劉剛，劉坤申.基質金屬蛋白酶抑制劑與心臟疾病[J].臨床薈萃，2005，20（16）：953-955.

（收稿日期：2018-01-08? 本文編輯：封? ?華）