李水仙 夏從龍 陳麗元

摘 要 目的：對藏藥“蒂達”的3種基源植物紫紅獐牙菜、青葉膽和橢圓葉花錨進行親緣關(guān)系研究。方法：利用簡單重復(fù)序列區(qū)間（ISSR）分子標(biāo)記技術(shù)對紫紅獐牙菜9個樣品（樣品ZT-1～ZT-5采自大理蒼山感通寺，樣品ZC-1～ZC-4采自大理賓川縣）、青葉膽2個樣品（QYD-1～QYD-2）和橢圓葉花錨2個樣品（HM-1～HM-2）進行聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）擴增。采用青葉膽的DNA基因組為模板DNA進行引物篩選，對篩選得到的8條引物進行PCR反應(yīng)；對PCR擴增產(chǎn)物進行人工讀帶，建立原始數(shù)據(jù)矩陣，并計算多態(tài)性條帶比率；同時，采用NTSYS 2.1軟件計算遺傳相似系數(shù)，并選擇UPGMA法繪制聚類圖。結(jié)果：通過8條ISSR引物共反應(yīng)獲得113條清晰可辨的PCR擴增產(chǎn)物條帶，多態(tài)性位點百分率為100%。紫紅獐牙菜、青葉膽和橢圓葉花錨3個品種共13個樣品的遺傳相似系數(shù)在0.301～0.500之間；紫紅獐牙菜9個樣品的種內(nèi)遺傳相似系數(shù)在0.752～0.929之間。聚類分析結(jié)果顯示，當(dāng)距離線為0.410時，可將13個樣本分為3個類群，即青葉膽、橢圓葉花錨、紫紅獐牙菜；當(dāng)距離線為0.780時，可將紫紅獐牙菜的9個樣品分為2個亞類，一個亞類只有蒼山感通寺采集的樣品ZT-1，另一個亞類含有其余8個樣品。結(jié)論：利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)能從分子水平對紫紅獐牙菜、青葉膽和橢圓葉花錨進行鑒別。紫紅獐牙菜與青葉膽、橢圓葉花錨存在一定的親緣關(guān)系，但親緣關(guān)系相對較遠、遺傳差異較大；大理地區(qū)兩個不同地點產(chǎn)紫紅獐牙菜的遺傳差異較小、親緣關(guān)系較近，但表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性。

關(guān)鍵詞 ISSR分子標(biāo)記技術(shù)；紫紅獐牙菜；青葉膽；橢圓葉花錨；鑒定；親緣關(guān)系；遺傳多樣性

Analysis of the Phylogenetic Relationships of 3 Basic Plants of Tibetan Medicine “Dida” Based on ISSR Technology

LI Shuixian1，XIA Conglong1，CHEN Liyuan2（1. Pathology Teaching and Research Section， College of Basic Medicine， Dali University， Yunnan Dali 671000， China； 2. Dept. of Pharmacy， the First Affiliated Hospital of Kunming Medical University， Kunming 650032， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the phylogenetic relationships of 3 basic plants of Tibetan medicine “Dida”， such as Swertia puricea， Wertia mileensis， Halenia elliptica. METHODS： ISSR technology was used for PCR amplification of 9 samples of S. puricea （ZT-1 to ZT-5 from Gantongsi in Dali Cangshan， ZC-1 to ZC-4 from Binchuan county of Dali）， 2 samples of W. mileensis （QYD-1 to QYD-2） and 2 samples of H. elliptica （HM-1 to HM-2）. Using DNA genome of S. puricea as template， 8 primers were screened and used for PCR reaction. The PCR amplification products were read by hand， the original data matrix was established， and the polymorphic band ratio was calculated. At the same time， genetic similarity coefficient was calculated by using NTSYS 2.1 software， and UPGMA method was used to draw cluster diagram. RESULTS： A total of 113 clear and identifiable amplification product bands were obtained by 8 ISSR primers. The rate of polymorphic site was 100%. The genetic similarity coefficients for totally 13 samples of S. puricea， W. mileensis and H. elliptica ranged 0.301-0.500. Intraspecific genetic similarity coefficients for 9 samples of S. puricea ranged from 0.752 to 0.929. The cluster analysis showed， when the range line was 0.410， 13 samples could be divided into three groups， i.e. S. puricea， W. mileensis， H. elliptica； when the range line was 0.780， 9 samples of S. purpurea could be divided into 2 subgroups， one of which was only sample ZT-1 collected from Gantongsi in Cangshan， and the other contained the remaining 8 samples. CONCLUSIONS： ISSR technology can be used to identify S. punicea， S. glabra and H. elliptica at the molecular level. S. punicea has some genetic relationship with S. glabra and H. elliptica， but the genetic relationship is relatively distant and the genetic difference is large. S. punicea from two different locations in Dali area has little genetic difference and close relationship， but it shows abundant genetic diversity.

KEYWORDS ISSR； Swertia puricea； Swertia mileensis； Halenia elliptica； Identification； Phylogenetic relationship； Genetic diversity

簡單重復(fù)序列區(qū)間（Inter-simple sequence repeat，ISSR）是由加拿大蒙特利爾大學(xué)Zietkeiwitcz E等[1]在聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）基礎(chǔ)上提出的分子標(biāo)記技術(shù)，其基本原理是以錨定的微衛(wèi)星DNA為引物，在簡單重復(fù)序列（SSR）的3′端或5′端加上1～4個隨機核苷酸，錨定引物可在PCR反應(yīng)中引起特定位點退火，導(dǎo)致與錨定引物互補的間隔不太大的重復(fù)序列間DNA片段進行PCR擴增。ISSR分析具有操作方便、精確、快速、高效且DNA用量少等優(yōu)點[2]，目前已廣泛應(yīng)用于植物品種鑒定、基因定位、遺傳多樣性分析等研究中[3-5]。

“蒂達”是藏藥中治療肝膽疾病最具有代表性的常用藥物之一，具有悠久的用藥歷史，它是指“味苦，能治療肝膽疾病”的一類功效相近的藥物的總稱[6-7]。《晶珠本草》中有記載：“蒂達可清熱，治膽病、血病，有清肝利膽、退諸熱的作用”[8]。藏藥“蒂達”品種繁多、基源復(fù)雜，涉及到龍膽科獐牙菜屬、花錨屬、扁蕾屬、肋柱花屬、喉毛花屬及虎耳草科虎耳草屬、唇形科等多種植物[6，9-10]。龍膽科植物為“蒂達”常用藥用植物之一，其中龍膽科植物青葉膽（Swertia mileensis T. N. Ho. et L. Shih）、橢圓葉花錨（Halenia elliptica D. Don）為其主要藥用基源植物，但由于資源需求量較大、過度開采，目前已瀕臨滅絕[11-13]。藏醫(yī)常用同科植物紫紅獐牙菜（Swertia puricea Hemsl）進行替代使用。目前對青葉膽、橢圓葉花錨和紫紅獐牙菜的成分及藥理作用研究較多[14-18]，而從分子水平對三者進行親緣性分析的研究尚未見報道。因此，本課題組利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對藏藥“蒂達”3種基源植物（青葉膽、橢圓葉花錨、紫紅獐牙菜）的親緣關(guān)系進行評價并進行遺傳學(xué)多樣性分析，為紫紅獐牙菜作為“蒂達”基源的替代使用提供可靠依據(jù)，也為青葉膽及其近緣種藥用植物的遺傳改良、選種育種、親本選配、種質(zhì)保護和核心種質(zhì)構(gòu)建等提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Applied Biosystem 2720型PCR儀（美國Applied Biosystems公司）；GBOX HR型化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)（英國Syngene公司）；DYY-6C型電泳儀（北京市六一儀器廠）；UV-1102型紫外分光光度計（上海天美科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試劑

溴代十六烷基三甲胺（CTAB，美國Amresco公司，批號：0833）；2×Taq PCR Master Mix試劑[包含0.1 U Taq DNA聚合酶、0.5 mmol/L d NTP、20 mmol/L Tris- HCl（pH 8.3）、100 mmol/L KCl、3 mmol/L MgCl2]、TE洗脫緩沖液（北京天根生化科技有限公司，批號分別為KT201、RK121-03）；DNA Marker、瓊脂糖[生工生物工程（上海）股份有限公司，批號分別為B500347、A610013]；其余試劑均為國產(chǎn)分析純，水為雙蒸水（dd H2O）。

1.3 藥材

所有藥材樣本均采自云南省不同地區(qū)（藥材樣品來源見表1）。所采植物由大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院夏從龍教授鑒定分別為龍膽科獐牙菜屬紫紅獐牙菜（S. puricea Hemsl）、龍膽科獐牙菜屬青葉膽（S. mileensis T. N. Ho. et L. Shih）、龍膽科花錨屬橢圓葉花錨（H. elliptica D.Don）的原植物。各植物取新鮮葉片，用變色硅膠迅速干燥，于4 ℃冰箱保存。

1.4 引物

ISSR引物根據(jù)不列顛哥倫比亞大學(xué)（University of British Columbia）公布的序列設(shè)計[19]，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

2 方法

2.1 樣品DNA的提取

采用改良的CTAB法[20]提取3種植物樣品中的全基因組DNA；采用瓊脂糖凝膠電泳法結(jié)合紫外分光光度法檢測DNA的質(zhì)量濃度后，用TE洗脫緩沖液稀釋至50 ng/μL，備用。

2.2 引物篩選

根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，采用青葉膽藥材的DNA基因組為模板DNA進行引物的篩選，從生工生物工程（上海）股份有限公司合成的100條引物中篩選出8條能擴增出多態(tài)性條帶、背景清晰、反應(yīng)穩(wěn)定的引物，用于后續(xù)的樣本ISSR分析。8條引物序列詳見表2。

2.3 PCR反應(yīng)

采用PCR儀進行ISSR-PCR擴增。體系組成（總體積為25 μL）：2×Taq Master Mix 12.5 μL，引物1 μL，DNA模板3 μL，加dd H2O至25 μL。擴增程序：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，約52～56 ℃（不同引物按照表2中退火溫度進行微調(diào)）退火45 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物以DNA Marker為內(nèi)參，經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳1.5 h，采用凝膠成像系統(tǒng)照相并記錄結(jié)果。

2.4 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)遷移率對8條引物反應(yīng)所得PCR擴增產(chǎn)物的凝膠電泳圖進行人工讀帶，選取穩(wěn)定清晰的條帶進行統(tǒng)計分析。每個條帶（即DNA片段）均記為1個分子標(biāo)記，代表1個引物的結(jié)合位點。根據(jù)分子標(biāo)記的有無（“有”賦值為1，包括強帶和重復(fù)性好的弱帶；“無”賦值為0）統(tǒng)計所有的二元數(shù)據(jù)，從而得到原始數(shù)據(jù)矩陣，并計算多態(tài)性條帶比率。采用NTSYS 2.1軟件計算遺傳相似系數(shù)，并選擇UPGMA法繪制聚類圖。

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（收稿日期：2018-10-17 修回日期：2019-04-26）

（編輯：段思怡）