茶葉中花青素測(cè)定方法研究進(jìn)展及分光光度測(cè)定法的優(yōu)化

王靜 ， 王瑾 ， 徐建峰 ， 鄭國(guó)建 ， 周衛(wèi)龍 *

（1.中華全國(guó)供銷(xiāo)合作總社杭州茶葉研究院，浙江杭州 310016；2.國(guó)家茶葉質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，浙江杭州 310016）

花青素是一種廣泛存在的天然植物水溶性色素，屬于黃酮類(lèi)化合物。大量研究表明花青素具有諸多生物學(xué)功效，例如抗氧化[1-2]、抗病毒[3]、預(yù)防心血管疾病[4-5]、抗衰老[6]等。茶葉中也富含花青素，紅紫色茶樹(shù)葉片在夏季高溫條件下，易在高海拔的群體茶園中發(fā)生，是一種茶樹(shù)抗逆生理的表現(xiàn)形式[7]。有研究表明，茶葉中的花青素具有苦味，影響茶葉品質(zhì)，因此過(guò)去富含花青素的紫芽茶品質(zhì)欠佳也較少有人關(guān)注[8]。一般茶葉中的花青素含量只占干物質(zhì)的0.01%左右[9]，紫色芽葉中的花青素含量則可高達(dá)0.5%～1.0%[10]。云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所采用單株選種法經(jīng)多代培育出的新品“紫娟”（品種權(quán)號(hào) 20050031），具有紫芽、紫葉、紫莖的特性，并且其花青素的含量是一般紅芽茶的3倍左右[11]。由于紫芽茶中花青素含量較高具有一定的特征性，茶葉中花青素含量的高低可以作為一種評(píng)判紫芽茶的依據(jù)。

近年來(lái)由于對(duì)花青素生物功能的深入研究，消費(fèi)者對(duì)于在自然界中含量豐富的水溶性色素的關(guān)注度隨之上升。目前由肯尼亞提出，國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織食品技術(shù)委員會(huì)茶葉分技術(shù)委員會(huì)（ISO/TC34/SC8）已同意紫芽茶作為前期項(xiàng)目立項(xiàng)，項(xiàng)目名稱(chēng)為ISO/PWI 23827《紫芽茶 定義和基本要求》。因此建立一種操作簡(jiǎn)便、可操作性強(qiáng)的茶葉中花青素含量的檢測(cè)方法顯得尤為重要。

目前關(guān)于茶葉花青素的研究主要集中在茶樹(shù)選育開(kāi)發(fā)[12-13]、合成途徑及調(diào)控機(jī)理[14]等，對(duì)于花青素的檢測(cè)方法研究較少。植物源性食品中花青素含量主要的檢測(cè)方法有pH示差法、分光光度法和液相色譜法三種。文章對(duì)目前茶葉及其他植源性食品中花青素的主要檢測(cè)方法進(jìn)行綜述，并結(jié)合自身研究，對(duì)今后茶葉中花青素的檢測(cè)方法提出一定的建議及數(shù)據(jù)支持。

1 花青素的理化特性

花青素的基本結(jié)構(gòu)單元是2-苯基苯并吡喃型陽(yáng)離子，即花色基元。在植物中常見(jiàn)的花色基元主要有天竺葵色素 （Pelargonidin）、矢車(chē)菊色素（Cyanidin）、飛燕草色素（Delphindin）、芍藥色素（Peonidin）、牽?；ㄉ兀≒etunidin）及錦葵色素（Malvidin）[15]，其基本結(jié)構(gòu)和花色基元結(jié)構(gòu)分別如圖1和表1所示。

圖1 花青素的基本結(jié)構(gòu)[16]Fig.1 Basic structure of anthocyanins

表1 常見(jiàn)花色基元結(jié)構(gòu)[16]Table 1 Chemical structure of common anthocyanins

自然條件下游離狀態(tài)的花青素極少見(jiàn)，一般均以糖苷的形式存在，常與一個(gè)或多個(gè)葡萄糖、半乳糖、鼠李糖等通過(guò)糖苷鍵形成花色苷[15，17]。目前，在植物中分離鑒定的花青素種類(lèi)超過(guò)600多種，植物中新的花色苷種類(lèi)的分離鑒定還在增加[18]。

根據(jù)不同的pH和螯合物中金屬離子，花青素所呈現(xiàn)的顏色也不同：pH＜7呈紅色，pH在7～8時(shí)呈紫色，pH＞11時(shí)呈藍(lán)色。茶葉細(xì)胞液呈酸性，因此當(dāng)茶葉中的花青素含量較高時(shí)會(huì)呈現(xiàn)紅紫色。植源性食品中的花青素易溶于水和醇類(lèi)化合物，在pH小于3的酸性條件下較為穩(wěn)定[19]。

2 茶葉中花青素的測(cè)定方法

2.1 pH示差法

pH示差法的原理為花色苷發(fā)色團(tuán)的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換是pH的函數(shù)，而對(duì)花色苷起干擾作用物質(zhì)的性質(zhì)卻不隨pH值變化。在花色苷最大吸收波長(zhǎng)下確定兩個(gè)對(duì)花色苷吸光度差別最大但是對(duì)花色苷穩(wěn)定的pH值，對(duì)花色苷進(jìn)行定量分析。

趙慧芳等[20]使用pH示差法測(cè)定黑莓果實(shí)中花色苷的含量，利用花色苷及黃酮在pH為1.0時(shí)在510 nm及700nm處均有最大吸收，而pH為4.5時(shí)僅在700 nm處有最大吸收的特點(diǎn)，用示差法測(cè)定花色苷總量（其總量以矢車(chē)菊-3-葡萄糖苷計(jì)）。殷海松等[21]參考該方法對(duì)藍(lán)莓中的花色苷進(jìn)行了測(cè)定。宋德群等[22]在520 nm下，分別測(cè)定pH1.0和pH4.5時(shí)吸光度，測(cè)定藍(lán)莓中的花色苷含量（以矢車(chē)菊-3-葡萄糖苷計(jì)）。其測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.39%，并且認(rèn)為該種方法受到其他干擾物的影響較小。張榮菲等[23]參考上述方法進(jìn)行藍(lán)莓中花青素的測(cè)定。

pH示差法目前也在茶葉中花青素檢測(cè)方面有所應(yīng)用。田野等[24]使用pH示差法測(cè)定了“紫嫣”茶中花青素的含量，其結(jié)果為2.29 mg/g。陳瓊等[25]對(duì)比了單一pH法及pH示差法分別測(cè)定茶樹(shù)芽葉中花色苷的含量，認(rèn)為單一pH法的結(jié)果與pH示差法存在很大的相關(guān)性 （R2＝0.9927），且單一pH法結(jié)果偏高，但文中pH示差法的結(jié)果較以往文獻(xiàn)結(jié)果[2，10]偏低。

pH示差法操作較為簡(jiǎn)便，較常見(jiàn)于植源性食品中花色苷的測(cè)定，但受兩個(gè)不同pH值下兩種花色苷存在形態(tài)的平衡轉(zhuǎn)化率的影響[25]，其測(cè)定結(jié)果存在偏低的現(xiàn)象。

2.2 液相色譜法

目前植源性食品中花青素的測(cè)定較常見(jiàn)使用液相色譜法。陳長(zhǎng)應(yīng)[26]使用液相色譜測(cè)定了黑綠豆中花青素的含量，其使用原花青素作為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果重復(fù)性和回收率均較好。趙子丹等[27]使用液相色譜測(cè)定黑果枸杞中的花青素含量，其使用了六種常見(jiàn)花青素（矢車(chē)菊色素、天竺葵色素、飛燕草色素、芍藥色素、牽?；ㄉ睾湾\葵色素）標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測(cè)定，且結(jié)果精密度好、準(zhǔn)確度高。

使用液相色譜法對(duì)茶葉中的花青素進(jìn)行測(cè)定的文獻(xiàn)報(bào)道也較多。李智[28]建立了一種茶樹(shù)紫色芽葉花色苷的HPLC分析方法，運(yùn)用HPLCDAD-MS/MS聯(lián)用技術(shù)，初步推測(cè)了茶樹(shù)紫色芽葉花青素中5個(gè)主要組分，分別為飛燕草-3-半乳糖苷、矢車(chē)菊-3-半乳糖苷、飛燕草-3-蕓香糖苷、矢車(chē)菊-3-蕓香糖苷和天竺葵-3-蕓香糖苷。呂海鵬等[29]使用HPLC法測(cè)定“紫娟”茶樹(shù)品種的花青素組分及其含量，認(rèn)為“紫娟”茶的花青素主要成分為4種花青素單體，分別為天竺葵素-3，5-二葡萄糖苷、矢車(chē)菊-3-O-半乳糖苷、天竺葵色素和錦葵色素，測(cè)定結(jié)果這四種花青素單體總和為0.43 mg/g。解東超等[30]使用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜的方法在紫娟烘青綠茶中鑒定出12種花青素并定量，最終測(cè)定的紫娟烘青綠茶成品茶中的花青素總量為1.82 mg/g。在標(biāo)準(zhǔn)方法方面，農(nóng)業(yè)部發(fā)布了相關(guān)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 2640—2014《植物源性食品中花青素的測(cè)定高效液相色譜法》[31]，其中使用6種花青素標(biāo)準(zhǔn)品作為標(biāo)品分別對(duì)花青素進(jìn)行定量。

液相色譜法雖然是目前較為簡(jiǎn)便快捷的一種花青素的檢測(cè)方法，但自然存在的花青素種類(lèi)繁雜、品種眾多，利用高效液相色譜法直接分析需要購(gòu)置多種標(biāo)準(zhǔn)品，成本較高，用于實(shí)際檢測(cè)仍然存在一定難度[27]。并且使用液相色譜法對(duì)紫色芽葉品種的花青素進(jìn)行的測(cè)定結(jié)果[29-30]與之前普遍認(rèn)為的紫色芽葉品種中花青素含量 （0.5%～1.0%）[2，10，29]相比普遍偏低。

2.3 分光光度法

分光光度法是較為常用的測(cè)定植源性食品中花青素的一種方法。陳長(zhǎng)應(yīng)[32]建立了一種微波消解-可見(jiàn)分光光度法測(cè)定紫甘薯中花青素的測(cè)定方法，使用原花青素作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定量測(cè)定，結(jié)果表明該方法簡(jiǎn)便準(zhǔn)確。劉長(zhǎng)姣等[33]使用分光光度法對(duì)黑米中的花青素進(jìn)行測(cè)定，使用矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定量，結(jié)果表明方法操作簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、測(cè)定結(jié)果精密度高。

使用分光光度法對(duì)茶葉中花青素的測(cè)定的文獻(xiàn)報(bào)道較少。鐘蘿[34]在《茶葉品質(zhì)理化分析》中提到測(cè)定茶葉中總花青素含量的分光光度法。茶葉磨碎后經(jīng)沸水提取，使用酸性乙醇溶液顯色后進(jìn)行比色定量。該種分光光度法操作簡(jiǎn)便，無(wú)需使用多種標(biāo)準(zhǔn)品，可大幅度降低檢測(cè)成本，因此可操作性強(qiáng)，適用于茶葉中花青素含量的測(cè)定。

3 茶葉中總花青素分光光度測(cè)定法的改進(jìn)

使用分光光度法測(cè)定茶葉中總花青素[34]時(shí)，由于茶葉提取液本身在花青素吸收波長(zhǎng)下也存在一定的吸光度，會(huì)引起測(cè)定結(jié)果偏高，因此在最后結(jié)果計(jì)算時(shí)應(yīng)扣除相應(yīng)的樣品空白。

對(duì)該方法改進(jìn)后具體操作步驟如下：稱(chēng)取磨碎茶樣2.0 g，加沸水 10 mL，在沸水浴中提取30 min，過(guò)濾后加水定容至50 mL。準(zhǔn)確吸取2 mL提取液置于試管中，加酸性乙醇溶液5 mL，搖勻。靜置30 min后于535 nm波長(zhǎng)下比色，以試劑空白作參比，同時(shí)吸取2 mL提取液加入5 mL蒸餾水作為樣品空白，在最后結(jié)果計(jì)算中扣除。

根據(jù)上述方法，對(duì)市售綠茶、紅茶和由紫芽茶加工的幾種成品茶進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表2所示。

表2 幾種茶葉中花青素測(cè)定結(jié)果Table 2 Contents of total anthocyanins in tea samples

從表2中可以看出，一般茶葉中花青素含量較低，加入酸性乙醇溶液后不會(huì)顯出明顯剛果紅色，且樣品空白值會(huì)略高于樣品測(cè)定值。而紫芽成品茶的含量均較高，重復(fù)性較好，且與以往文獻(xiàn)[2，10，29]中結(jié)果相似 。 張寶宏[35]認(rèn) 為鐘 蘿所 提出的分光光度法測(cè)定茶葉中花青素總量的方法會(huì)導(dǎo)致結(jié)果偏高，這可能就是由于未進(jìn)行樣品空白的扣除所導(dǎo)致。

4 結(jié)論與討論

文章就目前主要的三種測(cè)定植物性食品中花青素的方法進(jìn)行了綜述，這三種檢測(cè)方法的優(yōu)缺點(diǎn)如表3所示?？梢钥闯鰌H示差法雖然操作簡(jiǎn)單，但是較常以矢車(chē)菊-3-葡萄糖苷對(duì)花青素進(jìn)行定量，同時(shí)存在會(huì)導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果偏低的情況。液相色譜法雖然操作快捷，結(jié)果精密度、準(zhǔn)確性均較好，但是需要購(gòu)置較多標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定量，使檢測(cè)成本增加。

分光光度法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果重復(fù)性較好。在以往茶葉中總花青素分光光度測(cè)定方法[34]的基礎(chǔ)上，加入扣除樣品空白的步驟，消除了樣品提取液本身湯色對(duì)結(jié)果的影響。根據(jù)改進(jìn)的方法測(cè)定的幾種常見(jiàn)傳統(tǒng)茶葉與紫芽成品茶的結(jié)果也均與以往文獻(xiàn)中的結(jié)果較為一致，具有可參考與對(duì)比性。

表3 pH示差法、液相色譜法和分光光度法測(cè)定茶葉中的花青素優(yōu)缺點(diǎn)比較Table 3 Comparison among pH-differential method，high performance liquid chromatograph and spectrophotometry