一株黑木耳綠霉病病原真菌的分離鑒定及其殺菌劑的篩選*

楊 武，羅深喜，夏志蘭，徐志偉，羅 坤，**

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，湖南 長沙 410128；2.湖南省漢壽縣洲口鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)站，湖南 漢壽 415918；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食用菌研究所，湖南 長沙 410128；4.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)東方科技學(xué)院，湖南 長沙410128）

黑木耳（Auricularia auricula） 含有蛋白質(zhì)、多酚、多糖等多種營養(yǎng)成分，是1種營養(yǎng)豐富的藥食同源食用菌[1-2]。中國是世界上黑木耳栽培的起源地，距今已有1 400多年的栽培歷史，目前總產(chǎn)量已達世界的90%以上[3]。近年來，黑木耳生產(chǎn)規(guī)模越來越大，各地黑木耳菌包廠如雨后春筍般出現(xiàn)，并朝著專業(yè)化分工、大型機械化生產(chǎn)、自動化及智能化控制方向發(fā)展[4]。但是，由于單片木耳栽培技術(shù)還不成熟，栽培生產(chǎn)過程中經(jīng)常出現(xiàn)各種問題，其中細菌性病害和以鏈孢霉、綠霉等為主的真菌性病害，嚴重影響黑木耳的產(chǎn)量和品質(zhì)[5-7]。在國外也有類似的問題，早在1985年，綠色霉菌在北愛爾蘭開始流行，并迅速蔓延橫跨歐洲的農(nóng)場；此外，在美國和加拿大的蘑菇栽培中也有類似病狀的出現(xiàn)，嚴重影響食用菌的生產(chǎn)[8-9]。

木霉屬真菌可以產(chǎn)生纖維素酶、果膠酶等酶類，可用于紡織業(yè)的纖維處理、去污劑生產(chǎn)以及動物飼料加工等，同時對多種病原真菌有拮抗作用，已成為國內(nèi)外的研究熱點[10]。然而，部分木霉可產(chǎn)生胞外酶、有毒物質(zhì)、次生代謝產(chǎn)物，引起黑木耳等食用菌的綠霉病，影響食用菌的生長；該病害在食用菌生產(chǎn)過程中普遍發(fā)生，給食用菌的栽培帶來災(zāi)難[11-12]。王晶[13]通過對北京、河北、山東、遼寧、黑龍江五省的食用菌發(fā)病情況的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)在食用菌栽培過程中，侵染性病害主要以細菌性褐斑病為主，競爭性病害主要以木霉病為主。崔麗紅[14]在貴州和遼寧兩省6個地區(qū)采集了黑木耳（Auricularia auricula）、海鮮菇（Auricularia auricular）、灰樹花（Grifola frondosa）、香菇 （Lentinula edodes）、和金針菇（Flammulina velutipes） 等7種食用菌的感病栽培菌棒樣本61份，經(jīng)分離純化發(fā)現(xiàn)，木霉屬真菌是感染食用菌的優(yōu)勢病原菌，其次為青霉屬（Penicliilum）真菌、曲霉屬 （Aspergillus） 真菌、鐮孢菌屬（Fusarium） 真菌，共占分離出的病原菌菌株的71.36%。

雖然黑木耳主要產(chǎn)自東北三省、河南、河北、山東等北方地區(qū)，但湖南多地的氣候也適合栽培黑木耳。然而，在“北耳南移”過程中，由于湖南大部處于丘陵地帶，氣候潮濕，黑木耳的栽培過程中容易產(chǎn)生病害，這一問題成為該產(chǎn)業(yè)在南方發(fā)展的絆腳石。以懷化地區(qū)為例，筆者前期研究發(fā)現(xiàn)黑木耳生產(chǎn)過程中出現(xiàn)過青霉（Penicillium paneum）、木霉 （Trichoderma longibrachiatum） 及毛霉 （Exserohilum turcicum） 等病害，其中木霉危害最為嚴重，有的地塊污染率達到50%以上，嚴重威脅到黑木耳的正常生產(chǎn)。針對這一問題，筆者從懷化地區(qū)采集黑木耳罹病樣品，通過對病原菌進行分離鑒定，對其殺菌劑進行篩選，旨在為防治當(dāng)?shù)睾谀径木G霉病提供一定指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

罹病黑木耳樣品收集自湖南省麻陽縣；供試食用菌（杏鮑菇、靈芝、大球蓋菇、雙孢蘑菇、姬松茸、秀珍菇）菌種均由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食用菌研究所提供；供試真菌的培養(yǎng)使用馬鈴薯瓊脂葡萄糖（PDA）培養(yǎng)基；Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒和SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒購自上海生工生物工程股份有限公司；引物合成和序列測定由上海生工生物工程技術(shù)有限公司進行；供試殺菌劑詳見表1。

表1 殺菌劑種類Tab.1 Types of fungicide

1.2 病原真菌的分離與純化

1.3 病原真菌的鑒定

1.3.1 病原菌培養(yǎng)性狀的觀察

將保存于冰箱的病原菌菌株進行活化，待菌落長滿培養(yǎng)皿后，用打孔器打取組織塊于新的PDA培養(yǎng)基中央，置于28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔12 h觀察菌落形態(tài)，記錄菌絲的厚薄、疏密和顏色變化，并測量菌落直徑，

1.3.2 病原菌形態(tài)學(xué)鑒定

挑取活化的病原菌于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待菌落變綠時進行臨時片的制作，在顯微鏡下觀察并記錄分生孢子梗和分生孢子的顏色、大小等特征。木霉的鑒定參照崔麗紅[14]和吳小平[15]等資料進行。

1.3.3 病原菌分子生物學(xué)鑒定

菌株AD092基因組DNA的提?。翰≡婢蚪MDNA的提取采用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提盒進行。

ITS序列的PCR擴增、片段回收和序列測定：選用正向引物 ITS 1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和 反 向 引 物 ITS 4： 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’；以基因組DNA為模板。擴增條件為94℃預(yù)變性4 min；94℃變性45 s，55℃復(fù)性45 s，72℃延伸 1 min，30個循環(huán)；72℃延伸 10 min。反應(yīng)體系為25 uL。采用1%瓊脂糖電泳對擴增產(chǎn)物進行檢測，采用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒進行PCR擴增產(chǎn)物的回收。待產(chǎn)物回收后，送至上海生工進行序列的測定。

本文從不同角度對廣西與東盟國家跨境貿(mào)易發(fā)展及跨境人民幣結(jié)算現(xiàn)狀進行深入分析。同時，選取當(dāng)年累計出口額、當(dāng)年累計進口額及跨境人民幣結(jié)算量等具有代表性的指標(biāo)，運用協(xié)整檢驗、構(gòu)建VAR模型和脈沖響應(yīng)函數(shù)等分析方法，對廣西跨境人民幣結(jié)算ln（crmb）與廣西—東盟進出口貿(mào)易ln（ix）、ln（ex）三個指標(biāo)變量的關(guān)系進行實證分析。

序列分析及系統(tǒng)發(fā)育分析：將測序獲得菌株的ITS序列與NCBI中GenBank數(shù)據(jù)庫中核酸序列進行比對，通過 BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）分析其與已知序列的相似度，推測菌株AD092的屬種，結(jié)合MEGA 7軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析，構(gòu)建菌株的系統(tǒng)進化樹。

1.4 病原真菌致病性回接

將病原真菌接種于PDA培養(yǎng)基上于28℃培養(yǎng)5 d，用無菌水將孢子洗脫后用3層紗布過濾，制成病原真菌孢子懸浮液備用。

取健康的黑木耳菌袋，無菌條件下將病原真菌孢子懸浮液噴灑于菌袋頂部，用等量無菌水作為對照，各設(shè)置3個重復(fù)，置于25℃、RH為60%的條件下培養(yǎng)，每天觀察發(fā)病情況并做好記錄，菌袋發(fā)病后，再次分離培養(yǎng)病原菌，與原接種病原菌菌株進行比較，確定致病病原菌。

1.5 長枝木霉對不同食用菌的侵染能力

鑒于食用菌菌絲比病原真菌菌絲生長慢，因此先用無菌的7 mm打孔器將活化好的6種食用菌菌絲打出大小一致的組織塊，在平板一側(cè)接種。待靈芝生長2 d，杏鮑菇生長4 d，雙胞蘑菇、木耳及秀珍菇生長5 d，姬松茸生長6 d后，分別在平板另一側(cè)接種病原菌。觀察菌絲交接處食用菌菌絲的生長情況，判斷長枝木霉對不同食用菌的侵染能力[15]，每個處理設(shè)3個重復(fù)。

1.6 幾種殺菌劑的抑菌活性

采用菌絲生長速率法[16]進行抑菌效果的測定。選取表1中的4種殺菌劑，將100 mg·L-1的母液按照 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的濃度進行稀釋后倒入約12 mL PDA培養(yǎng)基（55℃左右），每皿加入1 mL上述藥液混勻，制成平板。冷卻后，每皿中央接種長枝木霉菌餅（直徑7 mm），以水作為對照（CK），每個處理設(shè)3個重復(fù)，置于培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)，待CK菌落長滿整個平板的2/3時，用十字交叉法測定菌落直徑，抑菌率（P，%）計算公式為：

式中：R1（mm） 表示對照菌落直徑；R2表示處理菌落直徑（mm）；R表示菌餅直徑（mm）。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原真菌的分離與純化

從采集地收集的污染菌袋中，分離得到1個菌株，活化2次～4次后，置于PDA斜面培養(yǎng)基中培養(yǎng)2 d，后轉(zhuǎn)至4℃冰箱保存。

2.2 病原真菌的分類鑒定

2.2.1 菌株AD092的形態(tài)特征和培養(yǎng)性狀

菌株AD092的生長速度見圖1、形態(tài)特征見圖2。

圖1 菌株AD092菌落生長速度Fig.1 Growth rate of colony of strain AD092

圖2 長枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）的形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of Trichoderma longibrachiatum

結(jié)合圖1和圖2分析，菌株AD092在PDA平板上生長0.5 d時菌落直徑達1.97 cm，0.5 d～2.5 d為快速生長期，培養(yǎng)2.5 d菌落直徑達到最大，為8.5 cm，4 d時菌落已全部老熟，由白色轉(zhuǎn)變?yōu)榫G色，且常出現(xiàn)“膿泡”狀結(jié)構(gòu)，即分生孢子梗叢束，菌絲似氈狀。分生孢子梗長且較直，次級分枝通常較短，呈直角狀伸出，但基部的次級分枝較長，常單個生出或互生，幾乎不會再次分枝。瓶梗單生或2個～6個輪生，基部略微變細，呈圓柱狀，頂部明顯變細，頂端瓶?；坎灰缈s，其下著生很多間生瓶梗。分生孢子單孢無色，呈倒卵形或橢圓形，大小為 （2.3～3.1） μm × （3.9～5.5） μm。

2.2.2 菌株AD092的分子生物學(xué)鑒定

菌株AD092的分子生物學(xué)分析結(jié)果見圖3、圖4。

圖3 菌株AD092的瓊脂糖凝膠電泳Fig.3 Agarose gel electrophoresis of strain AD092

由圖3可知，菌株AD092的ITS序列全長為572 bp，通過BLAST比對發(fā)現(xiàn)，AD092與長枝木霉（Trichoderma longibrachiatum） 的相似度最高，相似性為99%。

圖4 菌株AD092的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain AD092

由圖4可知，將菌株的ITS序列與BLAST搜索到的相近菌株進行比較，結(jié)合Mega 7軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明，菌株AD092與長枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）位于同一分枝上，相似度最高，結(jié)合形態(tài)特征與培養(yǎng)性狀分析，將其鑒定為長枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）。

2.3 菌株AD092的致病性回接

菌株AD092的致病性回接試驗結(jié)果見圖5。

由圖5可知，將分離純化的AD092菌株回接到黑木耳菌袋上，觀察發(fā)現(xiàn)黑木耳菌袋頂部覆蓋一層深綠色霉，這一癥狀與采集回來的菌袋癥狀一致。將該菌袋中的病原菌進一步分離純化，發(fā)現(xiàn)該菌的菌落形態(tài)與菌株AD092的一致，初步判斷長枝木霉是黑木耳綠霉病的致病菌。

圖5 菌株AD092的致病性回接Fig.5 Pathogenicity inoculation of strain AD092

2.4 長枝木霉對不同食用菌的侵染能力

平板對峙試驗表明，長枝木霉對不同食用菌侵染能力不同。對靈芝、姬松茸和大球蓋菇侵染能力強，木霉菌絲逐漸蔓延至交接處，并且能夠侵入其菌絲，導(dǎo)致其菌絲的枯萎死亡。對黑木耳、杏鮑菇和秀珍菇侵染能力中等，木霉菌絲能夠蔓延至交接處但不繼續(xù)侵入，交接處食用菌菌絲變黃枯萎。

2.5 幾種殺菌劑的抑菌活性

目前為止，在食用菌生產(chǎn)過程中運用的化學(xué)藥劑種類較少，本文選取了4種常見的殺菌劑進行抑菌試驗，結(jié)果見表2。

表2 4種殺菌劑對長枝木霉的抑菌活性測定Tab.2 Determination of inhibitory activity of 4 fungicides against Trichoderma longibrachiatum

由表2可知，在4種殺菌劑中咯菌腈對長枝木霉的抑菌效果最好，10-1稀釋液抑菌率高達97.8%，稀釋濃度為10-2和10-3時，抑菌率分別達到了96.7%、95.6%；其次是多菌靈，10-1稀釋液抑菌率為68.9%，但稀釋濃度為10-2、10-3、10-4、10-5時抑菌效果較差；其他藥劑基本上沒有抑菌功能。

3 結(jié)論與討論

從懷化市麻陽縣采集的30個染病的黑木耳菌袋中，分離出1種病原真菌，通過進行形態(tài)學(xué)、培養(yǎng)特性觀察和ITS序列分析，鑒定為長枝木霉。以長枝木霉為指示菌對7種食用菌進行平板對峙，結(jié)果表明，長枝木霉對不同食用菌侵染能力不同，大部分食用菌在受到木霉感染后，生長緩慢甚至停滯，嚴重影響產(chǎn)量和品質(zhì)。選用食用菌生產(chǎn)中常用的殺菌劑進行抑菌活性試驗，發(fā)現(xiàn)咯菌腈對木霉的抑制效果最好，稀釋液稀釋濃度為10-1時抑菌率達97.8%，其次為多菌靈，稀釋濃度為10-1時抑菌率達68.9%。

哈茨木霉（Trichoderma harzianum）、長枝木霉（Trichoderma longibrachiatum）、康氏木霉 （Trichoderma koningii）是污染食用菌的常見木霉種，不同地區(qū)致病率稍有差異[13]。吳小平[15]從福建省、浙江省等地分離得到4種木霉屬真菌，其中哈茨木霉和長枝木霉致病率最高，共達88%。顏一紅[17]從福州、古田等地分離得到7種木霉屬真菌，其中長枝木霉致病率為19.78%，僅次于康氏木霉。

由于食用菌與許多病原菌及雜菌有同源性，且病原菌及雜菌一般具有繁殖快、競爭力強的特點，伴隨著食用菌生產(chǎn)的每個環(huán)節(jié)，因此目前還沒有真正有選擇性的殺菌劑可供使用[18-19]。劉仁奎[15]通過苯醚甲環(huán)唑、多菌靈、百菌清、嘧菌酯、溴菌腈、異菌脲及納他毒素對哈茨木霉的防效比較得出，納他霉素對哈茨木霉具有較好的防效，而且納他霉素作為一種安全的食品添加劑，具有低劑量、高防效及抗菌時間長的優(yōu)點，適宜做為食用菌生產(chǎn)中哈茨木霉病害防治的藥劑。李晶等[20]研究了7種常見的殺菌劑對菌草食用菌4種病原真菌的室內(nèi)毒力測定，結(jié)果表明百菌清對哈茨木霉的抑制作用最好，而多菌靈對側(cè)耳木霉的抑制作用最好，說明不同病原菌對殺菌劑的敏感性不同，在進行多病害防治時應(yīng)選擇殺菌廣譜、毒性低、效果顯著的農(nóng)藥。

木霉具有適應(yīng)性強，傳播蔓延快的特點[21]一旦發(fā)生，后果嚴重。本試驗發(fā)現(xiàn)，咯菌腈對長枝木霉的防治效果較好，稀釋濃度為10-1～10-3的稀釋液對菌絲生長的抑制率均達到90%以上，可在源頭上抑制木霉的傳播與蔓延，將病害限制在極小范圍內(nèi)。同時，量少且防效顯著，減少產(chǎn)量損失。

目前，咯菌腈在菌袋上的防效試驗正在開展。而對咯菌腈有效成分的提取、結(jié)構(gòu)鑒定、抑菌機理以及與其他殺菌劑的混用效果有待進一步研究，從而為黑木耳綠霉病的有效防治奠定基礎(chǔ)。