李 艷，彭超軍，王玉民，胡 琳，齊學(xué)禮

(河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院小麥研究所/小麥國家工程實驗室/河南省小麥生物學(xué)重點實驗室，河南鄭州 450002)

氮是植物生長發(fā)育所必需的第一大礦質(zhì)營養(yǎng)元素。氮肥作為最重要的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)投入品之一，為農(nóng)作物產(chǎn)量的大幅度提高做出了重要貢獻。但氮肥的過度施用也造成了農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的破壞，如土壤酸化、地下水硝酸鹽超標、溫室氣體排放等環(huán)境污染問題[1-5]，同時，亦降低了肥料利用效率，提高了生產(chǎn)成本[6-9]。小麥籽粒產(chǎn)量和蛋白質(zhì)含量與氮肥的合理施用及氮代謝密切相關(guān)，合理運籌氮肥是實現(xiàn)小麥優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)高效的重要措施[10-11]。

小麥籽粒中的氮素有相當一部分來自于營養(yǎng)器官氮素的花后再轉(zhuǎn)移[10]，營養(yǎng)器官轉(zhuǎn)移至穗中的氮素占穗氮累積量的51%～91%[12]。小麥開花前后的氮同化能力存在基因型差異，高產(chǎn)高蛋白小麥品種植株不僅開花前后氮同化量及干物質(zhì)累積量高，而且花后具有氮轉(zhuǎn)運效率高的特性[13]。籽粒蛋白質(zhì)含量與氮素轉(zhuǎn)移效率和氮素收獲指數(shù)呈顯著正相關(guān)[14]。小麥植株體內(nèi)的氮素主要是以氨基酸的形式運輸?shù)阶蚜?，用于合成籽粒蛋白質(zhì)；且游離氨基酸含量與籽粒蛋白質(zhì)合成相關(guān)指標呈顯著或極顯著正相關(guān)[15]。增施氮肥能提高小麥氮代謝同化途徑關(guān)鍵酶活性[10]和地上部總游離氨基酸含量。研究表明，小麥籽粒氨基酸含量存在基因型間差異[16]。目前，針對不同品質(zhì)類型的小麥在氮素同化利用和氮代謝方面的系統(tǒng)研究報道比較少，尤其是關(guān)于氮同化途徑關(guān)鍵酶基因表達的研究。本研究擬以強筋小麥品種鄭麥7698和中筋小麥品種周麥18為材料，分析高肥和低肥水平下，小麥植株的氮素吸收轉(zhuǎn)運、游離氨基酸含量、氮同化途徑關(guān)鍵酶基因的表達及產(chǎn)量性狀，旨在為選育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)高效的小麥新品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與設(shè)計

研究于2016-2017年在河南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究開發(fā)基地進行。供試品種為生產(chǎn)中大面積推廣品種鄭麥7698和河南省區(qū)試對照品種周麥18。

試驗設(shè)高肥和低肥兩個肥力水平，高肥基礎(chǔ)肥力：有機質(zhì)10.6 g·kg-1，堿解氮73.9 mg·kg-1，有效磷40.2 mg·kg-1，速效鉀189.5 mg·kg-1。高肥處理施肥：有機肥7 500 kg·hm-2，尿素375 kg·hm-2，磷酸二銨300 kg·hm-2，氯化鉀75 kg·hm-2。低肥基礎(chǔ)肥力：有機質(zhì)9.3 mg·kg-1，堿解氮62.0 mg·kg-1，有效磷9.5 mg·kg-1，速效鉀76.5 mg·kg-1。低肥處理施肥：尿素187.5 kg·hm-2，磷酸二銨150 kg·hm-2，氯化鉀 37.5 kg·hm-2。4個重復(fù)，小區(qū)面積為6.75 m2，播量為每小區(qū)100 g，于2016年10月7日播種。

1.2 測定指標和方法

1.2.1 氮素含量的測定

于小麥開花期取樣，剪去植株的根系，將地上部分為葉、莖鞘、穗三部分；105 ℃殺青0.5 h， 70 ℃烘干至恒重，稱重后粉碎。地上部干物質(zhì)重為葉、莖鞘、穗干物質(zhì)重之和。利用碳氮元素分析儀(Vario Micro Cube, CHNS model, Elementar, Hanua, Germany)測定樣品中氮濃度。每個組織器官的干物質(zhì)重乘氮濃度可得氮素量。

氮素收獲指數(shù)=成熟期籽粒氮積累量/成熟期地上部總氮積累量；氮素轉(zhuǎn)運量=開花期植株氮素積累積累量-成熟期營養(yǎng)器官氮素積累總量；花后氮同化量=籽粒氮素積累總量-氮素轉(zhuǎn)運量。

1.2.2 氨基酸含量的測定

于拔節(jié)期、開花期和成熟期取小麥植株旗葉，保存在液氮中。稱取小麥旗葉1 g，在研缽中加入液氮，將葉片研磨成細粉，迅速轉(zhuǎn)移至10 mL離心管中，加入100 mM HCl 3 mL，渦旋混合1 min后超聲提取30 min，加入6%(w/v)磺基水楊酸溶液1 mL，沉淀蛋白，充分振搖后，于4 ℃下 10 000 r·min-1離心10 min，取上清液過0.22 μm濾膜，濾液用氨基酸分析儀測定(L8 900, Hitachi, Japan)。標準品試劑購自Wako Pure Chemical Industries(Japan)，不同pH洗脫液購自Mitsubishi Chemical Industry(Japan)。外標法測定樣品溶液中各游離氨基酸含量，其中脯氨酸在 440 nm波長下檢測，其他氨基酸在 570 nm波長下檢測 。

1.2.3 基因相對表達量的測定

于開花期取小麥植株旗葉，保存在液氮中。樣品RNA提取采用Ultrapure RNA kit試劑盒(康為世紀生物科技有限公司，北京)，按照說明進行操作，利用1%瓊脂糖電泳檢測RNA完整性。采用ReverTre Ace qPCR RT Kit(TOYOBO,Japan)試劑盒，按照說明進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。利用分光光度計(NanoDrop 2000,Thermo Scientific,USA)檢測提取的RNA和cDNA濃度。氮代謝相關(guān)酶基因的引物依據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中登錄號所對應(yīng)的序列，利用Primer premier 5.0軟件設(shè)計，目的基因和內(nèi)參基因(Actin)的引物見表1。qRT-PCR在Bio-Rad iQTM5定量PCR儀上進行，SYBR Green 購自Thermo scientific,USA。反應(yīng)體系為25 μL。反應(yīng)程序： 95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，57 ℃ 30 s， 72 ℃ 30 s，40個循環(huán)。每個樣品重復(fù)3次。基因相對表達量參照2-△△Ct法計算[17]。

表1 氮代謝同化酶基因的qRT-PCR引物Table 1 qRT-PCR primers for nitrogen metabolism related genes

1.2.4 產(chǎn)量性狀調(diào)查

小麥成熟后，進行實打測產(chǎn)，并調(diào)查穗數(shù)、穗粒數(shù)、千粒重。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)的平均值。運用SPSS 20.0對所有數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，用Fisher’s最小差異顯著法(LSD)進行t檢驗。用Excel 2010制作圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種肥力水平下小麥的氮素吸收運轉(zhuǎn)特性

2.1.1 植株地上部氮素積累量及其收獲指數(shù)

從表2可以看出，鄭麥7698和周麥18的氮素累積量隨生育期后移而增加，成熟期積累量最高；同一生育時期，肥力水平越高，地上部氮素積累量越多。各生育時期，高肥和低肥水平下鄭麥7698植株的地上部氮素積累量均顯著或不顯著高于周麥18。

高肥水平下，鄭麥7698的氮素收獲指數(shù)略低于周麥18，而低肥水平下顯著高于周麥18。說明低肥水平下鄭麥7698的氮素利用效率顯著高于周麥18。

2.1.2 氮素轉(zhuǎn)運量和花后氮同化量

由表3可以看出，在高肥和低肥水平下，鄭麥7698氮素轉(zhuǎn)運量和花后氮同化量均顯著高于周麥18。兩個品種在高肥水平下的氮素轉(zhuǎn)運量和花后氮同化量均顯著高于低肥水平(P<0.05)，說明增加施肥量可以提高小麥氮素轉(zhuǎn)運量和花后氮同化量。

由表3還可看出，氮素轉(zhuǎn)運量占籽粒氮積累總量的71.97%～84.47%，花后氮同化量占籽粒氮積累總量的15.53%～28.03%，說明籽粒中的氮主要來源于花前營養(yǎng)器官的再運轉(zhuǎn)，提高花前營養(yǎng)器官的氮素含量有利于促進籽粒氮的積累。鄭麥7698在兩種肥力水平的氮素轉(zhuǎn)運量占籽粒氮的比例均顯著低于周麥18，花后氮同化量占籽粒氮比例則均顯著高于周麥18。兩個品種高肥下的氮素轉(zhuǎn)運量占籽粒氮比例顯著低于低肥，花后氮同化量占籽粒氮比例則顯著高于低肥(P<0.05)。

表2 兩種肥力條件下植株地上部氮素含量和氮素收獲指數(shù)Table 2 Nitrogen content of shoot and nitrogen harvest index(NHI) under two fertility treatments

*代表鄭麥7698與周麥18的差異顯著(P<0.05)。下同。

* indicate significant differences between Zhengmai 7698 and Zhoumai 18(P<0.05).The same below.

表3 兩種肥力條件下小麥氮素同化運轉(zhuǎn)特性Table 3 Characteristics of nitrogen assimilation and translocation in wheat under two fertility treatments

2.1.3 關(guān)鍵氨基酸含量

由表4可以看出，高肥和低肥水平下，鄭麥7698的總游離氨基酸含量分別比周麥18提高了1.33%和11.35%，鄭麥7698中天冬氨酸、天門冬酰胺、谷氨酸和谷氨酰胺的平均含量均顯著高于周麥18，而絲氨酸的平均含量顯著低于周麥18；其余氨基酸的平均含量，在低肥水平下除了異亮氨酸和脯氨酸的平均含量，鄭麥7698顯著低于周麥18之外，鄭麥7698與周麥18的其他氨基酸平均含量差異不顯著。在兩種肥力水平下，鄭麥7698的谷氨酰胺占總游離氨基酸的比例均顯著高于周麥18；鄭麥7698的總游離氨基酸含量均高于周麥18；高肥水平兩個品種開花期小麥旗葉總游離氨基酸及多數(shù)氨基酸含量均高于低肥水平。說明增加施肥量可以提高小麥植株旗葉總游離氨基酸及多數(shù)氨基酸含量。

2.2 兩種肥力水平下氮代謝相關(guān)酶基因的表達

植物葉片涉及氮代謝的主要同化酶基因有硝酸還原酶基因NR、谷氨酰胺合成酶基因GS、谷氨酸合酶基因GOGAT、谷氨酸脫氫酶基因GDH、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶基因AspAT、天冬酰胺合成酶基因ASN。由圖1可以看出，低肥水平下，開花期鄭麥7698旗葉中TaGS2、TaGOGAT、TaGDH、TaAspAT、TaASN1基因的相對表達量均極顯著高于周麥18。高肥水平下，鄭麥7698旗葉中TaNR、TaGS2、TaGOGAT、TaGDH基因的相對表達量顯著或極顯著高于周麥18，而鄭麥7698與周麥18的TaNR、TaAspAT和TaASN1基因相對表達量差異不顯著。說明低肥水平下，鄭麥7698氮代謝主要同化途徑酶基因的相對表達量極顯著高于周麥18，使鄭麥7698比周麥18具有更強的氮素吸收能力。

表4 兩種肥力條件下小麥葉片各游離氨基酸含量Table 4 Free amino acid content in flag leaves of wheat under two fertility treatments nmol·g-1 FW

占比指占總氨基酸含量的百分比。

Ratio means the percentage of individual amino acid in total amino acids.

2.3 兩種肥力水平下小麥的籽粒產(chǎn)量及其構(gòu)成因素

由表5可知，鄭麥7698在高肥水平的產(chǎn)量比低肥水平增產(chǎn)21.0%，周麥18增產(chǎn)23.9%，說明高肥水平有利于小麥籽粒產(chǎn)量增加；低肥水平下鄭麥7698產(chǎn)量下降幅度較周麥18小。高肥和低肥水平下，鄭麥7698比周麥18分別增產(chǎn)0.64%和3.06%。兩種肥力下鄭麥7698的穗粒數(shù)均顯著高于周麥18，有效穗數(shù)和千粒重在品種間無顯著差異。說明鄭麥7698比周麥18具有較高的產(chǎn)量水平，且鄭麥7698對肥力的敏感性較弱。

3 討 論

3.1 土壤肥力和基因型對小麥植株氮素吸收轉(zhuǎn)運的影響

小麥形成籽粒產(chǎn)量所需氮素約有80%來自開花前營養(yǎng)器官積累的氮素向籽粒的再轉(zhuǎn)運，20%來自開花后氮素的吸收同化[18-20]。合理運籌氮肥可以促進小麥植株花前營養(yǎng)器官氮素的積累，有利于氮素向籽粒轉(zhuǎn)運，從而提高小麥籽粒產(chǎn)量和氮素利用效率[21-22]。

H：高肥處理；L：低肥處理，*和**分別代表鄭麥7698與周麥18的差異顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)。

H:High fertility treatment; L:Low fertility treatment.* and ** indicate significant differences between Zhengmai 7698 and Zhoumai 18 at 0.05 and 0.01 levels，respectively.

圖1 兩種肥力條件下小麥植株葉片氮代謝途徑關(guān)鍵酶基因的相對表達水平

施氮可以增加小麥植株的氮素吸收和花前營養(yǎng)器官的氮累積[23-24]，但降低了花后營養(yǎng)器官積累的氮素向籽粒的轉(zhuǎn)運效率[11]。本研究結(jié)果表明，同一品種在高肥水平下的氮素轉(zhuǎn)運量和花后氮同化量均明顯高于低肥水平。說明增加施氮量可增加小麥地上部氮素積累總量和轉(zhuǎn)運量。同一肥力水平下，強筋小麥品種鄭麥7698的氮素轉(zhuǎn)運量和花后氮同化量均顯著高于中筋小麥品種周麥18，說明氮素吸收利用效率在小麥基因型間存在顯著差異，這與前人研究結(jié)果一致[25]。開花期之前，鄭麥7698地上部氮素積累總量比周麥18提高幅度在高肥水平下大于低肥水平，而在成熟期低肥水平大于高肥水平，說明鄭麥7698花前和花后吸氮量均大于周麥18，低肥水平下花后吸氮量鄭麥7698表現(xiàn)更強。進一步證明強筋小麥鄭麥7698比中筋小麥周麥18具有較強的氮素吸收效率。因此，在小麥生產(chǎn)中，應(yīng)選擇花前氮素積累量高，花后氮轉(zhuǎn)運量和吸收量強的小麥品種，不僅可提高小麥的籽粒產(chǎn)量，也可改善其品質(zhì)特性。

3.2 土壤肥力對小麥氮代謝的影響

增施氮肥促使植株體內(nèi)多個途徑中的多個基因發(fā)生響應(yīng)，除了植株體內(nèi)氮的再循環(huán)和再活化途徑之外，氮的吸收、同化和轉(zhuǎn)運過程，根據(jù)基因型、環(huán)境和施氮水平不同，對氮肥的響應(yīng)亦存在差異[26]。小麥氮代謝同化途徑關(guān)鍵酶包括硝酸還原酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合酶、谷氨酸脫氫酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶和天冬酰胺合成酶。谷氨酰胺是非必要氨基酸，但在代謝中起非常重要的作用，是構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸，又是合成含氮物質(zhì)的氮源。氨基酸是小麥籽粒蛋白的組成成份，其總含量可以近似的代表蛋白質(zhì)含量[27]。增施氮肥可顯著提高根系的谷氨酰胺合成酶活性[11]和各器官中的游離氨基酸含量。本研究結(jié)果表明，高肥水平下小麥谷氨酰胺在葉片中的含量及其占總游離氨基酸的比例顯著高于低肥。在兩種肥力水平下，鄭麥7698谷氨酰胺含量及其占總游離氨基酸比例均顯著高于周麥18。氮代謝同化途徑關(guān)鍵酶基因的相對表達量隨肥力水平降低而提高，低肥水平下，鄭麥7698氮代謝關(guān)鍵酶基因相對表達量均極顯著高于周麥18，這導(dǎo)致了鄭麥7698具有較強氮素吸收能力和較高的氨基酸含量。另外，鄭麥7698的產(chǎn)量在低肥水平下明顯高于周麥18，且隨著施肥量減少，鄭麥7698產(chǎn)量下降幅度較小。說明增強氮代謝途徑關(guān)鍵酶基因的表達，可以促進小麥植株對氮素的吸收同化能力，提高游離氨基酸含量，進而提升小麥產(chǎn)量水平。綜上所述，低肥水平下，鄭麥7698較周麥18具有較高的氮素吸收能力，花后具有較高的氮素轉(zhuǎn)運率和花后氮同化量，其氮代謝關(guān)鍵酶活性基因的表達量也顯著高于周麥18，這是其在具有強筋特性的同時仍能保持高產(chǎn)的原因，也是鄭麥7698具有高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高效特性的機制。