徐 肖，潘雨涵，沈會(huì)權(quán)，呂 超，郭寶健，王菲菲，許如根

(1.揚(yáng)州大學(xué)江蘇省作物遺傳生理國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育點(diǎn)/糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心/教育部植物功能基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/揚(yáng)州大學(xué)大麥研究所，江蘇揚(yáng)州 225009； 2.江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇鹽城 224001)

由大麥黃花葉病毒(BaYMV)和大麥溫和花葉病毒(BaMMV)引起的大麥黃花葉病主要危害中國(guó)冬大麥生產(chǎn)。BaYMV和BaMMV于冬季通過(guò)土壤禾谷多粘菌侵入大麥根部，再隨水分運(yùn)輸至植株葉片，春季在葉片內(nèi)增殖破壞大麥葉片的葉綠體，使葉片呈現(xiàn)黃色花斑。不同大麥品種對(duì)病毒的抗性不同，病毒在葉片增殖的速度及破壞的程度不同，葉片的黃化程度也不同，葉片黃化會(huì)降低葉片的光合能力，削弱植株長(zhǎng)勢(shì)，使植株矮化甚至死亡。大麥黃花葉病不但影響大麥產(chǎn)量，而且會(huì)降低籽粒品質(zhì)[1]。選育和推廣抗病新品種是防止大麥黃花葉病危害的最經(jīng)濟(jì)有效方法。大麥黃花葉病抗性基因來(lái)源廣泛，遍及大麥的7條染色體。已報(bào)道的大麥黃花葉病抗病基因有18個(gè)，僅Rym14Hb、Rym16Hb、Rym17為顯性基因，其他均為隱性抗病基因。其中，Rym14Hb和Rym16Hb來(lái)自于球莖大麥，分別位于6HS上和2HL末端，它們對(duì)歐洲病毒株系BaMMV、BaYMV-1及BaYMV-2[2-3]均具有抗性。位于3號(hào)染色體的Rym17來(lái)自于巴基斯坦的野生六棱大麥品種PK23-2，抗病基因rym18位于該品種的4號(hào)染色體，Rym17和rym18均能抗日本病毒株系BaYMV-Ⅰ和BaYMV-Ⅲ[4]。位于4號(hào)染色體長(zhǎng)臂的rym1來(lái)自于抗病品種木石港3號(hào)[5]，高抗日本病毒株系BaYMV-Ⅰ、BaYMV-Ⅱ、BaMMV-Nal及BaMMV-Kal，中抗BaYMV-Ⅲ，對(duì)歐洲所有病毒株系均表現(xiàn)免疫[6-7]。位于7號(hào)染色體的rym2來(lái)自于日本抗病品種Mihori Hadaka 3[8]，高抗歐洲病毒株系BaMMV、BaYMV-1和BaYMV-2[9]。位于5H短臂的rym3來(lái)自于誘變材料Ea52[10]，高抗日本病毒株系BaYMV-Ⅰ、BaYMV-Ⅱ和BaYMV-Ⅴ，高感BaMMV[11]。位于3HL的rym4和rym5是一對(duì)等位基因[12]，rym4來(lái)自于克羅地亞的地方品種Ragusa[13-14]，抗歐洲病毒株系BaYMV-1和BaMMV，對(duì)BaYMV-2表現(xiàn)感病[15]；rym5來(lái)自于大麥品種Misato Golden[16]，對(duì)日本病毒株系BaYMV-Ⅰ、BaYMV-Ⅱ、BaYMV-Ⅳ和BaYMV-Ⅴ均具抗性[17]。位于3HL的rym6和rym10也是一對(duì)等位基因，rym6來(lái)自于抗病品種AmagiNijo，僅抗日本病毒株系BaYMV-Ⅱ，感歐洲BaYMV和BaMMV所有病毒株系[18]；rym10來(lái)自于德國(guó)抗病品種Heberna[19]，高抗歐洲病毒株系BaYMV-1和BaYMV-2[20]。位于1HS的抗病基因rym7，抗歐洲BaMMV病毒株系[21]。位于4號(hào)染色體長(zhǎng)臂的端粒區(qū)的抗病基因rym8、rym9、rym12和rym13，rym8來(lái)自南斯拉夫大麥品種10247，抗歐洲BaYMV-1和BaMMV株系[22]；rym9來(lái)自抗病材料Bulgarian 347[23]，僅抗歐洲BaMMV病毒株系[22]；rym12來(lái)自于韓國(guó)抗病品種Muju covered 2，高抗歐洲所有病毒株系[24]；rym13來(lái)自于臺(tái)灣抗大麥黃花葉病品種Taihoku A，抗歐洲所有病毒株系[25-26]。位于4HL的rym11抗歐洲所有病毒株系[24]。位于6HS的rym15抗歐洲病毒株系BaYMV-1、BaYMV-2和BaMMV[27]。

我國(guó)長(zhǎng)江中下游地區(qū)是大麥黃花葉病的高發(fā)區(qū)，寄主和病原菌相互作用，協(xié)同進(jìn)化，不斷產(chǎn)生新的病毒株系，導(dǎo)致育成品種抗性降低，嚴(yán)重影響大麥產(chǎn)量與品質(zhì)。因此，引入新的抗病基因、提高品種的抗病性是當(dāng)務(wù)之急。揚(yáng)農(nóng)啤5號(hào)是揚(yáng)州大學(xué)大麥研究所2005年育成的優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)多抗啤酒大麥品種，在江蘇等省廣泛推廣，對(duì)大麥黃花葉病抗性穩(wěn)定。本研究以揚(yáng)農(nóng)啤5號(hào)和感病品種日引3號(hào)構(gòu)建的重組自交系(Recombinant indred lines, RIL)群體為材料，進(jìn)行抗性QTL定位，以期挖掘出新的抗病基因，為培育高抗優(yōu)質(zhì)大麥新品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

以大麥黃花葉病高抗品種揚(yáng)農(nóng)啤5號(hào)和感病品種日引3號(hào)構(gòu)建的253個(gè)重組自交系F6群體及親本為材料，所有材料均由揚(yáng)州大學(xué)大麥研究所提供。

1.2 田間種植

分別于2013年、2014年和2015年秋季將參試材料種植于揚(yáng)州大學(xué)大麥黃花葉病病圃，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每個(gè)材料種植1行，行長(zhǎng)1.2 m，行距0.2 m，每行點(diǎn)播40粒，3次重復(fù)。

1.3 抗性鑒定

在大麥黃花葉病發(fā)病初始階段對(duì)參試材料抗病性進(jìn)行調(diào)查和鑒定，每個(gè)材料連續(xù)調(diào)查10株，每隔7 d調(diào)查1期，連續(xù)調(diào)查3期。調(diào)查時(shí)期：2014年：2月22日、3月1日和3月8日；2015年：3月3日、3月10日和3月17日；2016年：3月1日、3月8日和3月15日。

參照黃培忠等[28]的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病情分級(jí)和抗性級(jí)別判定。

1級(jí)(高抗)—葉片呈正常綠色，無(wú)病斑；

2級(jí)(抗病)—葉片葉色基本正常，有黃花斑點(diǎn)，但斑點(diǎn)未連成線；

3級(jí)(感病)—葉片病斑的斑點(diǎn)連成線，葉片黃化，但植株不矮化；

4級(jí)(高感)—葉片出現(xiàn)大片黃花病斑，葉片黃化，植株萎縮、矮化甚至死亡。

選取病程梯圖下面積作為主要病情評(píng)價(jià)指標(biāo)。

病程梯圖下面積(Area Under the Disease Progress Stairs，AUDPS)：將多期病害調(diào)查值聯(lián)合起來(lái)，更準(zhǔn)確的評(píng)估病害的發(fā)病程度，AUDPS值越大，說(shuō)明該品種(系)發(fā)病的嚴(yán)重度高、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。病程梯圖下面積計(jì)算公式：

其中，n為總調(diào)查次數(shù)，xi為第i次調(diào)查嚴(yán)重度，ti為第i次調(diào)查的時(shí)間。

1.4 多態(tài)性SSR標(biāo)記的篩選與RIL群體基因型分析

采用CTAB法[29]提取親本及重組自交系葉片的DNA。采用PCR技術(shù)和凝膠電泳技術(shù)，從1 176對(duì)大麥SSR引物中篩選親本間多態(tài)性SSR標(biāo)記，利用篩選獲得的SSR標(biāo)記對(duì)RIL群體進(jìn)行基因型分析。參照郝晨陽(yáng)等[30]的方法進(jìn)行PCR和銀染。供篩選的1 176對(duì)大麥SSR引物中，31對(duì)GBM系列引物序列由德國(guó)IPK研究所提供，其余1 145對(duì)引物序列均為查詢Graingenes 2.0數(shù)據(jù)庫(kù)(https://wheat.pw.usda.gov/GG3/)獲得，由華大基因公司合成。

1.5 群體遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

通過(guò)JoinMap 4.0軟件構(gòu)建RIL群體遺傳連鎖圖譜。

1.6 QTL定位

根據(jù)RIL群體3年9時(shí)期的大麥黃花葉病抗性表型，通過(guò)QTL IciMapping 4.0軟件完備區(qū)間-加性模型(ICIM-ADD)定位抗性QTL，將LOD值設(shè)定為2.5，計(jì)算每個(gè)QTL的貢獻(xiàn)率和加性效應(yīng)，參考Philn等[31]的方法命名QTL。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本及RIL群體大麥黃花葉病抗性表現(xiàn)

由表1可知，在2014—2016年的9個(gè)調(diào)查時(shí)期內(nèi)，揚(yáng)農(nóng)啤5號(hào)的大麥黃花葉病病級(jí)均為1級(jí)左右，表現(xiàn)為高抗，日引3號(hào)的病級(jí)均在3級(jí)左右，表現(xiàn)為感病。t測(cè)驗(yàn)顯示，親本間大麥黃花葉病抗性差異均達(dá)極顯著水平。9個(gè)時(shí)期群體病級(jí)均值均介于雙親之間，并未出現(xiàn)超親或低親遺傳。RIL群體內(nèi)變異系數(shù)均大于15%，說(shuō)明RIL群體內(nèi)大麥黃花葉病存在廣泛變異。

表1 親本及RIL群體病級(jí)的平均表現(xiàn)Table 1 The performance of population and parents to thedisease

**表示親本間在0.01水平上差異顯著。

** mean significant differences between Yangnonppi 5 and Riyin 3 at 0.01 level.

2.2 RIL群體的大麥黃花葉病抗性表現(xiàn)

2014—2016年RIL群體的AUDPS值均呈連續(xù)性分布，表明RIL群體的大麥黃花葉病抗性為數(shù)量性狀，符合QTL分析要求。由表2可知， 2014年RIL群體的AUDPS均值為28.53，遠(yuǎn)小于2015年和2016年，說(shuō)明2014年RIL群體大麥黃花葉病的發(fā)病程度整體上輕于2015年和2016年；另外，分析RIL群體AUDPS值的變幅可知，不同年份間RIL群體大麥黃花葉病抗性均存在一定的差異，但基本介于雙親之間，重發(fā)病年份有少量的RIL系發(fā)病嚴(yán)重程度超過(guò)感病親本。

表2 親本及RIL群體的AUDPS值表現(xiàn)Table 2 The AUDPS performance of population and parents to the disease

2.3 RIL群體遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建

從1 176對(duì)大麥SSR引物中篩選獲得108對(duì)在雙親間具有多態(tài)性的標(biāo)記，采用108對(duì)SSR標(biāo)記對(duì)RIL群體進(jìn)行基因型分析，并通過(guò)JoinMap 4.0軟件構(gòu)建RIL群體遺傳連鎖圖譜(圖1)，發(fā)現(xiàn)該遺傳連鎖圖譜全長(zhǎng)1 065.13 cM，標(biāo)記間的平均距離為9.86 cM。在大麥7條染色體上的分子標(biāo)記數(shù)均不相同，其中2H的標(biāo)記數(shù)最多，3H的標(biāo)記數(shù)最少，兩者分別有27個(gè)和8個(gè)(表3)；同時(shí)，連鎖圖中一些標(biāo)記間的距離仍較大，在今后的研究中還需進(jìn)一步加密標(biāo)記。

2.4 大麥黃花葉病抗性的QTL定位

根據(jù)RIL群體在2014—2016年9個(gè)時(shí)期的黃花葉病抗性結(jié)果，采用QTL IciMapping 4.0軟件完備區(qū)間-加性模型(ICIM-ADD)定位抗性QTL，結(jié)果共檢測(cè)到6個(gè)大麥黃花葉病抗性QTL(表4)。其中，1個(gè)QTL位于1H頂端，介于標(biāo)記區(qū)間ABC156B～UMB506，命名為qRYM-1H；3個(gè)QTL位于2H上，分別介于標(biāo)記區(qū)間EBmac0640～Bmag0744、GBM1309～EBmac0415和Bmag0745～EBmag0722，命名為qRYM-2Ha、qRYM-2Hb和qRYM-2Hc；1個(gè)QTL位于5H末端，介于標(biāo)記區(qū)間MGB357～CFE228，命名為qRYM-5H；1個(gè)QTL位于7H頂端，介于標(biāo)記區(qū)間Bmag0007～Bmag0206，命名為qRYM-7H。其中，qRYM-2Ha在2014-02-22、2016-03-08、2016-03-15三個(gè)時(shí)期均被檢測(cè)到；qRYM-2Hb在所有時(shí)期均被檢測(cè)到，說(shuō)明這2個(gè)QTL穩(wěn)定性好。qRYM-2Ha和qRYM-2Hb分別可解釋 5.00%～ 10.88%和5.70%～14.64%的表型變異，其他4個(gè)QTL均只檢測(cè)到1次，是否真實(shí)存在尚需進(jìn)一步檢測(cè)。所有QTL的加性效應(yīng)均為負(fù)值，表明該群體的大麥黃花葉病抗性基因均來(lái)自母本揚(yáng)農(nóng)啤5號(hào)。

表3 分子標(biāo)記在大麥染色體上的分布Table 3 The distribution of markers on different chromosomes of barley

圖1 大麥RIL群體遺傳圖譜Fig.1 Linkage map of RIL lines表4 大麥黃花葉病抗性的QTL在染色體上的位置及效應(yīng)分析Table 4 The positions of QTL and analyses of effects for resistance to barley yellow mosaic disease

年份Year日期DateQTL染色體Chromosome標(biāo)記區(qū)間Maker intervalLOD貢獻(xiàn)率Phenotypicvariance explained/%加性效應(yīng)Additive effect201402-22 qRYM-2Ha2HEBmac0640～Bmag07443.015.14-0.08 qRYM-2Hb2HGBM1309～EBmac04154.777.93-0.0903-01 qRYM-2Hb2HGBM1309～EBmac04153.779.28-0.15qRYM-5H5HMGB357～CFE2282.928.06-0.1403-08 qRYM-2Hb2HGBM1309～EBmac04155.1211.88-0.16201503-03 qRYM-2Hc2HBmag0745～EBmag07222.704.39-0.11 qRYM-2Hb2HGBM1309～EBmac04154.899.83-0.1603-10 qRYM-2Hb2HGBM1309～EBmac04157.0814.92-0.2503-17 qRYM-2Hb2HGBM1309～EBmac04153.155.70-0.16201603-01 qRYM-2Ha2HEBmac0640～Bmag07442.825.00-0.12 qRYM-2Hb2HGBM1309～EBmac04155.5614.64-0.2103-08qRYM-1H1HABC156B～UMB5062.789.14-0.13 qRYM-2Hb2HGBM1309～EBmac04153.359.31-0.13qRYM-7H7HBmag0007～Bmag02063.075.00-0.1003-15 qRYM-2Ha2HEBmac0640～Bmag07446.2710.88-0.14 qRYM-2Hb2HGBM1309～EBmac04152.606.18-0.10

3 討 論

3.1 揚(yáng)農(nóng)啤5號(hào)大麥黃花葉病抗性基因位點(diǎn)的數(shù)量與效應(yīng)

本研究中RIL群體的6個(gè)大麥黃花葉病抗性QTL均來(lái)自于抗性親本揚(yáng)農(nóng)啤5號(hào)，分別位于染色體1H、2H、5H和7H。其中，表現(xiàn)穩(wěn)定的位點(diǎn)qRYM-2Ha和qRYM-2Hb均位于大麥染色體2H，分別位于染色體2H的70 cM與160 cM。抗病基因Rym16Hb位于大麥2號(hào)染色體長(zhǎng)臂末端，與RFLP標(biāo)記MWG949緊密連鎖，本研究檢測(cè)到的qRYM-2Hb與Rym16Hb位置相近[2]，可能是一對(duì)等位基因，但尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。qRYM-2Ha位點(diǎn)附近尚沒(méi)有大麥黃花葉病抗性基因報(bào)道，可能是一個(gè)新的抗性位點(diǎn)，這為該大麥黃花葉病抗性新基因的發(fā)掘、精細(xì)定位及克隆奠定了 基礎(chǔ)。

3.2 大麥黃花葉病抗性表型鑒定與抗性基因位點(diǎn)的穩(wěn)定性

大麥黃花葉病抗性主要受遺傳因素控制，不同年份、不同地點(diǎn)的溫度、濕度及土壤中黃花葉病病毒的株系類型及數(shù)量也直接影響大麥黃花葉病的抗性表現(xiàn)，進(jìn)而影響大麥黃花葉病抗性基因位點(diǎn)的穩(wěn)定性。本研究中，在2014—2016年的9個(gè)時(shí)期共檢測(cè)到6個(gè)大麥黃花葉病抗性QTL，但僅qRYM-2Ha和qRYM-2Hb具有較好的穩(wěn)定性，其他4個(gè)大麥黃花葉病抗性QTL均在某年份或某時(shí)期能檢測(cè)到，因此這4個(gè)QTL是否穩(wěn)定存在，還需進(jìn)行多年多點(diǎn)鑒定試驗(yàn)。另外，本研究構(gòu)建的遺傳連鎖圖譜分子標(biāo)記數(shù)目偏少，對(duì)大麥黃花葉病抗性基因的定位存在一定的影響，后續(xù)研究還需進(jìn)一步增加分子標(biāo)記數(shù)目。

3.3 揚(yáng)農(nóng)啤5號(hào)作為親本利用的前景分析

揚(yáng)農(nóng)啤5號(hào)是揚(yáng)州大學(xué)大麥研究所以品種如東6109為母本、蘇農(nóng)22為父本雜交選育的優(yōu)質(zhì)多抗高產(chǎn)啤用大麥品種，麥芽品質(zhì)達(dá)到國(guó)標(biāo)優(yōu)級(jí)，產(chǎn)量潛力達(dá)7 500 kg·hm-2，因其高抗大麥黃花葉病、白粉病，抗倒性強(qiáng)、耐鹽性好[32]，在江蘇、湖北、安徽等省大面積推廣，同時(shí)揚(yáng)農(nóng)啤5號(hào)也被廣泛用作育種親本。揚(yáng)州大學(xué)大麥研究所共配制雜交組合110多個(gè)，育成綜合性狀優(yōu)良品系10多個(gè)，其中選自(蘇引麥3號(hào)/揚(yáng)農(nóng)啤5號(hào))組合的蘇B0901品系分別于2014年和2015年經(jīng)江蘇和安徽農(nóng)作物品種審定委員會(huì)鑒定為高抗大麥黃花葉病優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)啤酒大麥新品種揚(yáng)農(nóng)啤10號(hào)，2017年通過(guò)國(guó)家非主要農(nóng)作物品種登記，揚(yáng)農(nóng)啤10號(hào)正在江蘇、安徽等省示范推廣[33]。另有來(lái)自揚(yáng)農(nóng)啤5號(hào)親本組合的品系正在參加鑒定試驗(yàn)，準(zhǔn)備登記。