劉丹丹，孫宛玉，劉 暢，馬浩珂，王瑞嬌，隋宇凡

(沈陽(yáng)化工大學(xué) 環(huán)境與安全工程學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110142)

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域，三嗪類(lèi)除草劑阿特拉津以顯著的效果和低廉的價(jià)格，成為世界上應(yīng)用最廣的除草劑之一[1]。其常用于玉米、高粱、甘蔗等闊葉雜草和1年生禾本科雜草的防治[2-3]，但長(zhǎng)期、大面積施用會(huì)對(duì)生態(tài)系統(tǒng)造成破壞。研究表明，阿特拉津是潛在的內(nèi)分泌干擾物，會(huì)增加乳腺癌和纖維瘤發(fā)病率，造成兩棲動(dòng)物及哺乳動(dòng)物的出生缺陷、生長(zhǎng)影響、免疫系統(tǒng)損傷、中樞神經(jīng)和心血管功能受損等[4-5]。因此，對(duì)于包括中國(guó)在內(nèi)，仍在大面積使用阿特拉津的國(guó)家而言，解決其污染問(wèn)題刻不容緩。

目前降解阿特拉津有水解、光解及生物降解等方式。自Wackeet 實(shí)驗(yàn)室分離出能夠完全降解阿特拉津的菌株P(guān)seudomonassp.至今[6]，大量功能性的微生物逐漸被人們所認(rèn)識(shí)。綜合近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，農(nóng)藥的生物降解憑借高效、無(wú)二次污染、經(jīng)濟(jì)、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)勢(shì)被廣泛應(yīng)用[7]。例如Alcaligenes、Pseudaminobacter、Ralstonia、Nocardioides、Arthrobacter等細(xì)菌被報(bào)道有降解阿特拉津的能力，并攜帶atzABCDEF或trzDFN降解基因，這2種降解基因有助于阿特拉津的礦化[8]。

試驗(yàn)表明，菌株Enterobactersp.對(duì)阿特拉津的降解能力超過(guò)90%[9]。鑒于此，本研究在前期工作基礎(chǔ)上，以菌株Enterobactersp.為研究對(duì)象，利用液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)阿特拉津降解過(guò)程產(chǎn)生的關(guān)鍵代謝產(chǎn)物，并通過(guò)PCR擴(kuò)增技術(shù)及GO功能富集分析對(duì)降解基因進(jìn)行篩選和克隆,進(jìn)一步探究阿特拉津降解途徑。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

以前期試驗(yàn)分離獲得的阿特拉津降解菌株Enterobactersp.為研究對(duì)象，其存放于沈陽(yáng)化工大學(xué)環(huán)境科學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試劑

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：磷酸氫二鉀1.6 g、磷酸二氫鉀0.4 g、七水硫酸鎂0.4 g、氯化鈉0.1 g、葡萄糖3 g、阿特拉津0.1 g，用蒸餾水定容至1 000 mL，pH值調(diào)至中性，121 ℃高壓滅菌30 min[10]。以上所用試劑均為分析純。阿特拉津(純度約99.9%)、羥基阿特拉津(純度>99%)、氰尿酸(純度>99%)，均購(gòu)自上海西格瑪公司。尿素(純度>99%)購(gòu)自天津市大茂化學(xué)試劑廠(chǎng)。

1.3 阿特拉津降解率的測(cè)定

樣品預(yù)處理：將菌株Enterobactersp.在含有100 mg/L阿特拉津的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)120 h。用等體積CHCl3和適量的NaCl溶液萃取[10]，取下層有機(jī)相，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器于45 ℃濃縮，用甲醇定容到1 mL。

采用液相色譜法測(cè)定阿特拉津的殘留量。檢測(cè)條件為C18反相硅膠色譜柱(柱長(zhǎng)250 mm×內(nèi)徑4.6 mm)，甲醇與水(V/V=80/20)為流動(dòng)相，流速為1 mL/min，柱溫25 ℃，進(jìn)樣量5 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)213 nm[10]。阿特拉津降解率的計(jì)算參考YANG等[11]的公式:

式中，X為阿特拉津降解率，CX為阿特拉津的最終含量(mg/L)，CCK為阿特拉津的原始含量(mg/L)。

1.4 阿特拉津降解產(chǎn)物測(cè)定

采用液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測(cè)定阿特拉津降解產(chǎn)物。進(jìn)樣前處理方法參照1.3中描述，降解產(chǎn)物經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮后，加入500 μL甲醇溶解，渦旋混勻后14 000 r/min離心10 min，取上清100 μL進(jìn)樣[12-14]。流動(dòng)相梯度如表1所示。

表1 流動(dòng)相梯度Tab.1 Mobile phase gradient

1.4.1 羥基阿特拉津 液相色譜：色譜柱Thermo Accucore C18(柱長(zhǎng)100 mm×內(nèi)徑2.1 mm，粒徑2.6 μm)，流速0.2 mL/min，柱溫30 ℃。

質(zhì)譜：電噴霧-正離子模式(SRM)，參數(shù)：毛細(xì)管溫度300 ℃，氣化器溫度400 ℃，鞘氣壓力10 kPa，輔助氣壓力2 kPa，噴霧電壓3 000 V(+)/4 000 V(-)。

1.4.2 氰尿酸 液相色譜：色譜柱Thermo Accucore C18(柱長(zhǎng)100 mm×內(nèi)徑2.1 mm，粒徑2.6 μm)，流速0.2 mL/min，柱溫30 ℃。

質(zhì)譜：電噴霧電離-負(fù)離子模式(SIM-Q1MS)，參數(shù)：毛細(xì)管溫度 270 ℃，氣化器溫度 400 ℃，鞘氣壓力20 kPa，輔助氣壓力5 kPa，噴霧電壓 5 000 V(+)/4 000V(-)。

1.4.3 尿素 液相色譜：色譜柱Thermo Accucore C18(柱長(zhǎng)100 mm×內(nèi)徑2.1 mm，粒徑2.6 μm)，流速0.2 mL/min，柱溫30 ℃。

質(zhì)譜：電噴霧電離-正離子模式(SRM)，參數(shù)：毛細(xì)管溫度252 ℃，氣化器溫度300 ℃，鞘氣壓力10 kPa，輔助氣壓力2 kPa，噴霧電壓4 500 V(+)/4 000 V(-)。

1.5 阿特拉津降解基因的篩選與克隆

參考前期降解基因轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析和比較，篩選出6個(gè)與阿特拉津降解有關(guān)的基因，分別為L(zhǎng)465-RS09425、L465-RS10465、L465-RS12445、L465-RS09100、L465-RS12200和UreA[9]。各基因產(chǎn)物及位置等信息見(jiàn)表2。

表2 阿特拉津降解基因Tab.2 Atrazine degradation gene

采用PCR擴(kuò)增技術(shù)對(duì)阿特拉津降解基因進(jìn)行克隆。細(xì)菌總DNA提取采用CTAB法[15]。反應(yīng)體系為50 μL，其中包括引物(表3)5 μL、DNA模板1 μL、dNTPs 5 μL、TaqDNA聚合酶0.5 μL、緩沖液5 μL、雙蒸水33.5 μL。

PCR反應(yīng)條件為：94 ℃，預(yù)變性5 min，設(shè)35個(gè)循環(huán)(94 ℃變性40 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min)，在此基礎(chǔ)上72 ℃延伸10 min，4 ℃穩(wěn)定4 min。

用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，EB(溴化乙錠)染色10 min，凝膠圖像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)觀察目標(biāo)條帶。采用TIAN rapid Midi Purification試劑盒(天根生物科技有限公司)回收目標(biāo)條帶，送至金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6 阿特拉津降解基因GO功能富集分析

對(duì)篩選出的降解基因進(jìn)行GO功能富集分析，結(jié)合GO注釋結(jié)果推測(cè)降解基因的功能。

表3 降解基因的引物名稱(chēng)及序列 Tab.3 Primer names and sequences of degrading genes

2 結(jié)果與分析

2.1 阿特拉津降解率與降解產(chǎn)物的測(cè)定結(jié)果

經(jīng)液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測(cè)定菌株Enterobactersp.在48 h內(nèi)降解率高于90%，是理想的高效降解菌株[9]。降解阿特拉津120 h后的關(guān)鍵中間代謝產(chǎn)物為羥基阿特拉津、氰尿酸以及尿素。待測(cè)樣本運(yùn)行9 min，出峰時(shí)間為4.75 min，離子質(zhì)荷比為156.1 m/z(圖1、2)，成功檢測(cè)出羥基阿特拉津。待測(cè)樣本運(yùn)行5 min，出峰時(shí)間為1.07 min，離子質(zhì)荷比為128.0 m/z(圖3、4)，成功檢測(cè)出氰尿酸。待測(cè)樣本運(yùn)行9 min，出峰時(shí)間為0.26 min(圖5)，離子質(zhì)荷比為44.5 m/z，如(圖6)，成功檢測(cè)出尿素。

圖1 羥基阿特拉津總離子圖譜Fig.1 Total ion map of hydroxyatrazine

圖2 羥基阿特拉津質(zhì)譜圖Fig.2 Mass spectrogram of hydroxyatrazine

圖3 氰尿酸質(zhì)譜圖 Fig.3 Mass spectrogram of cyanuric acid

圖4 氰尿酸總離子圖譜Fig.4 Total ion map of cyanuric acid

圖5 尿素總離子圖譜Fig.5 Total ion map of urea

圖6 尿素質(zhì)譜圖 Fig.6 Mass spectrogram of urea

2.2 阿特拉津降解基因的測(cè)定結(jié)果

通過(guò)GO富集分析降解基因L465-RS09425、L465-RS10465、L465-RS12445、L465-RS09100、L465-RS12200和UreA，更好地了解降解基因相關(guān)的生物學(xué)功能。并結(jié)合PCR擴(kuò)增技術(shù)，先后擴(kuò)增出長(zhǎng)度為1 020 bp的α/β水解酶基因L465-RS09425、長(zhǎng)度為1 080 bp的單加氧酶基因L465-RS10465、長(zhǎng)度為1 380 bp的鳥(niǎo)嘌呤脫氨酶基因L465-RS12445、長(zhǎng)度為900 bp的MBL折疊金屬水解酶基因L465-RS09100、長(zhǎng)度為480 bp的嘧啶利用蛋白基因L465-RS12200和長(zhǎng)度為360 bp的脲酶基因UreA(圖7)。

圖7 阿特拉津降解基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜Fig.7 Electrophoresis map of amplified products of atrazine degrading genes by PCR

2.3 阿特拉津的降解途徑分析

結(jié)合各阿特拉津降解基因的作用(表4)，初步分析阿特拉津降解途徑可能為圖8所示。在降解產(chǎn)物中檢測(cè)到羥基阿特拉津、氰尿酸、尿素,可以推測(cè)具體降解過(guò)程可能為，在基因L465-RS09425作用下發(fā)生水解反應(yīng)，阿特拉津脫氯為羥基阿特拉津，該水解酶基因功能與前人發(fā)現(xiàn)的AtzA、TrzN基因功能相似[16-21]；羥基阿特拉津經(jīng)基因L465-RS10465作用，連續(xù)脫2次烷基，轉(zhuǎn)化為氰尿酸二酰胺，這一作用基因與前人發(fā)現(xiàn)的AtzB基因的功能相似[22]；在基因L465-RS12445的作用下發(fā)生脫氨基反應(yīng)生成氰尿酸；氰尿酸在基因L465-RS09100作用下開(kāi)環(huán)產(chǎn)生脲基二甲酸；隨后嘧啶利用蛋白基因L465-RS12200使脲基二甲酸發(fā)生脫羧反應(yīng)進(jìn)而生成下一

表4 阿特拉津降解基因GO富集分析Tab.4 GO enrichment analysis of atrazine degrading genes

階段的產(chǎn)物——尿素；最后，尿素在尿酶輔助蛋白基因UreA的作用下生成CO2、H2O和NH3。在目前已知的降解菌株中，只有少部分能將阿特拉津完全降

解為NH3、H2O和CO2[20-21]，大部微生物只能將其轉(zhuǎn)化為中間代謝產(chǎn)物，如羥基阿特拉津[23-24]、氰尿酸[25-27]、縮二脲、乙酰胺等。

圖8 阿特拉津降解途徑 Fig.8 Atrazine degradation pathway

3 結(jié)論與討論

隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)菌株Enterobactersp.降解阿特拉津的過(guò)程與王輝等[28]總結(jié)的阿特拉津微生物代謝過(guò)程不同。這是因?yàn)?，微生物的代謝方式是多樣的，相同微生物作用同一底物，會(huì)存在多條代謝路徑，正是這一特點(diǎn)奠定了微生物強(qiáng)大的環(huán)境適應(yīng)能力[29]。這與細(xì)菌環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)、具有多樣化的代謝方式相符合，更利于生物功能進(jìn)化。本研究通過(guò)液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)阿特拉津降解產(chǎn)物，并用PCR技術(shù)對(duì)基因克隆，同時(shí)進(jìn)行基因功能比對(duì)，推測(cè)出其降解路徑。當(dāng)阿特拉津降解時(shí)，菌株Enterobactersp.在L465-RS09425、L465-RS10465、L465-RS12445、L465-RS09100、L465-RS12200和UreA共6種基因控制的α/β水解酶、烷烴1-單加氧酶、鳥(niǎo)嘌呤脫氨酶、MBL金屬水解酶、嘧啶利用蛋白C、脲酶亞單位γ作用下，先后生成了羥基阿特拉津、氰尿酸二酰胺、氰尿酸、脲基二甲酸和尿素5種中間體。在試驗(yàn)中得知，菌株Enterobactersp.為革蘭氏陰性菌，可以將阿特拉津完全礦化[30]。初步推測(cè)菌株Enterobactersp.在降解基因的作用下，經(jīng)脫氯、脫烷基、脫氨基、環(huán)裂解、脫羧和脲基甲酸水解等過(guò)程，將阿特拉津逐步礦化。菌株Enterobactersp.可以將阿特拉津完全礦化為NH3、H2O和CO2。有關(guān)新基因的功能分析，還需要進(jìn)一步采用基因敲除和降解率測(cè)定等方法進(jìn)行功能驗(yàn)證。