林小芳

摘要：以愛玉的葉片為材料，對CTAB分離總DNA的方法進行了改進，即在提取液中加入β-巰基乙醇、不同的PVP.結(jié)果表明：選用愛玉的嫩葉為材料及提取液中加入2%PVP，可有效地去除雜質(zhì)，防止材料褐化，獲得的DNA樣品OD260nm/OD280nm比值為1.8左右，質(zhì)量好且產(chǎn)率較高，電泳檢測表明提取的DNA的完整性較好，能基本滿足后續(xù)的PCR分析及限制性內(nèi)切酶酶切等分子操作的要求.

關(guān)鍵詞：愛玉;DNA;嫩葉;PVP

愛玉（Ficus awkeotsang Makino）是?？崎艑俚亩嗄晟举|(zhì)藤本植物，分布于我國福建、浙江南部和臺灣等地區(qū)。由于愛玉野生資源匱乏以及人工栽培的特殊性，愛玉瘦果供不應(yīng)求，價格居高不下。臺灣自1985年開始人工栽培研究[1] ，20世紀90年代初愛玉作為名特優(yōu)果樹引種大陸，并已推廣栽培。

根據(jù)愛玉葉片的上述特性，本實驗打算在CTAB法提取DNA的基礎(chǔ)上進行改良，以獲得高純度的可用于PCR分析、分子雜交及限制性內(nèi)切酶酶切等操作的基因組DNA，以期為今后愛玉分子生物學(xué)研究建立了良好的實驗基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

供試材料為愛玉，采自寧德市蕉城區(qū)，多株混合取樣，取新鮮、無病斑的葉片組織，放冰盒中帶回實驗室，雙蒸水洗滌晾干、去除主脈，立即用液氮速凍研磨成干粉，裝入50ml離心管中，放-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2主要試劑及儀器

1.2.1試劑Tris、EDTA、CTAB、β-巰基乙醇、平衡酚、瓊脂糖均購自北京Solarbio公司。HCl、NaCl、NaAc、氯仿、異戊醇、異丙醇、乙醇等均購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2.2主要儀器 3-18K型高速冷凍離心機（德國SIGMA）、DYY-6C型電泳儀（北京六一）、DYCP-31E型電泳槽（北京六一）、1-14型臺式小型高速離心機（Sigma）、T6新世紀型紫外可見分光光度計（北京普析）、紫外ZF型透射分析儀（上海嘉鵬）、MILLI-QReference超純水器（美國MILLIPORE）。

1.3方法

1.3.1基因組DNA的提取 參照鄒喻平[2] 等人的方法并作改進。

1.3.2葉片取材部位對DNA提取效果的影響取愛玉嫩葉和老葉各5g，參照1.3.1的方法提取DNA。

1.3.3提取緩沖液中PVP加入量對DNA提取效果的影響取愛玉嫩葉為材料，在CTAB提取緩沖液中其它成分不變的條件下，改變PVP的加入量，設(shè)如下處理：對照：1%PVP;處理1：2%PVP;處理2：4%PVP;處理3：6%PVP。

1.3.4DNA的純度分析紫外吸收法[2] ：取DNA原液，稀釋50倍，采用紫外吸收法測定OD260nm值和OD280nm值，根據(jù)OD260nm比值檢測DNA的純度;按照1個OD260nm值相當于50ug/ml計算DNA的濃度和產(chǎn)率。

1.3.5DNA的質(zhì)量分析 瓊脂糖凝膠電泳法[3] ：取10ulDNA原液加10ul2%溴酚藍混勻，在1%的瓊脂糖凝膠上電泳，用1×TBE電泳緩沖液，4V·cm-1電壓電泳60min。電泳結(jié)束后用0.5ug·ml-1EB染色30min后，用紫外透射分析儀觀察拍照，檢測DNA的提取情況（完整性）。

2結(jié)果與分析

2.1取材部位對基因組DNA提取效果的影響

選取愛玉的嫩葉和老葉，利用改良CTAB法提取的愛玉嫩葉DNA沉淀為白色半透明狀，可見多酚類物質(zhì)去除較干凈，DNA沉淀易溶解，溶液清亮，無粘稠感;老葉DNA沉淀為淡黃色半透明，可見蛋白質(zhì)和多酚類物質(zhì)殘留，在此基礎(chǔ)上對老葉的DNA進一步純化，純化后DNA沉淀顏色為白色半透明狀，DNA沉淀易溶解。

2.2提取緩沖液中PVP加入量對DNA提取效果的影響

選取愛玉嫩葉為材料，在CTAB提取緩沖液中其它成分不變的條件下，改變PVP的加入量，提取DNA。結(jié)果如表2所示。

2.3基因組DNA凝膠電泳分析

用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取的愛玉基因組DNA的完整性，結(jié)果如圖1所示，各處理（圖1中1-8泳道）提取的DNA電泳條整齊，每個泳道上，除了一條核基因組主帶外，還有兩條衛(wèi)星帶，分別是葉綠體和線粒體的基因組DNA。其中第1-6泳道的點樣孔內(nèi)無雜質(zhì)，表明酚類物質(zhì)、多糖去除干凈;電泳條帶無拖尾，表明所得的DNA沒有降解，純度較高，質(zhì)量較好。而第7、8泳道的點樣孔內(nèi)略有雜質(zhì)，說明DNA提取物中含有酚類等雜質(zhì)，和紫外檢測的結(jié)果一致。

3討論

針對愛玉葉片富含多酚、多糖和白色乳狀物的特點，本研究在前人研究的基礎(chǔ)上對CTAB法進行了相應(yīng)的改進。首先，取材及材料處理十分關(guān)鍵，盡可能采集新鮮無損傷的葉片進行提取。其次，在提取緩沖液中加入體積分數(shù)為2%的β-巰基乙醇和水溶性2%PVP，可有效地去除雜質(zhì)，防止材料褐化。第三，提取緩沖液中CTAB是一種陽離子去污劑，可破壞細胞膜，并能與核酸形成復(fù)合物。該復(fù)合物在高鹽溶液中是可溶的，通過酚抽提離心去除蛋白及多糖物質(zhì)，加入異丙醇或乙醇后核酸沉淀出來，而CTAB仍保持溶解狀態(tài)。因此，提取緩沖液中CTAB的加入，既提高了細胞的裂解程度，也可使CTAB充分與DNA結(jié)合，從而達到高效純化和分離的目的。

本研究所建立的DNA提取方法能從愛玉嫩葉基因組中提取出較高質(zhì)量的DNA，基本滿足PCR分析、分子雜交及限制性內(nèi)切酶酶切等后續(xù)操作，為今后愛玉分子生物學(xué)研究奠定了良好的實驗平臺。但是跟其他物種40-120ug/g鮮重的DNA產(chǎn)率相比略低[3] ，有待于進一步改進實驗方案，提高DNA產(chǎn)率。

參考文獻：

[1] 鄭萬均.中國樹木志：第1卷[M].北京：中國林業(yè)出版社，1983：2921-2922.

[2] 鄒喻蘋，葛頌，王曉東.系統(tǒng)與進化植物學(xué)中的分子標記[M].科學(xué)出版社，2001：16-17，27-28.

[3] 周延清，楊清香，張改娜.生物遺傳標記與應(yīng)用[M].化學(xué)工業(yè)出版社，2008：99-100，115-116

（作者單位：平潭縣嵐華中學(xué)）