孫 瓊 嚴(yán) 妍 劉 彥

牙周膜干細(xì)胞(human periodontal ligamentstem cell，hPLSC)是一類取材于根周膜的間充質(zhì)來源的干細(xì)胞[1]，在不同條件的誘導(dǎo)下，它可以分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞以及膠原形成細(xì)胞，在牙槽骨的缺損修復(fù)當(dāng)中發(fā)揮了重要作用。干細(xì)胞的成骨分化受各種不同的信號通路調(diào)控，其中ERK/MAPK 信號通路是調(diào)控干細(xì)胞成骨分化的一個很重要的信號通路[2]。在我們課題組的前期研究中發(fā)現(xiàn)，維生素C 能夠通過PELP1-ERK 信號軸調(diào)控牙周膜干細(xì)胞的成骨向分化[3]。外源性轉(zhuǎn)染PELP1 過表達(dá)的質(zhì)粒同樣能夠促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞內(nèi)成骨相關(guān)基因的表達(dá)。那么，在PELP1 調(diào)控牙周膜干細(xì)胞成骨基因上調(diào)的同時，Ras-Raf-MEKERK 信號通路是否也發(fā)生了變化呢？所以本研究以牙周膜干細(xì)胞為模型，探討PELP1 調(diào)控牙周膜干細(xì)胞成骨基因變化的同時，對Ras-Raf-MEK-ERK信號通路的影響。

1.材料和方法

1.1 主要材料和試劑 DMEM 培養(yǎng)基、Opti-MEM 培養(yǎng)液、胎牛血清(Gibico，美國)；Dispase酶、I 型膠原酶、Trice-HCl、TEMED、β-甘油磷酸鈉、維生素C、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、地塞米松(Sigma，美國)；胰蛋白酶(Amresco，美國)；BAD 蛋白定量試劑盒(Thermo，美國)；RIPA 裂解液、脫脂奶粉、辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG、Ras、Raf、p-MEK、MEK、GAPDH、ERK、P-ERK 抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(CST，美國)；無水甲醇(北京化工廠，中國)；30%丙烯酰胺(碧云天，中國)；10%SDS、Lipofectmine 2000TM、PELP1 siRNA(Invitrogen 美國)；過硫酸銨(上海生工，中國)；顯影液、定影液(普利萊，中國)。

1.2 主要儀器 T225 細(xì)胞培養(yǎng)瓶、6 孔板、10cm 以及6cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿(Costar，美國)；二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(Thermo，美國)；超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備儀器廠，中國)；Mini Protein II 蛋白電泳儀、棉墊以及半干轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad，美國)。

1.3 牙周膜干細(xì)胞的分離、培養(yǎng) 參考Seo[1]等學(xué)者的實驗方法，與課題組前期發(fā)表的文章[3]中方法一致，選取新鮮拔除的健康第三磨牙(所選患者年齡在18～30 歲)根中1/3 處的牙周膜組織原代培養(yǎng)，采用單克隆法獲取原代牙周膜干細(xì)胞。接種至裝有10%胎牛血清(體積分?jǐn)?shù))的DMEM 培養(yǎng)基中，置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)(5%CO2,100%飽和濕度)。長滿約80%左右時，0.25%的胰酶消化，1∶3 傳代培養(yǎng)。本研究所用的細(xì)胞為第3 代干細(xì)胞。本研究的實驗分為兩部分：第一部分為PELP1 過表達(dá)實驗，實驗組為轉(zhuǎn)染了pIRES2-EGFP-PELP1 過表達(dá)載體的牙周膜干細(xì)胞，對照組為轉(zhuǎn)染了了pIRES2-EGFP 的牙周膜干細(xì)胞。第二部分為PELP1 的抑制實驗。實驗組為轉(zhuǎn)染了對照的si RNA 的牙周膜干細(xì)胞，對照組為轉(zhuǎn)染了PELP1 siRNA 的牙周膜干細(xì)胞。

1.4 PELP1 過表達(dá)載體的轉(zhuǎn)染 本研究使用的pIRES2-EGFP-PELP1 過表達(dá)載體為課題組所構(gòu)建。如表1 所示：按照實際情況，將不同濃度的PELP1 過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至牙周膜干細(xì)胞48h 后收集細(xì)胞。

表1 不同轉(zhuǎn)染培養(yǎng)器轉(zhuǎn)染液組分

1.5 PELP1 siRNA 轉(zhuǎn)染 如表1 所示，將適量PELP1 siRNA 溶于Opti-MEM 培養(yǎng)液中充分混勻；同時將LipofectAmineTM2000 分散于等體積Opti-MEM 培養(yǎng)液中混勻5min；兩液相混勻，室溫放置25min。棄細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS 洗滌三次后，換Opti-MEM 培養(yǎng)液。將轉(zhuǎn)染液緩緩轉(zhuǎn)入培養(yǎng)板中，細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育6h。棄轉(zhuǎn)染液，加入成骨誘導(dǎo)液繼續(xù)培養(yǎng)48h 后收集細(xì)胞。

1.6 細(xì)胞總RNA 的提取以及qRT-PCR 檢測 用Trizol 法分別提取細(xì)胞總RNA，檢測不同樣本的含量和純度后，依照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書將提取的RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，1∶10 倍稀釋待用。利用表2 中設(shè)計的引物進(jìn)行qRT-PCR 檢測。

表2 qRT-PCR引物

1.7 細(xì)胞總蛋白的提取以及western blot 檢測以蛋白裂解法提取細(xì)胞總蛋白后，用BAD 蛋白定量試劑對提取蛋白進(jìn)行定量。100℃變性10min 后，12%SDS 膠電泳后將分離的蛋白轉(zhuǎn)移至0.45μm PVDF 膜后，5%脫脂奶粉封閉1h 后，分別加入一抗PELP1(1∶2500)、Ras(1∶1000)、p-c-Raf(1∶1000)、c-Raf(1∶1000)、p-MEK(1∶100)、MEK(1∶1000)、p-ERK(1∶1000)、ERK(1∶1000)4℃過夜，TBST 洗滌后，二抗室溫孵育1h 后，暗室曝光檢測。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。所有的實驗步驟至少重復(fù)三次。

2.結(jié)果

2.1 pIRES2-EGFP-PELP1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至牙周膜干細(xì)胞后PELP1 以及成骨相關(guān)基因的表達(dá)qRT-PCR 結(jié)果顯示(表3)，PELP1 過表達(dá)質(zhì)粒pIRES2-EGFP-PELP1 轉(zhuǎn)染至牙周膜干細(xì)胞48h后牙周膜干細(xì)胞胞內(nèi)PELP1 基因mRNA 水平顯著升高，約為空載對照組基因表達(dá)水平的3200 多倍。骨形成相關(guān)指標(biāo)Runx2、ALP 和OCN 的表達(dá)水平也顯著升高。較空質(zhì)粒對照組分別較對照組約增加4.7 倍、2.3 倍和2.3 倍。其差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)。

表3 重組質(zhì)粒pIRES2-EGFP-PELP1 處理hPDLSCs 48h 后，PELP1 以及成骨相關(guān)指標(biāo)Runx2、ALP 和OCN基因水平的變化

2.2 PELP1 siRNA 轉(zhuǎn)染至牙周膜干細(xì)胞后PELP1 以及成骨相關(guān)基因的表達(dá) qRT-PCR 結(jié)果顯示(表4)，PELP1 siRNA 轉(zhuǎn)染至牙周膜干細(xì)胞48h 后牙周膜干細(xì)胞胞內(nèi)PELP1 基因mRNA 水平顯著下降，約降低至mock 對照組表達(dá)水平的33%。骨形成相關(guān)指標(biāo)Runx2、ALP 和OCN 的表達(dá)水平也顯著降低。分別約降低至mock 對照組的24%、44%和57%。其差異具有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.01)。

2.3 牙周膜干細(xì)胞內(nèi)PELP1 蛋白的變化對Ras-Raf-MEK-ERK 信號通路的影響 Western blot 結(jié)果顯示，PELP1 siRNA 處理牙周膜干細(xì)胞48h 后(圖1A)，牙周膜干細(xì)胞內(nèi)PELP1 水平的下降抑制了ERK 的磷酸化。當(dāng)PELP1 過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48h 后(圖1B)，PELP1 基因水平的上調(diào)激活了ERK 的磷酸化。并且，牙周膜干細(xì)胞胞內(nèi)PELP1基因的表達(dá)被抑制時，Ras 的表達(dá)水平也是被抑制的，同時Ras 的下游激酶c-Raf 和MEK 的活性同樣被抑制(圖1A)。反之，增加牙周膜干細(xì)胞內(nèi)PELP1 蛋白的表達(dá)不僅能夠促進(jìn)Ras 的表達(dá)，同時還能夠激活c-Raf 和MEK 的活性(圖1B)。

表4 PELP1 siRNA 處理hPDLSCs 48h 后，目標(biāo)基因PELP1 基因以及成骨相關(guān)指標(biāo)Runx2、ALP 和OCN基因水平的變化

圖1 PELP1 siRNA

3.討論

炎癥、外傷、腫瘤以及面部先天畸形等疾病能夠?qū)е卵啦酃堑奈丈踔寥睋p，嚴(yán)重影響患者的口頜系統(tǒng)乃至身心健康[4]。牽張成骨、異體或自體骨的移植、以干細(xì)胞為基礎(chǔ)的組織工程學(xué)方法[5,6]是臨床上常用的牙槽骨缺損修復(fù)的方法。隨著干細(xì)胞研究的深入，學(xué)者們希望通過探討生物因子調(diào)控干細(xì)胞的定向分化而獲得組織缺損的修復(fù)再生，其中牙周膜干細(xì)胞是一類來源于根周膜的間充質(zhì)來源的干細(xì)胞，它在牙周組織的再生修復(fù)過程中發(fā)揮了重要作用[7]。

在我們的前期研究中發(fā)現(xiàn)，維生素C 能夠通過PELP1-ERK 信號軸促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞的成骨分化[3]。而PELP1 蛋白[8]被認(rèn)為是一種雌激素受體的共調(diào)節(jié)因子，它能夠廣泛表達(dá)于雌激素相關(guān)的器官及腫瘤中。在王婧等學(xué)者的研究中發(fā)現(xiàn)PELP1 蛋白在鼠的牙周組織及鼠的牙周膜細(xì)胞中是有表達(dá)的，并且外源性雌激素的攝入能夠上調(diào)PELP1 的表達(dá)[9]。所以PELP1 蛋白對牙周膜干細(xì)胞成骨分化的調(diào)控作用引起了我們的興趣。為此我們通過構(gòu)建的PELP1 過表達(dá)載體上調(diào)牙周膜干細(xì)胞胞內(nèi)PELP1 的基因表達(dá)水平時發(fā)現(xiàn)成骨相關(guān)基因的表達(dá)也是顯著上調(diào)的(見表3)，當(dāng)抑制牙周膜干細(xì)胞胞內(nèi)PELP1 基因水平的表達(dá)時我們得到相反的結(jié)論(見表4)。這提示PELP1 蛋白可能本身就能夠調(diào)控牙周膜干細(xì)胞的成骨分化。于是，它調(diào)控牙周膜干細(xì)胞成骨分化的機制引起了我們的興趣。

目前的研究已知PELP1 蛋白一方面能夠直接與雌激素受體相互作用發(fā)揮相應(yīng)的基因信號功能[8]，另一方面它還能夠通過調(diào)控如Src-MAPK 等信號通路發(fā)揮非基因信號功能[10,11]。在胚胎干細(xì)胞分化過程中，ERK-MAPK 信號通路是調(diào)控細(xì)胞分化的一個關(guān)鍵因素[12]，在細(xì)胞成骨分化過程中，F(xiàn)GFs家族的成員能夠與細(xì)胞表面的膜受體相結(jié)合，激活下游MAPK 等信號通路發(fā)揮相應(yīng)的功能[13]。同樣，在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)牙周膜干細(xì)胞胞內(nèi)PELP1蛋白水平高表達(dá)時，ERK 被激活，反之則得到相反的結(jié)論(見圖1)。由于Ras-MAPK 是一種保守的信號通路，且Ras-Raf-MEK-ERK 信號通路廣泛參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的各種生物學(xué)行為[14，15]。那么，在PELP1 發(fā)揮功能的同時，ERK 的上游激酶Ras-Raf-MEK 是否也發(fā)生了變化呢，所以我們探討了ERK 上游激酶Ras、c-Raf 和MEK 的變化，發(fā)現(xiàn)PELP1 蛋白的表達(dá)能夠促進(jìn)Ras 的表達(dá)和c-Raf和MEK 的磷酸化，反之亦然(見圖1)。這一結(jié)果提示我們PELP1 可能是通過Ras-Raf-MEK-ERK信號通路調(diào)控牙周膜干細(xì)胞的成骨分化。然而本研究僅僅是一個初步探討，其具體的調(diào)控機制還有待進(jìn)一步探討。