董亞菲，孟 軍，王建文，曾亞琦，孔麒森，褚洪忠，姚新奎，葛世萌，張凱麗，任 湘，黃晶晶

(1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)馬產(chǎn)業(yè)研究院，烏魯木齊 830052；3.新疆馳霄博駿畜牧業(yè)有限公司，烏魯木齊 830052；4.新疆伊犁哈薩克自治州畜牧科學(xué)研究所，新疆伊寧 835000)

0 引 言

【研究意義】原花青素作為綠色飼料添加劑，在美國、澳大利亞和歐洲作為馬的補(bǔ)充劑出售，通過試驗(yàn)認(rèn)識(shí)補(bǔ)飼不同劑量組原花青素對伊犁馬抗氧化能力的作用效果，深入探討其作用機(jī)理，并選擇出適宜的補(bǔ)飼劑量，對于運(yùn)動(dòng)馬的健康具有重要的理論價(jià)值與實(shí)踐意義，也可以為運(yùn)動(dòng)馬飼料添加劑的研發(fā)做參考依據(jù)，為運(yùn)動(dòng)型伊犁馬的日常生產(chǎn)提供數(shù)據(jù)支持，為馬匹健康養(yǎng)殖提供技術(shù)理論依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】原花青素是由兒茶素和表兒茶素兩種單體以低聚或多聚形式結(jié)合而成的酚類化合物[1]。研究表明,原花青素具有與較高的食用安全性[2]，還具有提高機(jī)體免疫力[3,4]、抗炎[5]、抗腫瘤[6]減小氧化損傷[7,8]的功效,同時(shí)有研究表明補(bǔ)飼原花青素對馬匹健康、攝取和消化無不利影響[9]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前國內(nèi)對補(bǔ)飼原花青素對運(yùn)動(dòng)馬影響的研究很少，并沒有針對原花青素對運(yùn)動(dòng)馬抗氧化影響做出研究。試驗(yàn)通過補(bǔ)飼不同劑量原花青素的伊犁馬運(yùn)動(dòng)前后抗氧化指標(biāo)的變化規(guī)律，研究原花青素對運(yùn)動(dòng)型馬匹抗氧化的影響。【擬解決的關(guān)鍵問題】通過分析不同劑量組馬匹運(yùn)動(dòng)前后抗氧化指標(biāo)以及免疫指標(biāo)的變化規(guī)律，量化原花青素的補(bǔ)飼劑量，為運(yùn)動(dòng)型馬匹科學(xué)飼養(yǎng)管理提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)地點(diǎn)位于新疆伊犁哈薩克自治州昭蘇縣西域天馬文化園。選取年齡為 2歲、平均體重為(328.28±10.21)kg，比賽成績?yōu)?78.37±3.83)s的健康的伊犁馬公馬作為試驗(yàn)動(dòng)物。

1.1.2 器材

日立 7600 系列自動(dòng)生化分析儀、UNICO 7200可見分光光度計(jì)、HH-4恒溫水浴箱、Labsystems Finnpipette單道芬蘭移液器、華東電子DG5033A酶標(biāo)儀等。

1.2 方 法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將所選馬匹隨機(jī)分為 4 組，每組4 匹。每匹馬每天補(bǔ)飼 4 kg 精料(分兩次飼喂，每次 2 kg)，每次補(bǔ)精料的時(shí)間為 08: 30、22: 20。對照組精料中不添加原花青素，試驗(yàn) I 組、II 組和 III 組精料中分別添加20、40和60 mg/kg BW的原花青素。

1.2.2 樣品采集及處理

在試驗(yàn)的第28 d進(jìn)行1 000 m速度賽。并于賽前30 min、賽后即刻、賽后30 min、賽后90 min、賽后24 h，采集靜脈血兩管。將兩管血液樣本靜置后，使用離心機(jī)進(jìn)行3 500 r/min 離心 15 min 分離血清，分離后將血清置于 -20℃ 保存待測。

1.2.3 測定指標(biāo)

采用華東電子酶標(biāo)儀測定超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性、采用可見分光光度計(jì)丙二醛(MDA)濃度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用 Excel 進(jìn)行整理，運(yùn)用 SPSS 21.0 軟件對測定數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(One - way ANOVA)，結(jié)果以平均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 靜息狀態(tài)飼喂劑量對抗氧化指標(biāo)的影響

研究表明,SOD 活性添加20 mg /kg BW劑量組、40 mg /kg BW劑量組和60 mg /kg BW劑量組時(shí)顯著高于對照組(P<0.05)；GSH-PX 活性添加60 mg /kg BW和40 /kg BW劑量組顯著高于對照組(P<0.05)；MDA含量隨著補(bǔ)喂劑量的增加呈現(xiàn)降低的趨勢，但差異不顯著(P>0.05)。表1

表1 血清中抗氧化指標(biāo)隨補(bǔ)飼濃度的變化
Table 1 Changes of antioxidant index in serum with supplementary feeding concentration

0 mg /kg BW20 mg /kg BW40 mg /kg BW60 mg /kg BWSOD(U/mL)51.8±1.07b52.59±1.12a52.79±1.18a54.31±1.29aCAT(U/mL)1.06±0.081.11±0.081.19±0.081.05±0.08GSH-PX(U/mL)175.01±7.82b188.53±7.33ab198.71±7.22a193.11±7.82aMDA(nmol/mL)4.12.±0.323.98±0.293.66±0.293.35.±0.32

注：同行不同大寫字母表示極顯著差異，P<0.01；同行不同小寫字母表示顯著差異，P<0.05。下同

Note:Different capital letters in one row extremely significant differencesp<0.01,different lowercase letters show significant differencesp<0.05.The same as below

2.2 運(yùn)動(dòng)后即刻飼喂劑量對抗氧化指標(biāo)的影響

研究表明,SOD活性試驗(yàn)I組、試驗(yàn)II組和試驗(yàn)III組均顯著高于對照組(P<0.05)，試驗(yàn)I組、試驗(yàn)II組、試驗(yàn)III組之間無顯著差異(P>0.05)；CAT活性試驗(yàn)III組顯著高于對照組(P<0.05)，其他各組之間無顯著差(P>0.05)；GSH-Px活性試驗(yàn)I組、試驗(yàn)II組和試驗(yàn)III組顯著高于對照組(P<0.05)，試驗(yàn)I組、試驗(yàn)II組、試驗(yàn)III組之間無顯著差異(P>0.05)；MDA含量隨著補(bǔ)喂劑量的增加呈現(xiàn)降低的趨勢，試驗(yàn)III組時(shí)含量最低，但差異不顯著(P>0.05)。表2

表2 血清中抗氧化指標(biāo)隨補(bǔ)飼濃度變化
Table 2 Changes of antioxidant index in serum with supplementary feeding concentration

0 mg /kg BW20 mg /kg BW40 mg /kg BW60 mg /kg BWSOD(U/mL)58.4±2.1559.53±2.2660.29±2.3363.36±2.39CAT(U/mL)1.33±0.091.35±0.091.37±0.081.37±0.08GSH-PX(U/mL)188.9±6.82189.45±6.64199.53±6.46200.98±6.26MDA(nmol/mL)4.44±0.344.34±0.354.08±0.323.8±0.33

2.3 運(yùn)動(dòng)后30 min飼喂劑量對抗氧化指標(biāo)的影響

研究表明,SOD活性試驗(yàn)III組顯著高于對照組(P<0.05)，試驗(yàn)I組、試驗(yàn)II組和試驗(yàn)III組之間無顯著差異(P>0.05)；CAT、GSH-Px活性隨著補(bǔ)喂劑量的增加呈現(xiàn)升高的趨勢，試驗(yàn)III組活性最高，但各組間差異不顯著(P>0.05)；MDA含量隨著補(bǔ)喂劑量的增加呈現(xiàn)降低的趨勢，試驗(yàn)III組顯著低于對照組(P<0.05)，對照組、試驗(yàn)I組和試驗(yàn)II組之間無顯著差異(P>0.05)。表3

表3 血清中抗氧化指標(biāo)隨補(bǔ)飼濃度變化
Table 3 Changes of antioxidant index in serum with supplementary feeding concentration

0 mg /kg BW20 mg /kg BW40 mg /kg BW60 mg /kg BWSOD(U/mL)54.54±5.37b55.21±4.29ab55.86±4.95ab58.84.±5.46aCAT(U/mL)1.12±0.071.24±0.081.27±0.071.3±0.07GSH-PX(U/mL)180.22±9.34b183.03±8.65ab182.13±8.65ab218.52±8.65aMDA(nmol/mL)3.88±0.26a3.61±0.24ab3.66±0.24ab3.13±0.25b

2.4 運(yùn)動(dòng)后90 min飼喂劑量對抗氧化指標(biāo)的影響

研究表明,SOD 活性添加60 mg /kg BW劑量組時(shí)顯著高于對照組(P<0.05)；GSH-PX 活性添加60 mg /kg BW劑量組極顯著高于40 mg /kg BW劑量組、20 mg /kg BW劑量組和對照組(P<0.01)；CAT的活性隨著補(bǔ)喂劑量的增加呈現(xiàn)升高的趨勢，但差異不顯著(P>0.05)。表4

表4 血清中抗氧化指標(biāo)隨補(bǔ)飼濃度變化
Table 4 Changes of antioxidant index in serum with supplementary feeding concentration

0 mg /kg BW20 mg /kg BW40 mg /kg BW60 mg /kg BWSOD(U/mL)52.56±1.99b54.49±2.03ab55.05±2.17ab57.08±2.17aCAT(U/mL)1.15±0.071.19±0.071.24±0.081.31±0.08GSH-PX(U/mL)183.34±8.87B187.32±8.21B190.67±8.21B228.97±8.21AMDA(nmol/mL)3.84±0.294.04±0.293.5±0.313.48±0.31

2.5 運(yùn)動(dòng)馬運(yùn)動(dòng)后24 h飼喂劑量對抗氧化指標(biāo)的影響

研究表明,SOD活性試驗(yàn)III組顯著高于對照組(P<0.05)，試驗(yàn)I組、試驗(yàn)II組和對照組之間差異不顯著(P>0.05)；CAT活性隨著補(bǔ)喂劑量的增加呈現(xiàn)升高的趨勢，試驗(yàn)II組時(shí)活性最高，但差異不顯著(P>0.05)；GSH-Px活性試驗(yàn)III組顯著高于對照組(P<0.05)，試驗(yàn)I組、試驗(yàn)II組和試驗(yàn)III組各組之間差異不顯著(P>0.05)；MDA含量隨著補(bǔ)喂劑量的增加呈現(xiàn)降低的趨勢，試驗(yàn)III組含量最低，但各組間差異不顯著(P>0.05)。表5

表5 血清中抗氧化指標(biāo)隨補(bǔ)飼濃度變化
Table 5 Changes of antioxidant index in serum with supplementary feeding concentration

0 mg /kg BW20 mg /kg BW40 mg /kg BW60 mg /kg BWSOD(U/mL)51.60±4.27b52.86±4.60ab53.66±4.38ab55.84±4.41aCAT(U/mL)1.10±0.321.12±0.331.13±0.251.19±0.38GSH-PX(U/mL)180.22±9.34b183.03±8.65ab182.13±8.65ab218.52±8.65aMDA(nmol/mL)3.96±0.423.9±0.483.74±0.423.45±0.46

3 討 論

機(jī)體在正常生理狀態(tài)下，自由基產(chǎn)生的速度和其消除的速度會(huì)保持動(dòng)態(tài)平衡，促進(jìn)了機(jī)體的正常代謝，但是當(dāng)機(jī)體劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)，其平衡有可能會(huì)被打破[10]，如果自由基產(chǎn)生過量就會(huì)損害機(jī)體[11]。對比原花青素、茶多酚、VC、E和胡蘿卜素清除自由基的能力，發(fā)現(xiàn)原花青素的效果更好[12,13]。Natella[14]研究顯示葡萄籽原花青素可以通過減少氧化劑和增加抗氧化劑水平增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力。SOD、GSH-Px、CAT是機(jī)體清除自由基的主要酶類，MDA是因氧自由基引發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的重要產(chǎn)物，其含量是衡量自由基對機(jī)體氧化損傷程度的指標(biāo)之一。

SOD是機(jī)體清除超氧化物陰離子自由基的一種非常重要的酶，是一種催化超氧化物發(fā)生歧化反應(yīng)產(chǎn)生氧氣和過氧化氫的酶[15]。SOD可歸類為金屬酶，通過催化相同的化學(xué)反應(yīng)對相同的底物發(fā)揮作用，不僅氨基酸序列不同，而且成分也不盡相同[16]。SOD通過清除超氧陰離子，從而阻止 NO 與超氧陰離子結(jié)合，從而防止過氧亞硝酸鹽的形成，SOD 提高了 NO 的生物利用度，防止形成具有有害生物效應(yīng)的強(qiáng)氧化劑[16]。CAT特有的陽離子，與活性氧相互作用的結(jié)果。過氧化氫酶通常的生理作用是在其引起細(xì)胞損傷之前清除 H2O2。李向果等[17]研究表明，小鼠灌胃相應(yīng)劑量的原花青素可以顯著提高小鼠機(jī)體中 SOD、CAT、GSH-Px 活性，降低 MDA含量，且對臟器指數(shù)沒有影響，對小鼠沒有毒害作用。在王穎等[18]給小鼠連續(xù)飼喂含葡萄籽原花青素的飼料28 h的試驗(yàn)中，測定全血和肝組織中SOD和GSH-Px活力以及MDA含量[18]，發(fā)現(xiàn)能夠有效提高 SOD 和 GSH-Px 活性，降低MDA 含量。此次試驗(yàn)中馬匹賽前賽后SOD的活性隨著補(bǔ)飼劑量的增加出現(xiàn)升高趨勢，與前人研究基本一致。CAT的活性隨著補(bǔ)喂劑量的增加呈現(xiàn)升高的趨勢，但差異不顯著(P>0.05)，這與前人研究不同，可能是試驗(yàn)設(shè)計(jì)不一致或飼喂時(shí)間不同造成的，具體的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。GSH-PX是在線粒體、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜中發(fā)現(xiàn)的另一種內(nèi)源性抗氧化酶，可代謝過氧化氫和其他有機(jī)過氧化物，并對其作為電子供體的底物谷胱甘肽具有特異性谷胱甘肽過氧化物酶也被認(rèn)為是一種含4個(gè)相同亞基的硒酶或四聚體蛋白，每個(gè)亞基含有硒代半胱氨酸殘基，作為氧化還原催化劑[19]。GSH-Px還可促使有毒的過氧化物還原成沒有毒性的羥基化合物，進(jìn)而使過氧化物減少對細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的損害。劉暢等[20]對進(jìn)行力竭運(yùn)動(dòng)小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組小鼠游泳的時(shí)間明顯高于對照組，肝臟中的GSH-Px的活性實(shí)驗(yàn)組高于對照組。此次試驗(yàn)中馬匹賽前賽后GSH-Px的活性隨著補(bǔ)飼劑量的增加出現(xiàn)升高趨勢，與前人研究基本一致。

MDA是因氧自由基引發(fā)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的重要產(chǎn)物，MDA的含量是衡量自由基對機(jī)體氧化損傷程度的指標(biāo)之一。脂質(zhì)過氧化、脫氧核糖與羥自由基的反應(yīng)、碳水化合物的循環(huán)和前列腺素合成途徑是全身 MDA 濃度的主要來源[21]。孫君志等[22]的研究顯示，大鼠在大強(qiáng)度及中等強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)中，血清丙二醛含量在運(yùn)動(dòng)后均出現(xiàn)了增高。對豬補(bǔ)飼高粱原花青素，發(fā)現(xiàn)高粱原花青素能夠顯著增加其抗氧化能力并且能夠降低血清丙二醛含量(P<0.05)[12,13]。試驗(yàn)中，馬匹在靜息狀態(tài)運(yùn)動(dòng)后30 min：MDA含量添加60 mg /kg BW劑量組顯著低于對照組(P<0.05)，與前人研究一致。試驗(yàn)表明，補(bǔ)飼原花青素可通過提高SOD、GSH-Px活性，降低過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物MDA從而提高馬匹抗氧化能力。

4 結(jié) 論

試驗(yàn)通過對伊犁馬補(bǔ)飼不同劑量的原花青素，對伊犁馬1 000 m速度賽前后抗氧化指標(biāo)分析發(fā)現(xiàn)，隨著補(bǔ)飼量的增加，在運(yùn)動(dòng)后即刻血清中SOD、CAT和GSH-Px活性顯著提高(P<0.05)；運(yùn)動(dòng)后30 min SOD活性試驗(yàn)III組顯著高于對照組(P<0.05)，MDA含量試驗(yàn)III組顯著低于對照組(P<0.05)；運(yùn)動(dòng)后90 min SOD活性試驗(yàn)III組顯著高于對照組(P<0.05)；運(yùn)動(dòng)后24 h SOD活性試驗(yàn)III組顯著高于對照組(P<0.05)，GSH-Px活性試驗(yàn)III組顯著高于對照組(P<0.05)。說明補(bǔ)飼劑量可影響伊犁馬抗氧化性。伊犁馬日糧中建議添加60 mg/kg BW原花青素，對提高速度型伊犁馬的抗氧化能力效果良好。