程實(shí) 賈治偉

脊柱退行性疾病是脊柱外科常見(jiàn)疾病，其發(fā)病率隨著人口老齡化的進(jìn)程逐漸升高，給患者、家庭和社會(huì)造成了沉重的負(fù)擔(dān)。椎間盤(pán)退變被認(rèn)為是脊柱退行性疾病的主要病因[1-2]。椎間盤(pán)由上下軟骨終板、膠凍樣的髓核組織及外層纖維環(huán)構(gòu)成，其內(nèi)部細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的交換是主要通過(guò)軟骨終板上營(yíng)養(yǎng)通道的彌散作用進(jìn)行[3]。軟骨終板的鈣化可導(dǎo)致軟骨終板的彌散功能障礙，造成椎間盤(pán)無(wú)法進(jìn)行正常的物質(zhì)交換，椎間盤(pán)內(nèi)基質(zhì)代謝穩(wěn)態(tài)失衡，從而引起或加速椎間盤(pán)退變[4]。目前許多研究已證實(shí)軟骨終板退變和椎間盤(pán)退變密切相關(guān)[5-7]。因此，軟骨終板退變機(jī)制成為近年來(lái)椎間盤(pán)退變機(jī)制研究的新方向。如何修復(fù)鈣化的軟骨終板，使其再次軟骨化，以期恢復(fù)椎間盤(pán)正常的物質(zhì)交換，也成為椎間盤(pán)退變生物學(xué)治療的重要課題[8]。

學(xué)者們?cè)缫炎C實(shí)關(guān)節(jié)軟骨組織中存在內(nèi)源性干細(xì)胞[9]，而椎間盤(pán)軟骨終板是一層薄層軟骨，與關(guān)節(jié)軟骨組織類(lèi)似，其內(nèi)部也存在調(diào)控組織穩(wěn)態(tài)的干細(xì)胞，即軟骨終板干細(xì)胞 (cartilage endplate stem cells，CESCs)[10]。2011年，椎間盤(pán) CESCs 首先由 Liu 等[10]發(fā)現(xiàn)。作為軟骨終板內(nèi)的組織內(nèi)源性干細(xì)胞，CESCs 相對(duì)于其它外源性干細(xì)胞具有更好的椎間盤(pán)內(nèi)環(huán)境適應(yīng)能力及向軟骨細(xì)胞分化能力，因此，被認(rèn)為具有良好的應(yīng)用前景[11]。然而，CESCs在椎間盤(pán)退變過(guò)程中細(xì)胞特性發(fā)生改變，這可能是導(dǎo)致椎間盤(pán)退變進(jìn)展的重要機(jī)制之一，因此，研究 CESCs 在椎間盤(pán)退變過(guò)程中的命運(yùn)轉(zhuǎn)歸具有重要意義。

筆者以 Pubmed、維普、萬(wàn)方和中國(guó)知網(wǎng)數(shù)據(jù)庫(kù)為檢索對(duì)象，中文檢索主題詞為“干細(xì)胞”、“祖細(xì)胞”與“椎間盤(pán) / 軟骨終板”，英文檢索關(guān)鍵詞為“stem cell”、“progenitor cell”、“MSC”、“stromal cell”、“intervertebral disc”和“cartilage endplate”進(jìn)行檢索。檢索文獻(xiàn)語(yǔ)種為中文或英文，檢索截止時(shí)間為 2018 年 10 月21 日。文獻(xiàn)納入標(biāo)準(zhǔn)：(1) CESCs 基礎(chǔ)或臨床研究的相關(guān)文獻(xiàn)；(2) 研究類(lèi)型為論著、綜述或會(huì)議文獻(xiàn)；(3) 研究對(duì)象為細(xì)胞、動(dòng)物或人。排除標(biāo)準(zhǔn)：同一作者團(tuán)隊(duì)研究?jī)?nèi)容重復(fù)或重復(fù)發(fā)表的文章。共檢得文獻(xiàn) 1095 篇，依據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)，最終納入相關(guān)文獻(xiàn) 41 篇 (其中英文28 篇，中文 13 篇，圖1)。對(duì) CESCs 的自身生物學(xué)特性及其在退變椎間盤(pán)組織修復(fù)再生中的應(yīng)用作一綜述，期望為椎間盤(pán)退變的基礎(chǔ)和臨床研究提供新思路和新啟示。

圖1 文獻(xiàn)檢索流程，最終納入 CESCs 相關(guān)文獻(xiàn) 41 篇，其中英文 28 篇，中文 13 篇Fig.1 Retrieval process of articles.A total of 41 CESCs-related researches were eventually included (28 articles in English;13 articles in Chinese)

一、CESCs 的發(fā)現(xiàn)

近年來(lái)，干細(xì)胞研究呈現(xiàn)快速發(fā)展趨勢(shì)，除了經(jīng)典的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 (bone m arrow stromal cells，BMSCs)外，在脂肪組織、滑膜組織、牙周膜組織及臍帶組織中均發(fā)現(xiàn)組織內(nèi)源性干細(xì)胞的存在[12-13]。椎間盤(pán)組織缺乏血管及營(yíng)養(yǎng)供應(yīng)，其內(nèi)部細(xì)胞增殖緩慢，因此退變椎間盤(pán)自我修復(fù)能力未引起學(xué)界的足夠重視。2007 年，Melrose 等[14]在建立羊椎間盤(pán)退變的模型后，發(fā)現(xiàn)在纖維環(huán)的外緣及髓核組織內(nèi)出現(xiàn)輕度自發(fā)性修復(fù)現(xiàn)象，首次提示了椎間盤(pán)存在內(nèi)源性干細(xì)胞的可能。隨后，多項(xiàng)研究證實(shí)椎間盤(pán)內(nèi)存在內(nèi)源性干細(xì)胞，髓核干細(xì)胞 (nucleus pulposus derived stem cells，NPSCs) 和纖維環(huán)干細(xì)胞 (annulus fibrosusderived stem cells，AFSCs) 陸續(xù)被分離鑒定發(fā)現(xiàn)[15-16]。2011 年，Liu 等[10]首次證實(shí)人退變椎間盤(pán)軟骨終板內(nèi)有干細(xì)胞的存在，這些干細(xì)胞具有與 BMSCs 相似的細(xì)胞形態(tài)、增殖能力、成骨、成脂及成軟骨分化能力、免疫表型和 Nanog、Sox-2 等干細(xì)胞基因表達(dá)。除了具有相似的干細(xì)胞普遍特性外，CESCs 還具有組織來(lái)源特性，其成軟骨及成骨分化能力均強(qiáng)于 BMSCs[10]。2012 年，Huang 等[17]進(jìn)一步證明人軟骨終板內(nèi)含有符合干細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞，高表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記物 STRO-1，CD73，CD90，CD105；低表達(dá) CD34，CD45，CD14，CD19 及 H LA-DR。由此，開(kāi)啟了對(duì) CESCs 廣泛而深入的研究。

二、CESCs 的分離培養(yǎng)

干細(xì)胞的篩選和純化對(duì)干細(xì)胞的研究具有重要意義。既往研究表明干細(xì)胞在組織內(nèi)的含量極低，Harris 等[18]對(duì)椎間盤(pán)內(nèi)各個(gè)部位干細(xì)胞的含量進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)每 0.8 mm厚度終板軟骨內(nèi)僅有 18 500～61 875 個(gè)干細(xì)胞。因此，分離純化干細(xì)胞并進(jìn)行體外擴(kuò)增極其重要。文獻(xiàn)報(bào)道的間充質(zhì)干細(xì)胞分離方法主要有差速貼壁法、組織消化法、梯度離心法、免疫磁珠篩選法[19]。由于組織來(lái)源的差異性，造成選擇的分離方法不同。瓊脂糖三維懸浮培養(yǎng)基是一種篩選培養(yǎng)基，有文獻(xiàn)報(bào)道只有軟骨細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞才能在其中生存，并且利用這種方法能夠成功分離軟骨干細(xì)胞[9]。Liu 等[10]首先利用這種瓊脂糖三維懸浮培養(yǎng)基在低細(xì)胞密度條件下分離 CESCs，結(jié)果證實(shí)這種方法分離出的細(xì)胞克隆團(tuán)符合干細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)，目前多數(shù)文獻(xiàn)也都采取這一方式分離 CESCs[20]。文獻(xiàn)報(bào)道的其它針對(duì) CESCs 分離方法有單克隆法、差速貼壁法、Fibronectin 差別黏附篩選法[21-27]。上述方法均可成功分離 CESCs，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道所獲得的 CESCs 表面標(biāo)記＞90%，且能夠三系分化，符合干細(xì)胞鑒定標(biāo)準(zhǔn) (表1)。然而，目前尚缺乏對(duì)比實(shí)驗(yàn)研究來(lái)確定最適合于 CESCs 的篩選方案。

表1 文獻(xiàn)報(bào)道的 CESCs 分離方法Tab.1 Isolation methods of CESCs reported in previous researches

三、CESCs 的鑒定

目前關(guān)于 CESCs 的鑒定尚缺乏特異性的表面標(biāo)志物。2006 年，國(guó)際干細(xì)胞治療協(xié)會(huì) (International society for cellular therapy，ISCT) 提出干細(xì)胞應(yīng)至少符合以下要求[28]：(1) 在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基內(nèi)能貼壁生長(zhǎng)；(2) 必須高表達(dá) CD73、CD90 和 CD105 (＞95%)，且低表達(dá) CD45、CD34、CD14 或 CD11b、CD79a、CD19 和 H LA II (低于2%)；(3) 能夠向成脂、成骨、成軟骨三系分化。文獻(xiàn)中報(bào)道的關(guān)于 CESCs 的表面標(biāo)記物也主要以 CD 表型為主，包括以下類(lèi)型：陽(yáng)性表達(dá) CD90、CD73、CD105、STRO1、CD44、CD166，不表達(dá) CD19、CD34、CD14、CD45、HLA-DR (表2)。此外，Stro-1 也是 CESCs 特異表達(dá)的干細(xì)胞表面標(biāo)記之一[10,17]。文獻(xiàn)報(bào)道成纖維生長(zhǎng)因子受體-3 (fibroblast growth factor-3，F(xiàn)GF-3) 可以作為鑒定關(guān)節(jié)軟骨干細(xì)胞的特異性標(biāo)志[29]，雖然軟骨終板結(jié)構(gòu)與軟骨組織類(lèi)似，但是不同組織來(lái)源的干細(xì)胞其表面標(biāo)志物的表達(dá)仍有一定差異，CESCs 是否也特異表達(dá) FGF-3 還有待進(jìn)一步研究。

表2 文獻(xiàn)報(bào)道的 CESCs 表型鑒定Tab.2 Phenotypes of CESCs identified by previous studies

四、CESCs 的增殖和分化能力

干細(xì)胞的增殖及分化潛能對(duì)其組織工程應(yīng)用有重要意義。目前文獻(xiàn)報(bào)道的誘導(dǎo) CSECs 增殖的方法主要有細(xì)胞因子、特殊的培養(yǎng)條件、基因轉(zhuǎn)染。成楠等[33]研究發(fā)現(xiàn)低氧環(huán)境 (1% O2濃度) 能促進(jìn) CESCs 增殖，抑制 CESCs凋亡和衰老，證明 CESCs 能較好地適應(yīng)椎間盤(pán)內(nèi)環(huán)境。陳斌等[25]研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染 HoxB4 基因則可以提高 S 期細(xì)胞比例促進(jìn) CESCs 增殖，提示 HoxB4 基因轉(zhuǎn)染可作為逆轉(zhuǎn) CESCs 退變的一種治療手段。此外，李元靖等[34]發(fā)現(xiàn) MGF 具有促進(jìn) CESCs 增殖和遷移的作用，并且這種作用依賴(lài)于 Erk 的磷酸化表達(dá)，而胰島素樣生長(zhǎng)因子-1 受體 (IGF-1R) 則與 MGF 的促遷移效應(yīng)有關(guān)。有學(xué)者對(duì)常見(jiàn)的幾類(lèi)干細(xì)胞的增殖能力進(jìn)行比較，Liu 等[10]首先比較了人退變間盤(pán)來(lái)源的 CESCs 與 BMSCs 的增殖能力，發(fā)現(xiàn)兩者無(wú)明顯差別；Wang 等[31]比較了 BMSCs、CESCs、NPSCs、AFSCs 的增殖能力，發(fā)現(xiàn)四種細(xì)胞之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；而 Liang 等[23]比較了椎間盤(pán)內(nèi)存在的三種內(nèi)源性干細(xì)胞的特性：髓核間充質(zhì)干細(xì)胞、CESCs 及 AFSCs，發(fā)現(xiàn)CESCs 的增殖能力較其它兩種干細(xì)胞輕度降低，而 AFSCs的三系分化能力最強(qiáng)，并且指出這些差別可能與 CESCs 獲取時(shí)需要長(zhǎng)時(shí)間消化影響細(xì)胞活性有關(guān)，這提示需要對(duì)CESCs 的分離方法再做進(jìn)一步改進(jìn)。

在分化方面，目前誘導(dǎo) CESCs 分化的方法主要包括與椎間盤(pán)細(xì)胞共培養(yǎng)、組織支架材料誘導(dǎo)、模擬椎間盤(pán)內(nèi)環(huán)境培養(yǎng)條件等。常獻(xiàn)等[35]發(fā)現(xiàn)通過(guò)非接觸式共培養(yǎng)法，CESCs 不僅可以分化成為椎間盤(pán)細(xì)胞，還可以通過(guò)上調(diào)退變椎間盤(pán)細(xì)胞基質(zhì)基因的表達(dá)來(lái)促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的分泌。退變椎間盤(pán)內(nèi)乏氧且具有很高的機(jī)械應(yīng)力負(fù)荷，椎間盤(pán)干細(xì)胞的命運(yùn)轉(zhuǎn)歸同時(shí)受到這兩種因素的影響。袁超等[36-37]發(fā)現(xiàn)在機(jī)械應(yīng)力的影響下，CESCs 呈現(xiàn)成骨分化的趨勢(shì)，而不是成軟骨分化。這一發(fā)現(xiàn)部分解釋了退變軟骨終板向成骨分化的原因。劉蘭濤等[38]則比較了 Micromass 法和Pellet 法對(duì) CESCs 進(jìn)行成軟骨誘導(dǎo)的效果，發(fā)現(xiàn) Micromass法誘導(dǎo) CESCs 所形成的軟骨基質(zhì)更加豐富和均質(zhì)。這些研究都顯示 CESCs 具有良好的分化能力，在椎間盤(pán)組織工程中有很大的應(yīng)用潛力，進(jìn)一步探索 CESCs 成軟骨分化的調(diào)控機(jī)制是非常有必要的。

五、CESCs 與椎間盤(pán)退變

內(nèi)源性干細(xì)胞是維持組織或器官內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)平衡的關(guān)鍵，然而目前對(duì) CESCs 在椎間盤(pán)退變中的作用研究較少。退變的椎間盤(pán)內(nèi)是一種缺氧、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)匱乏、微酸性、高滲透壓、高機(jī)械應(yīng)力的惡劣內(nèi)環(huán)境。浦路橋等[39]發(fā)現(xiàn)在缺氧和營(yíng)養(yǎng)缺乏的類(lèi)退變椎間盤(pán)內(nèi)環(huán)境的條件下，CESCs凋亡增多，并且凋亡相關(guān)蛋白 BNIP3、Bax 和 Bak 表達(dá)上調(diào)。He 等[40]發(fā)現(xiàn)低營(yíng)養(yǎng)環(huán)境可以誘導(dǎo) CESCs 高表達(dá)BNIP3 蛋白，并且通過(guò) BNIP3 相關(guān)信號(hào)通路使 CESCs 凋亡。有學(xué)者就退變椎間盤(pán)內(nèi)一些細(xì)胞因子對(duì) CESCs 的調(diào)控作用進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。巨噬細(xì)胞遷移抑制因子 (macrophage migration-inhibitory factors，MIF) 是固有免疫的一個(gè)調(diào)控因子，在 CESCs 退變過(guò)程中高表達(dá)[30]。Yao 等[41]發(fā)現(xiàn)MIF 參與調(diào)控退變 CESCs 成骨 / 成軟骨分化的命運(yùn)轉(zhuǎn)歸，Xiong 等[30]發(fā)現(xiàn) MIF 可以通過(guò)與 CESC 表面 CD74 作用，抑制 CESCs 的遷移。這些結(jié)果提示 MIF 可能是治療軟骨終板退變的新靶點(diǎn)。N-Ac-PGP 是一種由膠原蛋白降解產(chǎn)生的趨化因子，作用于中性粒細(xì)胞表面的 CXCR1 / 2 受體趨化中性粒細(xì)胞，參與炎癥反應(yīng)的發(fā)生和進(jìn)展。Feng等[26]發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生 N-Ac-PGP 的蛋白酶及 N-Ac-PGP 的含量在退變椎間盤(pán)內(nèi)上升，且 N-Ac-PGP 可以通過(guò) CXCR1 / 2信號(hào)軸誘導(dǎo) CESCs 遷移，但是 N-Ac-PGP 會(huì)誘使 CESCs進(jìn)入炎癥反應(yīng)狀態(tài)，并不促進(jìn)其向髓核表型分化，這可能是阻礙 CESCs 修復(fù)椎間盤(pán)退變的重要機(jī)制。此外，有學(xué)者通過(guò)基因芯片技術(shù)檢測(cè)了 CESCs 向軟骨分化過(guò)程中的基因表達(dá)譜變化，并提出治療 CESCs 退變的潛在靶點(diǎn)，然而這些基因的改變是否直接參與到 CESCs 功能的改變還需要通過(guò)細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證[42-46]。近年研究發(fā)現(xiàn)椎間盤(pán)內(nèi)源性干細(xì)胞如髓核間充質(zhì)干細(xì)胞隨著年齡上升其數(shù)量減少并且活性降低，表明衰老在內(nèi)源性干細(xì)胞退變中的重要作用[47]，CESCs 是否有類(lèi)似現(xiàn)象仍有待進(jìn)一步研究。

六、CESCs 在椎間盤(pán)修復(fù)中的優(yōu)勢(shì)

CESCs 作為椎間盤(pán)內(nèi)源性干細(xì)胞，對(duì)椎間盤(pán)內(nèi)環(huán)境的適應(yīng)能力具有天然優(yōu)勢(shì)，且 CESCs 在術(shù)中容易獲取，因此，其在組織工程中的應(yīng)用具有較好的前景[48]。募集并激活內(nèi)源性干細(xì)胞修復(fù)退變椎間盤(pán)避免了外源性細(xì)胞移植所難以避免的椎間盤(pán)醫(yī)源性損傷。Wang 等[11]將髓核間充質(zhì)干細(xì)胞、纖維環(huán)間充質(zhì)干細(xì)胞、CESCs 和骨髓干細(xì)胞復(fù)合在藻朊酸鹽支架上，移植到兔椎間盤(pán)退變模型中，對(duì)比四種干細(xì)胞在修復(fù)椎間盤(pán)退變中的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn) CESCs具有最佳的再生能力，而在體外分化實(shí)驗(yàn)中，Wang 等[31]發(fā)現(xiàn) CESCs 在成軟骨及成骨能力方面優(yōu)于骨髓干細(xì)胞、NPSCs 和 AFSCs，表明 CESCs 作為種子細(xì)胞在椎間盤(pán)組織工程中顯示出更好的應(yīng)用潛力。王效等[32]用豬來(lái)源的脫細(xì)胞基質(zhì)誘導(dǎo)大鼠 CESCs 三系分化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者具有良好的生物相容性。劉蘭濤等[49]將 CESCs 復(fù)合羥基磷灰石并移植到裸鼠皮下，移植后 7 周發(fā)現(xiàn) CESCs 可以成骨分化，將 CESCs 移植入兔退變椎間盤(pán)內(nèi)后 16 周發(fā)現(xiàn)CESCs 分化為類(lèi)軟骨細(xì)胞并促進(jìn)椎間盤(pán)修復(fù)。這些研究表明 CESCs 能夠?qū)Χ喾N生物材料產(chǎn)生應(yīng)答，進(jìn)一步探索下游調(diào)控機(jī)制能為 CESCs 的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

七、CESCs 在椎間盤(pán)修復(fù)中的問(wèn)題和進(jìn)展

在應(yīng)用組織工程技術(shù)修復(fù)椎間盤(pán)的過(guò)程中，面臨的最大難題是所移植的干細(xì)胞難以適應(yīng)退變椎間盤(pán)低氧、高滲、酸性的惡劣微環(huán)境[48]。CESCs 相對(duì)于外源性干細(xì)胞雖然有諸多優(yōu)勢(shì)，但是其應(yīng)用仍面臨困難。目前需要解決的問(wèn)題主要有以下方面：(1) CESCs 的特異表型仍未確定，缺乏高效率特異性分選方法將 CESCs 從組織內(nèi)分選出來(lái)，影響了 CESCs 的進(jìn)一步擴(kuò)增應(yīng)用[10,17,31]；(2) 如何特異性的誘導(dǎo) CESCs 向透明軟骨分化而不向骨組織分化是椎間盤(pán)再生中的重要問(wèn)題[35-38]；(3) 在干細(xì)胞的應(yīng)用方式上也存在一些困難[8,11,49]。

傳統(tǒng)的干細(xì)胞應(yīng)用方式包括直接注射干細(xì)胞、結(jié)合支架或凝膠等材料作為細(xì)胞載體植入組織內(nèi)部[11,49]。椎間盤(pán)外層纖維環(huán)致密，注射的方式不可避免地會(huì)損傷外層纖維環(huán)結(jié)構(gòu)。為了盡量減少對(duì)纖維環(huán)的破壞，目前多采用細(xì)針頭進(jìn)行注射。然而，這種方式幾率仍不可避免地發(fā)生干細(xì)胞滲漏。這些滲漏的干細(xì)胞可能會(huì)發(fā)生異位骨化，嚴(yán)重時(shí)會(huì)壓迫神經(jīng)根或脊髓。此外，無(wú)論是結(jié)合凝膠材料還是支架，在退變椎間盤(pán)的惡劣環(huán)境下，注射的干細(xì)胞存活率較低[48-49]。近年來(lái)，內(nèi)源性自修復(fù)的理念是椎間盤(pán)領(lǐng)域較為關(guān)注的熱點(diǎn)。目的是通過(guò)注射趨化因子或分化因子，內(nèi)源性的募集周?chē)鷧^(qū)域干細(xì)胞巢內(nèi)的內(nèi)源性干細(xì)胞來(lái)達(dá)到組織自修復(fù)的效果。He 等[27]研究發(fā)現(xiàn) CESCs 可以通過(guò)旁分泌途徑促進(jìn)髓核細(xì)胞的增殖。因此，研究?jī)?nèi)源性生物因子促進(jìn) CESCs 的活性不僅可以促進(jìn)軟骨終板的修復(fù)，也可以通過(guò)其分泌的細(xì)胞因子同時(shí)修復(fù)髓核組織。

八、展望

CESCs 的發(fā)現(xiàn)對(duì)今后椎間盤(pán)退變的修復(fù)研究具有重大意義。CESCs 不僅具有良好的增殖分化能力，還比外源性干細(xì)胞在退變椎間盤(pán)內(nèi)環(huán)境中顯示出更好的適應(yīng)能力，因此，在椎間盤(pán)再生研究中具有良好的應(yīng)用前景。如何激活并促進(jìn)退變軟骨終板內(nèi)的 CESCs 增殖、遷移到損傷部位，完成組織自我修復(fù)是未來(lái)椎間盤(pán)退變修復(fù)再生研究的重要方向。相信隨著對(duì) CESCs 在椎間盤(pán)退變和修復(fù)研究的不斷深入，椎間盤(pán)的生物學(xué)治療將可能迎來(lái)新的突破。