蔣華，卜強(qiáng)，吳愛(ài)斌，曾明輝，秦鎖炳，夏東東

0 引言

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，中國(guó)膀胱癌的發(fā)病率雖然低于歐美國(guó)家，但是呈逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)[1]。目前膀胱癌的治療以手術(shù)切除為主，輔以化療和免疫治療等措施，但膀胱癌治療后易復(fù)發(fā)，有報(bào)道復(fù)發(fā)率高達(dá)80%，其中大約16%～25%復(fù)發(fā)的腫瘤其惡性程度增加，有10%發(fā)展為浸潤(rùn)性或轉(zhuǎn)移性癌，預(yù)后較差[2]。膀胱癌的發(fā)病率呈現(xiàn)明顯性別差異，男性發(fā)病率是女性的3倍以上[3]。研究發(fā)現(xiàn)，性激素可能與這種性別差異有關(guān)，雄激素介導(dǎo)的信號(hào)通路可能參與了膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展，然而具體的作用機(jī)制還不清楚[4]。

雄激素受體（androgen receptor,AR）作為雄激素發(fā)揮作用的重要靶點(diǎn)，一直受到人們的關(guān)注。在沒(méi)有激素作用下，AR存在于胞質(zhì)中；而在與雄激素結(jié)合后，AR構(gòu)象發(fā)生轉(zhuǎn)變，被激活后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，進(jìn)而促進(jìn)靶基因的轉(zhuǎn)錄翻譯[5-6]。有研究表明，在大多數(shù)膀胱癌患者中AR表達(dá)增高，而且相比于AR陰性患者，AR陽(yáng)性患者有更高的復(fù)發(fā)率、轉(zhuǎn)移率，這說(shuō)明AR可能作為膀胱癌的預(yù)后因素[7-8]。Izumi等[9]研究表明雄激素剝奪治療可以顯著降低膀胱癌復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)，但是對(duì)于AR信號(hào)調(diào)節(jié)膀胱癌發(fā)生、發(fā)展的作用機(jī)制現(xiàn)在還不清楚。

色素上皮衍生因子（pigment epithelium derived factor,PEDF）是一種重要的內(nèi)源性血管形成抑制因子，對(duì)腫瘤有抑制作用[10]。研究表明，PEDF可在正常組織中表達(dá)，抑制內(nèi)源性血管形成，而在多種腫瘤組織中PEDF表達(dá)下調(diào)，導(dǎo)致腫瘤組織中血管生成增加，促進(jìn)了腫瘤發(fā)生發(fā)展[11-12]。研究表明在前列腺癌中PEDF表達(dá)受到雄激素的抑制[13]，這說(shuō)明AR可能會(huì)調(diào)控PEDF表達(dá)。

本文通過(guò)研究膀胱癌中PEDF與AR的表達(dá)變化及其之間的調(diào)控關(guān)系，為闡明性激素和膀胱癌的關(guān)系提供依據(jù)，同時(shí)也為膀胱癌的預(yù)防和治療開(kāi)辟新的途徑。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2016年2月—2018年12月江蘇省丹陽(yáng)市人民醫(yī)院膀胱癌手術(shù)取得的石蠟包埋標(biāo)本30例，病理證實(shí)均為膀胱尿路上皮癌?；颊吣挲g51～78歲，平均年齡65歲。其中男19例，女11例。Ta～T1：12例，T2～T3：18例。病例納入標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)WHO腫瘤分類診斷明確，且病歷及隨訪資料完整者。排除標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)明確病理診斷及病歷及隨訪資料不完全者。所有入選者事前均告知并簽署知情同意書(shū)，研究方案獲得江蘇省丹陽(yáng)市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào):20160841）。

1.2 材料及主要試劑

人膀胱癌細(xì)胞TCCSUP購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，PEDF抗體、AR抗體和GAPDH抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，免疫組織化學(xué)試劑盒購(gòu)自南京建成公司，反轉(zhuǎn)錄酶購(gòu)自美國(guó)Promega公司，LipofectamineTM2000和定量PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)ThermoFisher公司，雄激素二氫睪酮（dihydrotestosterone,DHT）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，AR干擾慢病毒載體（Lv-AR shRNA）和對(duì)照載體（Lv-NC) 購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人膀胱癌細(xì)胞TCCSUP培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）和1%雙抗（青-鏈霉素）的MEM-EBSS培養(yǎng)液中，并置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。然后用不同濃度的DHT（0、1、10、100 nmol/L）處理細(xì)胞，參照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染：空白對(duì)照組：不做任何轉(zhuǎn)染（Control）、陰性對(duì)照組：轉(zhuǎn)染Lv-NC慢病毒載體（Lv-NC），轉(zhuǎn)染組：轉(zhuǎn)染Lv-AR shRNA慢病毒載體（AR shRNA）。

1.3.2 免疫組織化學(xué)和評(píng)分 免疫組織化學(xué)染色嚴(yán)格按照試劑盒操作說(shuō)明進(jìn)行，PEDF抗體稀釋比例為1:100，AR抗體稀釋比例為1:50。染色結(jié)果由2位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師進(jìn)行雙盲閱片。PEDF陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)棕黃色顆粒，AR陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞核呈現(xiàn)棕黃色顆粒；采用半定量結(jié)果判斷，分別對(duì)鏡下陽(yáng)性細(xì)胞的百分比和染色強(qiáng)度給予評(píng)分。陽(yáng)性著色細(xì)胞數(shù)：每張切片上觀察5個(gè)高倍視野（×200），計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜5%為0分，5%～25%為1分，＞25%～50%為2分，＞50%～75%為3分，＞75%～100%為4分。陽(yáng)性著色強(qiáng)度：無(wú)色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。兩者計(jì)分相乘即為最終評(píng)分。

1.3.3 Real-time PCR檢測(cè)PEDF和AR的mRNA表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染后48 h的細(xì)胞，利用TRIzol試劑從不同實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞系中提取總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將RNA（1 μg）反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)設(shè)計(jì)基因PEDF和AR的定量引物，引物序列見(jiàn)表1。以GAPDH基因作為內(nèi)參，利用SYBR Green實(shí)時(shí)定量PCR染料法對(duì)相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)行分析。按照2-ΔΔCT法計(jì)算和分析各基因的表達(dá)水平。反應(yīng)體積為25 μl，反應(yīng)條件：94℃ 2 min；94℃ 1 min，56℃ 1 min，72℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min延伸。每個(gè)樣品取樣3次，每次設(shè)置3個(gè)重復(fù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR primer sequence

1.3.4 Western blot法檢測(cè)PEDF和AR的表達(dá)水平 RIPA蛋白裂解液（含1×蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）冰上裂解細(xì)胞10 min，然后12 000 r/min、4℃離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至新的EP管中，用BCA法檢測(cè)蛋白濃度，加入等體積的上樣緩沖液，100℃煮沸10 min，取等量蛋白（40 μg）上樣，SDS-PAGE進(jìn)行蛋白電泳。待蛋白完全分離后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，將PVDF膜置于含5%脫脂奶粉的TBST（20 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl和0.1% Tween 20）中室溫封閉1 h，然后在封閉液稀釋的PEDF和AR一抗（1:1 000）、GAPDH一抗（1:5 000）中4℃孵育過(guò)夜，之后用TBST清洗10 min×3次，在封閉液稀釋的二抗（1:5 000）中室溫孵育1 h，TBST清洗15 min×3次后與ECL反應(yīng)1 min，用Bio-Rad公司的ChemiDocTMXRX+成像系統(tǒng)獲取圖像。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.5 慢病毒轉(zhuǎn)染 將（3～5）×104個(gè)/毫升細(xì)胞種在12孔板，加入1 ml培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h，病毒感染時(shí)50%匯合。然后棄去12孔板中的培養(yǎng)基，每孔加入1 ml凝聚胺溶液（5 μg/ml），每孔加入20 μl病毒液（目的病毒及GFP對(duì)照病毒各5孔）；孵育過(guò)夜；棄去含病毒的培養(yǎng)基，加入1 ml常規(guī)培養(yǎng)液，利用Olympus熒光顯微鏡檢測(cè)熒光表達(dá)來(lái)評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染效率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。兩樣本相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析，兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膀胱癌組織中PEDF和AR表達(dá)呈負(fù)相關(guān)

利用免疫組織化學(xué)檢測(cè)膀胱癌組織中PEDF和AR的表達(dá)，見(jiàn)圖1，統(tǒng)計(jì)30例膀胱癌組織PEDF和AR表達(dá)評(píng)分，Pearson相關(guān)性分析表明膀胱癌組織中PEDF表達(dá)與AR表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.6569;P=0.003），見(jiàn)圖2。

圖1 免疫組織化學(xué)檢測(cè)膀胱癌組織中PEDF和AR的表達(dá)(比例尺：50 μm)Figure 1 Expression of PEDF and AR in bladder cancer tissues detected by immunohistochemistry (scale:50 μm)

圖2 膀胱癌組織中PEDF和AR表達(dá)的相關(guān)性Figure 2 Correlation between PEDF and AR expression in bladder cancer tissues

2.2 DHT處理對(duì)人膀胱癌細(xì)胞中PEDF表達(dá)的影響

不同濃度的DHT處理人膀胱癌細(xì)胞TCCSUP，Real-time PCR結(jié)果顯示AR mRNA表達(dá)水平隨著DHT處理濃度的增加而增加，見(jiàn)圖3A，同時(shí)Western blot結(jié)果也顯示AR蛋白水平與基因表達(dá)水平變化趨勢(shì)一致，隨著DHT處理濃度的增加，AR蛋白水平也增加，見(jiàn)圖3B。上述結(jié)果表明DTH處理細(xì)胞后可上調(diào)AR的表達(dá)。同時(shí)，Real-time PCR結(jié)果顯示PEDF mRNA表達(dá)水平隨著DHT處理濃度的增加而減少，見(jiàn)圖3C，Western blot結(jié)果表明隨著DHT處理濃度增加，PEDF蛋白水平減少，見(jiàn)圖3D，這表明DTH處理細(xì)胞后下調(diào)了PEDF的表達(dá)。同時(shí)相關(guān)性分析表明經(jīng)過(guò)DTH處理后的膀胱癌TCCSUP細(xì)胞中PEDF和AR表達(dá)水平也呈負(fù)相關(guān)（r=-0.958,P=0.042）。

2.3 建立穩(wěn)定沉默AR的膀胱癌細(xì)胞株

Real-time PCR結(jié)果顯示：與Control組相比，轉(zhuǎn)染組（AR shRNA）中AR mRNA表達(dá)量下降了63.1%，見(jiàn)圖4A；Western blot結(jié)果顯示，與Control組相比，轉(zhuǎn)染組（AR shRNA）中AR蛋白水平下降了81.5%，見(jiàn)圖4B。以上結(jié)果表明，AR沉默的膀胱癌細(xì)胞株構(gòu)建成功，可用于下一步實(shí)驗(yàn)研究。

2.4 沉默人膀胱癌細(xì)胞中AR表達(dá)可以上調(diào)PEDF表達(dá)

結(jié)果發(fā)現(xiàn)：轉(zhuǎn)染組（AR shRNA）中PEDF mRNA表達(dá)量是Control組的2倍，見(jiàn)圖5A，Western blot結(jié)果表明轉(zhuǎn)染組（AR shRNA）中PEDF蛋白水平是Control組的2.4倍，見(jiàn)圖5B。以上結(jié)果表明膀胱癌細(xì)胞系中PEDF表達(dá)受到AR信號(hào)的抑制。

3 討論

膀胱癌發(fā)病率呈現(xiàn)明顯性別差異，男性發(fā)病率顯著高于女性[2]。雄激素參與了膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展，有研究報(bào)道雄激素可能是男性膀胱癌發(fā)病率高于女性的原因[4]，但是對(duì)于雄激素如何調(diào)控膀胱癌的發(fā)生發(fā)展還需要進(jìn)一步研究，清楚闡述調(diào)控機(jī)制，將為膀胱癌的預(yù)防和治療開(kāi)辟新的途徑。

圖3 不同濃度DHT處理后AR和PEDF的表達(dá)情況Figure 3 Expression of AR(A,B) and PEDF(C,D) after different concentration of DHT treatment detected by Real-time PCR and Western blot

圖4 轉(zhuǎn)染AR shRNA后膀胱癌細(xì)胞株中AR的表達(dá)情況Figure 4 AR expression in TCCSUP cells transfected with AR shRNA detected by Real-time PCR(A) and Western blot (B)

圖5 沉默AR后對(duì)PEDF表達(dá)的影響Figure 5 PEDF expression after AR shRNA treatment detected by Real-time PCR(A) and Western blot(B)

PEDF作為絲氨酸蛋白酶抑制因子超基因家族serpin成員，屬于分泌型糖蛋白，具有高度保守的序列，相對(duì)分子質(zhì)量為50 kDa，是一種重要的內(nèi)源性血管形成抑制因子[14]，在胰腺癌[13]、前列腺癌[15]等的研究中表明過(guò)表達(dá)PEDF可以抑制腫瘤新生血管生成，抑制腫瘤生長(zhǎng)。這些結(jié)果顯示其在抗腫瘤方面有十分重要的作用。Ek等[16]研究也發(fā)現(xiàn)PEDF可以減少骨肉瘤細(xì)胞UMR 106-01和SAOS-2的侵襲，抑制骨肉瘤的肺轉(zhuǎn)移，抑制腫瘤發(fā)展。盡管PEDF在多種腫瘤中的作用已被揭示，但是PEDF與膀胱癌的關(guān)系鮮有報(bào)道。Doll等[17]在前列腺癌中的研究表明雄激素可以抑制PEDF的表達(dá)，而雄激素剝奪則恢復(fù)了PEDF的水平，抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，因此PEDF表達(dá)可能受到雄激素的影響。為了分析PEDF表達(dá)與AR表達(dá)之間關(guān)系，我們利用免疫組織化學(xué)檢測(cè)膀胱癌組織中PEDF和AR的表達(dá)，統(tǒng)計(jì)30例膀胱癌組織PEDF和AR表達(dá)評(píng)分，結(jié)果表明膀胱癌組織中PEDF表達(dá)與AR表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。

有諸多研究表明，雄激素阻斷可以降低AR水平，減少化學(xué)藥物誘導(dǎo)的膀胱癌發(fā)生，并且抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[18-20]，同時(shí)Izumi等[9]的研究也表明雄激素剝奪治療可以顯著降低膀胱癌復(fù)發(fā)，提高膀胱癌患者的生存期。但是雄激素是否影響PEDF參與膀胱癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程，還不清楚。為了研究雄激素與PEDF之間關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)用不同濃度的DHT處理人膀胱癌細(xì)胞TCCSUP后，發(fā)現(xiàn)隨DHT處理濃度增加，AR表達(dá)增加，PEDF表達(dá)減少，相關(guān)性分析表明PEDF和AR的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，結(jié)果表明DHT處理人膀胱癌細(xì)胞后會(huì)顯著上調(diào)AR表達(dá)，下調(diào)PEDF表達(dá)。進(jìn)一步利用慢病毒介導(dǎo)干擾AR表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PEDF表達(dá)水平上調(diào)，這表明膀胱癌中PEDF表達(dá)可能受到AR信號(hào)的抑制。但是在膀胱癌中AR信號(hào)如何調(diào)控PEDF表達(dá)還需要進(jìn)一步研究。

總之，本文通過(guò)研究PEDF與AR的表達(dá)變化及其關(guān)系，為闡明性激素和膀胱癌的關(guān)系提供依據(jù)，改善患者的治療方案，同時(shí)也為膀胱腫瘤的預(yù)防和治療開(kāi)辟新途徑。