徐 杰，許修宏，門夢琪，行國瑞，谷 猛，楊 陽，楊榮藝，邊鑫雨

（東北農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

畜禽養(yǎng)殖業(yè)作為農(nóng)業(yè)重要組成部分，其糞便面源污染問題已成為關(guān)注焦點［1］。目前，我國畜禽糞便年排放量超40億t，是工業(yè)有機污染物的4.1倍［2］，畜禽糞便產(chǎn)生的化學需氧量（COD）遠超工業(yè)廢水和生活污水COD總和［3］，糞肥投入導致土壤Olsen-P增量為等量化肥的3倍［4-5］。可見，如管理、利用不善，畜禽糞便將成為威脅環(huán)境的主要污染源［6］。利用畜禽糞便堆肥是資源化利用廢棄有機物的理想途徑［7-8］，但仍存在許多問題，如堆肥過程中的氨氣揮發(fā)，造成空氣污染同時降低肥效，堆體升溫慢，導致纖維素等有機大分子降解不充分而延長堆肥腐熟時間等［9-11］。通常采用向堆肥中加入特定功能微生物的方法來干預控制氨揮發(fā)，提高堆肥氮素含量，促使堆體快速升溫，加快有機質(zhì)降解，從而加速堆肥腐熟進程、提高堆肥產(chǎn)品品質(zhì)［12-14］。本試驗采用多種篩選方法相結(jié)合，從土壤、秸稈、堆肥等不同來源樣品中分離得到4株同時具有使堆肥快速升溫和有效除臭潛力的纖維素降解菌株。將該4株菌株與本試驗保藏的1株氨氧化細菌BM62（新型耐熱芽孢桿菌）按照不同比例配制成復合菌劑，并進行堆肥功能驗證，為將其應用于大規(guī)模堆肥生產(chǎn)提供基礎(chǔ)理論依據(jù)和實踐指導。

1 材料與方法

1.1 篩菌樣品來源及功能菌株篩選

1.1.1 功能菌株的富集和初篩

首先稱取5 g樣品（土壤、秸稈、堆肥）加入到45 mL無菌水中，放入到恒溫振蕩器中振蕩30 min，取菌懸液10 mL，加入150 mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液中，在30℃、150 r/min的恒溫搖床培養(yǎng)箱中富集培養(yǎng)2～3 d。取富集后的菌懸液用稀釋平板法進行劃線分離純化，最后選擇48 h內(nèi)長勢良好、菌落較大的菌株進入復篩。

1.1.2 纖維素降解菌的復篩

將初篩純化的菌株接種于羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）平板培養(yǎng)基上，30℃恒溫箱中培養(yǎng)2～3 d，然后用質(zhì)量濃度為1 g/L的剛果紅溶液染色0.5 h，之后棄去染液，用濃度為1 mol/L的NaCl溶液脫色0.5 h，選取透明圈和菌落直徑比（D/d）值大的菌株進行升溫除臭菌的復篩。

1.1.3 升溫菌、除臭菌的復篩

將秸稈剪成3～5 cm的小段，然后按照1∶3的質(zhì)量比與雞糞混合均勻，調(diào)節(jié)含水量為60%，即輕輕握住時，指縫間有水滴析出，不成股流下為宜。將其放入到33 cm×17 cm的聚丙烯袋中，每袋接種分離菌株10 mL種子液，每個菌株做3個重復。使用未接種的空白袋作為對照，并在室溫下培養(yǎng)1至7 d，測量1～7 d的溫度變化情況。同時用感官法測定難聞氣味等級的大小，分為輕度（不臭或微臭）、中度（臭味較明顯）、重度（臭味強烈）3個等級。

1.2 菌株鑒定

1.2.1 菌落形態(tài)及菌體形態(tài)觀察

將待測4菌株（A531、B622、A422、C631）劃線接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)2 d，觀察菌落及菌體形態(tài)。

1.2.2 分子鑒定及同源性比較分析

將待測4菌株保藏斜面送至上海生工測定其16S rDNA序列。將測得菌株的16S rDNA序列利用Blast軟 件 中 的nucleotide blast與GenBank、EMBL及DDBJ等數(shù)據(jù)庫中的已知序列進行同源性比對，得出待測菌株的初步分類結(jié)果。

1.3 功能菌劑的制備

1.3.1 斜面培養(yǎng)活化

將篩選得到的4株功能菌株和實驗室保存的氨氧化菌BM62的原始菌種分別接種于相應的固體培養(yǎng)基上，將菌株A531、B622、A422和C631在30℃培養(yǎng)2 d，菌株BM62在50℃培養(yǎng)3 d使菌種活化。

1.3.2 一級種子培養(yǎng)

用滅菌后的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和氨氧化菌培養(yǎng)基洗滌活化斜面至無菌三角瓶中振蕩培養(yǎng)；菌株A531、B622、A422和C631在30℃、150 r/min培養(yǎng)24～48 h得到一級種子液；氨氧化菌BM62在50℃、120 r/min培養(yǎng)72～96 h得到一級種子液。

1.3.3 二級種子培養(yǎng)

按液體培養(yǎng)基的體積比為10%～15%的接種量，將一級種子分別接種于發(fā)酵罐中，菌株A531、B622、A422和C631在30～37℃、攪拌速度為150～200 r/min，通氣量為1∶（1～1.5）（V/V·min），培養(yǎng)2～3 d；氨氧化菌BM62在50℃、攪拌速度為120～150 r/min，通氣量為（0.5～1）∶1（V/V·min），培養(yǎng)4～5 d，制得二級種子。

1.3.4 菌種固體發(fā)酵培養(yǎng)

將各菌株的二級種子發(fā)酵液與滅菌麩皮以1∶3（mL/g）的體積質(zhì)量比混合發(fā)酵24～48 h后晾干，制成固體菌劑。

1.3.5 復合菌劑制備

將菌株A531、B622、A422、C631和BM62進行拮抗試驗，結(jié)果表明該5株菌株不存在拮抗作用，隨后將其固體菌劑按照不同質(zhì)量比例混合，分別為1∶1∶1∶1∶1∶1、2∶2∶1∶1∶1 和 1∶2∶1∶2∶1 制成復合菌劑進行堆肥功能性檢測。

1.4 培養(yǎng)基配方

（1）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，水1 000 mL。

（2）劃線分離培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂20 g，水1 000 mL。

（3）羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）培養(yǎng)基：CMCNa 15 g，NH4NO31 g，酵母膏 1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KH2PO41 g，H2O 1 000 mL，瓊脂 20 g。

（4）氨氧化菌（新型耐熱芽孢桿菌）培養(yǎng)基：（NH4）2SO45 g，KCl 4 g，MgSO42.5 g，CaCl21.85 g，NaCl 3 g，NaHCO342 g，蛋白胨60 g，牛肉膏40 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL。

1.5 菌劑功能堆肥驗證實施

堆肥原料為新鮮雞糞和水稻秸稈，將水稻秸稈鍘成3～5 cm小段，與鮮雞糞按照1∶3～4的質(zhì)量比混合均勻，調(diào)節(jié)水分含量至60%～65%，堆成發(fā)酵堆；邊建堆邊添加菌劑，所述菌劑的量為（8～9）×109CFU/kg堆肥原料，接種后均勻混合堆體材料；當溫度上升到45℃以上時翻堆，每3 d翻堆1次，溫度下降到35℃以下后每5 d翻1次，直至堆體溫度下降至環(huán)境溫度結(jié)束發(fā)酵。

2 結(jié)果與分析

2.1 功能菌株的篩選

通過升溫、除臭和纖維素降解功能等多重篩選試驗，從不同來源（土壤、堆肥、秸稈）樣品中共分離純化獲得28株具有纖維素降解能力，同時具有使堆肥快速升溫和有效除臭潛力的細菌，其中編號為A531、B622、A422和C631這4株菌株的各項功能均較為突出，具體篩選結(jié)果見表1。

2.2 功能菌株初步鑒定

將此4株細菌劃線于牛肉膏-蛋白胨平板培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)2 d后觀察菌落及菌體形態(tài)，并進行基本理化性質(zhì)檢測，結(jié)果見表2和表3。結(jié)果表明該4株菌株的菌落、菌體特征及各項理化性質(zhì)均存在一定差異，初步判斷這4株菌株為分類不同的菌種。

表1 功能菌株篩選結(jié)果

表2 功能菌株菌落及菌體特征

表3 功能菌株基本生理生化特性

對4株待測菌株16S rDNA序列的V3、V4區(qū)與GenBank、EMBL及DDBJ等數(shù)據(jù)庫中的已知序列進行同源性比對，結(jié)果見表4。其中菌株A531、C631的最相近菌株分別為蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）ATCC14579（T）和白色芽孢桿菌（Bacillus albus）N35-10-2（T），相似性分別為99.45%和98.89%。而菌株A422和B622的最相近菌株分別為莫哈韋芽孢桿菌（Bacillus mojavensis）RO-H-1（T）和皮特不動桿菌（Acinetobacter pittii）CIP 70.29（T），其16S rDNA序列相似性僅有94.11%和94.48%。根據(jù)現(xiàn)有界定新種屬的規(guī)定，16S rDNA序列相似性在90%～95%為新屬［15-16］，因此這兩株細菌很可能是與莫哈韋芽孢桿菌和皮特不動桿菌相近的新屬細菌，其具體分類鑒定還有待進一步試驗測定。

表4 功能菌株分子鑒定比對結(jié)果

2.3 復合菌劑堆肥功能驗證

將菌株A531、A422、B622、C631與本實驗室保藏的氨氧化細菌Aliibacillus thermotoleransBM62（新型耐熱芽孢桿菌）分別進行拮抗試驗，結(jié)果顯示該5株細菌并無明顯拮抗現(xiàn)象。隨后將該5株細菌按照不同比例配制成復合菌劑進行小型堆肥試驗，以驗證其堆肥升溫除臭及纖維素降解效果。

2.3.1 接種菌劑各菌株比例為1∶1∶1∶1∶1的堆肥

將菌株A531、A422、B622、C631和BM62分別制成固體菌劑，按照1∶1∶1∶1∶1的比例復合接種進行堆肥試驗。

堆肥結(jié)果顯示，接種菌劑的堆肥在堆制后第2 d就進入高溫分解階段（＞45℃）（圖1），并持續(xù)到第12 d，之后溫度逐漸下降，20 d時降至35℃以下。整個堆肥過程中，高溫期（2～12 d）維持11 d；自然堆肥的堆體溫度雖然高于室溫，但在整個試驗周期內(nèi)未能進入高溫期?？梢姡臃N菌劑可明顯提高堆肥化過程中，尤其是堆肥前期的微生物代謝活性，從而提高堆體溫度，為有機物大分子的降解提供溫度保證，加快堆肥腐熟進程。

由表5可知，堆肥結(jié)束時，與對照堆肥相比，添加菌劑的堆肥中纖維素降解率提高19.83%，總氮損失率降低10%，NO2-含量增加46.6%，NH3揮發(fā)率降低35.5%，表明此復合菌劑可有效促進堆肥中纖維素類物質(zhì)降解，減少NH3揮發(fā)，增加NO2-含量，從而減少氮素損失，有效降低難聞氣味。

圖1 接種菌劑各菌株比例為1∶1∶1∶1∶1的堆肥過程中溫度變化

表5 接種菌劑各菌株比例為1∶1∶1∶1∶1堆肥中各理化指標變化

2.3.2 接種菌劑各菌株比例為2∶2∶1∶1∶1的堆肥

將菌株A531、A422、B622、C631和BM62制成的固體菌劑按照2∶2∶1∶1∶1的比例混合接種堆肥，結(jié)果表明接種菌劑的堆肥同樣也是在堆制后第2 d就進入高溫分解階段（＞45℃）（圖2），高溫期持續(xù)了14 d，比接種復合菌劑比例1∶1∶1∶1∶1的堆肥延長了3 d。

圖2 接種菌劑各菌株比例為2∶2∶1∶1∶1的堆肥過程中溫度變化

由表6可知，堆肥結(jié)束時，與對照堆肥相比，添加菌劑的堆肥中纖維素降解率提高了21.73%，總氮損失率減少8.1%，NO2-含量增加39.7%，NH3揮發(fā)減少23.1%。與接種復合菌劑比例1∶1∶1∶1∶1的堆肥結(jié)果相比較，可以看出，此種配比的復合菌劑處理雖然延長了高溫期，提高了纖維素的降解率，但是也增加了總氮的損失率。

2.3.3 接種菌劑各菌株比例為1∶2∶1∶2∶1的堆肥

將菌株A531、A422、B622、C631和BM62按照1∶2∶1∶2∶1的比例復配菌劑接種堆肥，結(jié)果顯示接種菌劑的堆肥同樣也是在堆制后第2 d就進入高溫分解階段（＞45℃）（圖3），高溫期持續(xù)了14 d，與接種復合菌劑比例2∶2∶1∶1∶1的堆肥溫度表現(xiàn)相似。

表6 接種菌劑各菌株比例為2∶2∶1∶1∶1堆肥中各理化指標變化

圖3 接種菌劑各菌株比例為1∶2∶1∶2∶1的堆肥過程中溫度變化

由表7可知，堆肥結(jié)束時，與對照堆肥相比，添加菌劑的堆肥中纖維素降解率提高了18.86%，總氮損失率減少了11.2%，NO2-含量增加了49.1%，NH3揮發(fā)減少42.6%。與接種復合菌劑比例為1∶1∶1∶1∶1和比例為2∶2∶1∶1∶1的堆肥結(jié)果相比，此接種比例的復合菌劑使堆肥過程中的總氮損失最少，NH3揮發(fā)減少最多，纖維素降解率與前兩種復合菌劑處理結(jié)果相當。此試驗結(jié)果表明，接種菌劑各菌株比例為1∶2∶1∶2∶1的堆肥效果相對最好。

表7 接種菌劑各菌株比例為1∶2∶1∶2∶1堆肥中各理化指標變化

3 討論

經(jīng)多重篩選試驗得到4株同時具有快速升溫除臭并有效降解纖維素物質(zhì)的芽孢桿菌屬細菌菌株A531、B622、A422和C631，將其與本實驗室保存的氨氧化菌-新型耐熱芽孢桿菌Aliibacillus thermotoleransBM62按照3種不同比例配制成復合菌劑進行堆肥功能驗證試驗。本試驗研究結(jié)果充分表明此復合菌劑兼具快速發(fā)酵產(chǎn)熱、生物除臭保氮、快速有效分解纖維素大分子等多種功效，可使畜禽糞便堆肥快速升溫，明顯降低不愉快氣味，降低堆肥中氮素損失，降低難降解有機物含量，從而加快堆肥物料的腐熟速度，提升堆肥產(chǎn)品品質(zhì)?？捎糜谏a(chǎn)生物有機肥，降低農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本，同時解決畜禽糞便引起的環(huán)境污染，具有很好的應用價值和社會意義。

4 結(jié)論

4.1 經(jīng)多重篩選試驗得到4株同時具有快速升溫除臭并有效降解纖維素物質(zhì)的細菌A531、A422、B622和C631，其中菌株A531和C631經(jīng)初步鑒定分別屬于蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）和白色芽孢桿菌（Bacillus albus），菌株A422和B622的分類名稱待定。

4.2 小型堆肥功能驗證試驗表明此4株功能菌株可與本實驗室保存的氨氧化菌-新型耐熱芽孢桿菌Aliibacillus thermotoleransBM62配制成功能互補的復合菌劑，該菌劑可使堆肥快速升溫除臭，并使纖維素有效降解。