李世梅，王黎明※，李 銘，湯 慧，李 峰，劉文聘，潘志榮

(1.空軍第九八六醫(yī)院中醫(yī)科，西安 710054； 2.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科，西安 710004；3.陜西九州生物醫(yī)藥科技集團有限公司，西安 710065)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以炎癥性滑膜炎為特征的自身免疫性疾病，可引起完全的關(guān)節(jié)損傷及多種關(guān)節(jié)外癥狀和全身癥狀。如果沒有得到及時的診斷與治療，可能會導(dǎo)致患者出現(xiàn)殘疾和過早死亡[1]。有研究發(fā)現(xiàn)RA與HLA-B27基因的表達密切相關(guān)，但發(fā)病機制目前尚不明確[2]。隨著各種新型生物制劑的出現(xiàn)及治療原則和治療策略的優(yōu)化，RA的治療取得了重大進展，患者的預(yù)后得到明顯改善[3-4]。然而，各種治療均有其局限性，如引起皮疹、發(fā)熱、過敏反應(yīng)等藥物不良反應(yīng)，且在某些患者中療效有限。因此，亟需探索新型的治療方法及其作用機制[5]。人臍帶間充質(zhì)干細胞(umbilical cord mesenchymal stem cell，UC-MSC)因具有組織修復(fù)、抗炎和調(diào)節(jié)免疫多重作用，近年成為RA治療領(lǐng)域有前景的治療方法[6-8]。研究表明，UC-MSC可以安全、有效和持久地緩解RA的癥狀[9-10]。在治療RA方面具有非常高的安全性和有效性，且患者的耐受性良好[11]。另外，鹿瓜多肽(lugua polypeptides，LG)前期干預(yù)UC-MSC能夠顯著增加UC-MSC治療RA的有效性，但具體機制尚不清楚[12]。本研究通過體外細胞模型，旨在探索LG對UC-MSC增殖、遷移和抗炎因子分泌的影響。

1 材料與方法

1.1實驗材料 人UC-MSC由陜西九州生物醫(yī)藥科技集團有限公司饋贈。LG購自哈爾濱譽衡藥業(yè)(批號：161113)。磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)(批號：C0221A)和曲拉通X-100(批號：ST795)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司?？篃晒獯銣绶馄瑒?批號：0100-01)購自美國Southern Biotech公司。KeyFluor488 Click-iT EdU成像檢測試劑盒(批號：KGA331-50)購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。玻片(85680-3101-12)及蓋玻片(80340-0630)購自江蘇世泰實驗器材有限公司。DMEM/F12(批號：10565018)培養(yǎng)基和胎牛血清(批號：10099141)購自美國Invitrogen公司。0.25%胰酶(批號：15050065)、堿性成纖維細胞生長因子(批號：13256-029)和青霉素/鏈霉素雙抗(批號：15140-122)購自美國Gibco公司。細胞培養(yǎng)皿(430167)和6孔板(CLS3516-50EA)購自美國Corning公司。Transwell小室(353097)購自美國FALCON公司。微量移液器和全自動酶標儀(Multiskan MK3)購自美國ThermoFisher公司。超凈工作臺(SW-CJ-1FD)購自蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司。CO2恒溫培養(yǎng)箱(MCO-15AC)購自日本SANYO公司。低速離心機購(5702R)自美國Eppendorf公司。熒光顯微鏡(IX71)及倒置顯微鏡(IX51)均購自日本OLYMPUS公司。微型高速離心機(C2500-R-230V)購自美國Labnet公司。肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)(批號：H181)和前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)(批號：H099)酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒購自南京建成生物工程研究所，腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)蛋白6(tumor necrosis factor-α inducible protein 6，TSG6)(批號：LS-F12868-1)ELISA試劑盒購自美國LifeSpan公司。

1.2細胞培養(yǎng) 人UC-MSC培養(yǎng)于含10 ng/mL堿性成纖維細胞生長因子、10% 胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中。細胞培養(yǎng)箱的孵育條件設(shè)置為37.0 ℃、5% CO2和95%濕度。

1.2.1細胞復(fù)蘇 將UC-MSC從液氮取出后，于37 ℃水浴鍋中迅速解凍。轉(zhuǎn)移溶解后的細胞至含有5 mL無血清培養(yǎng)基的離心管中，室溫300×g離心5 min，棄上清液。使用完全培養(yǎng)基(含10% 胎牛血清)重新懸浮細胞，然后將重懸后的細胞接種至培養(yǎng)皿，輕柔吹打以混合混勻，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2細胞傳代 當(dāng)細胞密度約為80%時，對細胞進行傳代。PBS洗3次后，使用0.25%胰酶消化細胞，完全培養(yǎng)基終止消化后收集細胞于10 mL離心管中，室溫300×g離心5 min，棄上清液。加入完全培養(yǎng)基，輕柔吹打細胞，制成單細胞懸液，按1∶3 的比例傳代。

1.3實驗方法 待細胞呈對數(shù)生長且狀態(tài)良好時，以每孔2×105個細胞接種于6孔板中，共種4個孔，培養(yǎng)過夜。棄盡舊培養(yǎng)基，分別加入不含(對照組)或含4、8和12 μg/mL LG的完全培養(yǎng)基，設(shè)為對照組、4 μg/mL LG組、8 μg/mL LG組和12 μg/mL LG組。

1.3.1EdU細胞增殖實驗 細胞分組后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。在6孔板中取出爬片，PBS洗3次，每次3 min。4%多聚甲醛固定15 min后PBS洗3次，每次3 min。棄去固定液，使用含3%牛血清白蛋白的PBS洗3次后每孔加入1 mL含0.5%曲拉通X-100的PBS，室溫孵育20 min。棄盡每孔中的液體，使用含3%牛血清白蛋白的PBS洗3次后每孔加入0.05 mL Click-iT反應(yīng)混合物，室溫避光孵育30 min。去除反應(yīng)液，使用含3%牛血清白蛋白的PBS洗3次后PBS洗1次，棄盡洗滌液。每張爬片滴加100 μL 1×Hoechst 33342反應(yīng)液(5 μg/mL)，避光，室溫孵育15 min后，PBS洗3次，每次3 min。吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后置于熒光顯微鏡下。在低倍視野下找到細胞后，換至400×，在藍色激發(fā)光下拍攝EdU綠色熒光，在紫外激發(fā)光下拍照Hoechst綠色熒光，通過photoshop CS5軟件將這兩張圖片融合并計數(shù)。每張爬片隨機挑取5個視野拍攝圖片。

1.3.2Transwell細胞遷移實驗 細胞分組后，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。消化離心后，使用無血清培養(yǎng)基重懸細胞，調(diào)整細胞密度至3×105/mL，每個Transwell小室內(nèi)加入200 μL制備好的細胞懸液，每種處理種3個小室。Transwell小室的下室加入800 μL含10% 胎牛血清的完全培養(yǎng)基。置入細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，取出Transwell，用PBS小心地清洗小室1次，70%冰乙醇溶液固定細胞1 h。0.5%結(jié)晶紫染液室溫下染色20 min后棄盡染液，PBS洗3次，用干凈的棉簽將上室一側(cè)未遷移的細胞擦干凈，將小室倒置于載玻片上，于正置顯微鏡下觀察。在低倍視野下找到細胞后，換至100×并拍照。每個小室隨機挑取5個視野拍攝圖片。

1.3.3ELISA實驗 細胞分組后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。取細胞培養(yǎng)上清液，(500～1 000)×g離心20 min后開始檢測。設(shè)3組孔：空白孔、標準品孔和樣品孔。空白孔不加樣，只加入顯色劑A、顯色劑B和終止液，用作調(diào)零；每個標準品孔中加入50 μL稀釋好的標準品，其中0濃度孔加入50 μL標準品/樣品稀釋液，之后加入50 μL生物素抗原工作液；每個樣品孔中加入50 μL樣品，之后加入50 μL生物素抗原工作液。輕輕搖晃混勻各孔中的溶液，封上封板膜，置于37 ℃恒溫箱中孵育60 min。孵育完后，謹慎揭開封板膜，棄盡每孔中的液體，向每孔中加滿洗滌液，靜置30 s后棄去，重復(fù)此操作5次，然后棄盡每孔中的液體。向每個標準品孔和樣品孔加入50 μL親和素-辣根過氧化物酶，操作方法同上。先向每孔加入50 μL顯色劑A，然后加入50 μL顯色劑B，輕柔震蕩混合均勻，在37 ℃下避光反應(yīng) 10 min。之后向每孔中加入50 μL終止液以終止反應(yīng)。將ELISA孔板置入多功能酶標儀中，使用空白孔調(diào)零，然后在450 nm波長下測量各孔的吸光度值。使用標準品的濃度和相應(yīng)吸光度值繪制標準曲線，然后采用此標準曲線根據(jù)各指標(HGF、PGE2和TSG6)的吸光度值計算得出相應(yīng)的濃度。

2 結(jié) 果

2.1各組EdU細胞增殖實驗結(jié)果 在EdU細胞增殖實驗中，LG處理UC-MSC后，對照組、4 μg/mL LG組、8 μg/mL LG組和12 μg/mL LG組中EdU陽性細胞數(shù)分別為(12.35±3.67)個細胞/400×視野、(24.23±7.12)個細胞/400×視野、(39.61±7.98)個細胞/400×視野和(64.44±15.32)個細胞/400×視野，各組EdU陽性細胞數(shù)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=43.590,P<0.001)；與對照組比較，各處理組的EdU陽性細胞數(shù)增加(P<0.05)。見圖1。

2.2各組Transwell細胞遷移實驗結(jié)果 在Transwell 細胞遷移實驗中，LG處理UC-MSC后，對照組、4 μg/mL LG組、8 μg/mL LG組和12 μg/mL LG組中遷移細胞數(shù)分別為(20.00±2.00)個細胞/100×視野、(32.33±2.52)個細胞/100×視野、(50.33±2.52)個細胞/100×視野和(71±3.61)個細胞/100×視野，各組遷移細胞數(shù)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=199.500，P<0.001)；與對照組相比，各處理組的遷移細胞數(shù)增加(P<0.05)。見圖2。

1a：對照組；1b：4 μg/mL LG組；1c：8 μg/mL LG組；1d：12 μg/mL LG組

圖1 各組EdU細胞增殖實驗結(jié)果(熒光染色，400×)

2a：對照組；2b：4 μg/mL LG組；2c：8 μg/mL LG組；2d：12 μg/mL LG組

圖2各組Transwell細胞遷移實驗結(jié)果(0.5%結(jié)晶紫染液染色，100×)

2.3各組ELISA實驗結(jié)果 在ELISA實驗中，LG處理UC-MSC后，各組HGF、HGE2、TSG6比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，與對照組相比，4 μg/mL LG組、8 μg/mL LG組和12 μg/mL LG組HGF、PGE2和TSG6的分泌量顯著增加(P<0.05)。見表1。

表1 各組ELISA實驗結(jié)果

LG：鹿瓜多肽；UC-MSC：臍帶間充質(zhì)干細胞；HGF：肝細胞生長因子；PGE2：前列腺素E2；TSG6：腫瘤壞死因子-α誘導(dǎo)蛋白6；a與對照組比較，P<0.05

3 討 論

近年來，雖然RA的臨床治療取得了突破性進展，但仍有2個重大問題有待解決：①約30%的患者對所有治療無應(yīng)答；②即使RA的臨床炎癥得到緩解，但仍會出現(xiàn)影像學(xué)上的關(guān)節(jié)損傷[13-16]。這提示，RA的關(guān)節(jié)損傷不僅與炎癥有關(guān)，且單純的抗感染治療可能不足以阻止RA的進展。在RA治療領(lǐng)域，特別是對當(dāng)前治療反應(yīng)不佳的RA患者，間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cell，MSC)顯示出廣闊的治療前景[17]。其主要從兩個方面對RA發(fā)揮治療作用：①細胞分化，MSC可以分化成受損的細胞(骨細胞和軟骨細胞)，從而直接修復(fù)受損細胞；②免疫調(diào)節(jié)，MSC可以通過調(diào)節(jié)性T細胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答、抑制各種固有免疫細胞的產(chǎn)生及其功能等方式起到抗炎、調(diào)節(jié)免疫和抗組織損傷等作用[18-20]。

除細胞分化外，MSC的增殖和遷移能力也與其對受損組織的修復(fù)密切相關(guān)。細胞的增殖決定了最終可分化為靶細胞的MSC數(shù)量，而細胞的遷移決定了最終能夠到達受損部位的MSC數(shù)量[21]。因此，若能促進MSC的增殖和遷移，則可潛在地增強MSC的治療效果。本研究通過EdU細胞增殖實驗和Transwell 遷移實驗發(fā)現(xiàn)，LG可顯著促進UC-MSC的增殖和遷移，且呈濃度梯度依賴效果。然而，目前LG促進UC-MSC增殖和遷移的具體分子機制尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn)，多種信號通路可能參與對UC-MSC增殖和遷移的調(diào)節(jié)，包括c-Jun 氨基端激酶-p38通路[22]、黏著斑激酶/磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B通路[23]和胞外信號調(diào)節(jié)激酶通路[24]等，而LG對UC-MSC增殖和遷移的促進作用是否涉及這些信號通路或其他信號通路，有待進一步研究。

為研究LG對UC-MSC免疫調(diào)節(jié)作用的影響，本研究使用ELISA實驗對經(jīng)典抗炎因子HGF、PGE2和TSG6的分泌進行了研究。結(jié)果顯示，LG可濃度依賴性地促進這3種抗炎因子的分泌，提示LG可通過增強UC-MSC的免疫調(diào)節(jié)功能，從而增強UC-MSC治療RA的有效性。然而，這僅為體外研究的結(jié)果，有關(guān)LG對UC-MSC免疫調(diào)節(jié)作用的影響還需進一步的體內(nèi)研究證實。另外，相關(guān)作用的潛在分子機制尚不清楚，需要更多的研究去闡明。

綜上所述，LG可促進UC-MSC的增殖、遷移及抗炎因子HGF、PGE2和TSG6的分泌，這可能為其增強UC-MSC治療RA有效性的潛在機制，從而為UC-MSC治療RA提供更多的理論基礎(chǔ)。