程夢楠,浦逸晟,李樂詩,范純新,4,嚴(yán)繼舟,2,3,4
(1.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心,上海 201306;2.上海海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點實驗室,上海 201306;3.上海海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部魚類營養(yǎng)與環(huán)境生態(tài)研究中心,上海 201306;4.上海海洋大學(xué) 海洋生態(tài)系統(tǒng)和神經(jīng)科學(xué)研究所,上海 201396)
PAX3(paired box3)基因編碼是一個具有高度保守的基序的轉(zhuǎn)錄因子[1],被認(rèn)為是哺乳類肌先祖細胞的標(biāo)志基因,能調(diào)節(jié)間質(zhì)-上皮和間質(zhì)-肌肉表型的互轉(zhuǎn)[2-3].在早期胚胎發(fā)育過程中PAX3可調(diào)控神經(jīng)嵴的分化、神經(jīng)嵴細胞的遷移以及許多組織器官的發(fā)育.與PAX3基因多功能相對應(yīng)的瓦登伯革綜合征(Waardenburg syndrome,WS),又叫瓦登伯革氏癥候群(簡稱瓦氏癥),是一種遺傳性聽覺-色素綜合征[4],臨床特征為聽力障礙、白額發(fā)、虹膜異色癥、鼻根寬闊、眉毛中部多毛以及內(nèi)眥異位[5].
WS病是多基因多表型的遺傳性發(fā)育疾病,發(fā)病機制仍然不清楚.目前認(rèn)為主要是由于神經(jīng)嵴細胞發(fā)育缺陷或功能障礙所致.已鑒定了6個相關(guān)基因:PAX3、MITF(microphthalmia-associated transcription factor)、SOX10(SRY-related HMG-box 10 protein)、SNAI2(snail family transcriptional repressor 2)、ENDRB(endothelin receptor type B)、EDN3(endothelin-3)[6],其中WS1和WS3是由PAX3基因突變引起.WS2的致病基因為MITF和SNAI2.WS4的致病基因為SOX10、ENDR3和EDN3[7].
PAX3與較多的轉(zhuǎn)錄因子如SOX10、ETS1(protein C-ets-1)、GLI2(zinc finger protein GLI2)以及ZIC2(zinc finger protein ZIC 2)靶蛋白,Hippo通路TAZ(tafazzin)和YAP65(yes associated protein 1),染色質(zhì)蛋白,以及蛋白p53(cellular tumor antigen p53)和Mdm2(e3 ubiquitin-protein ligase Mdm2)等相互作用.另外,PAX3含有DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域,能與DNA染色質(zhì)結(jié)合[8-9].在哺乳類動物實驗中,通過Wnt(wingless-integrated)、TGFβ(transforming growth factor beta)、TLR2(toll like receptor 2)和MAPK(mitogen-activated protein kinase)等信號通路[10-12]可以調(diào)節(jié)間質(zhì)-上皮細胞和間質(zhì)-肌肉細胞表型的互轉(zhuǎn).盡管國外有較多文獻報道人類瓦氏癥與PAX3基因突變關(guān)系密切,但國內(nèi)報道不多.鑒于PAX3基因含4個保守結(jié)構(gòu)域,推測PAX3功能的復(fù)雜多變可能與其含有多結(jié)構(gòu)域有關(guān).斑馬魚基因組中PAX3直系同源基因有Pax3a和Pax3b兩個亞型拷貝[3].Pax3a結(jié)構(gòu)域所在位置(圖1).本研究選擇克隆斑馬魚Pax3a對應(yīng)的4個結(jié)構(gòu)域,研究每個結(jié)構(gòu)域表達引起的細胞表型特征及與瓦氏癥表型之間的關(guān)系.Pax3a的結(jié)構(gòu)域分為paired box domain 3(PD3):CDS 34-158;homeo box domain(HD):CDS 222-275;g-protein pathway suppressor domain(GPD):CDS 273- 427;paired box domain 7(PD7):CDS 349-393.
圖1 Pax3a結(jié)構(gòu)域示意圖
1.1.1 實驗試劑和儀器
實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative PCR,qPCR)試劑盒、PCR擴增試劑、DH5α感受態(tài)細胞、pEASY-Blunt M2試劑盒及鼠抗Myc標(biāo)簽抗體均是購于北京全式金生物技術(shù)有限公司;DNA擴增產(chǎn)物純化試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司);脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒、全蛋白提取試劑盒和Trizol(生工生物工程有限公司);Hieff UNICON? qPCR SYBR Green Master Mix(上海翊圣生物科技有限公司);L15培養(yǎng)基(賽佰慷(上海)生物技術(shù)有限公司);羊抗鼠 IgG-HRP、羊抗鼠IgG-dylight488和Fetal Bovine Serum (Thermo Scientific);無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒(天根生化科技有限公司);DAPI(Sigma).主要儀器包括qPCR儀(Applied Biosystems);激光共聚焦顯微鏡(德國徠卡高清晰光學(xué)儀器)和倒置熒光顯微鏡(Zeiss).
1.1.2 實驗用魚
所用斑馬魚為實驗室自養(yǎng)野生型(TAB系,是AB和TU品系雜交產(chǎn)生).實驗選取在溫度為28 ℃,按14 h/10 h晝夜節(jié)律條件飼養(yǎng)下的1年左右的成年斑馬魚,交配產(chǎn)受精卵[13].
1.2.1 設(shè)計引物
先從NCBI網(wǎng)站上查找斑馬魚Pax3a基因編碼蛋白的4個結(jié)構(gòu)域:PD3、HD、GPD和PD7,然后根據(jù)每個結(jié)構(gòu)域的mRNA序列,設(shè)計引物如下:
表1 Pax3a結(jié)構(gòu)域的引物序列
1.2.2 過表達載體構(gòu)建
用3 d的TAB仔魚,提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄制備cDNA.然后以cDNA為模板PCR擴增結(jié)構(gòu)域cDNA片段.將擴增得到的PCR產(chǎn)物克隆到p-M2-myc質(zhì)粒(pEASY-Blunt M2).轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)菌株后提取質(zhì)粒,進行PCR篩選和測序驗證.
1.2.3 體外細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染
斑馬魚胚胎成纖維細胞(Pac2)在32 ℃用L15完全培養(yǎng)基(L15培養(yǎng)基,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10% 胎牛血清,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%青霉素/鏈霉素)培養(yǎng)[14].10 μg表達載體與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑以1∶3的體積比,分別添加到L15培養(yǎng)基,各自混勻5 min后,將兩種混合物于室溫靜置15 min,添加到鋪滿Pac2細胞的培養(yǎng)瓶中.32 ℃培養(yǎng)8 h后換液,再培養(yǎng)48 h.抽提細胞總蛋白進行免疫印跡試驗.
1.2.4 qPCR
同樣方法轉(zhuǎn)染的Pac2細胞,提取總RNA,并反轉(zhuǎn)錄成cDNA.再進行qPCR檢測,以β-actin作為內(nèi)參.采用2-ΔΔCt法計算mRNA的相對表達量.
1.2.5 細胞免疫熒光
細胞轉(zhuǎn)染48 h后,用PBS清洗和體積分?jǐn)?shù)4% PFA固定.空氣干燥后加體積分?jǐn)?shù)0.5% Triton-100透膜.含體積分?jǐn)?shù)0.1%吐溫20和質(zhì)量分?jǐn)?shù)1% BSA的封閉液封閉后,依次用鼠抗myc單抗、羊抗鼠 IgG-dylight488孵育1h.PBS清洗后,滴加DAPI.在激光共聚焦熒光顯微鏡下觀察.
1.2.6 斑馬魚胚胎顯微注射
收集受精1 h內(nèi)受精卵,按文獻[15]的顯微注射方法,每個胚胎注射質(zhì)量濃度為100 ng/μL的質(zhì)粒2 nL.每組注射200顆同期受精胚胎.倒置顯微鏡拍攝,并統(tǒng)計眼球、腹部、尾鰭、脊椎和頭部等部位的表型變異量.
1.2.7 細胞劃痕實驗
在32 ℃條件下,L15完全培養(yǎng)基培養(yǎng)Pac2細胞.脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后,在培養(yǎng)皿中單層細胞表面劃兩道相隔2 cm的平行線,在0、16、25、40、48 h 5個時間點,相應(yīng)時間點的5組分別取10個點,進行測量劃痕兩側(cè)細胞的距離.取遷移距離平均值,t-test統(tǒng)計分析,GraphPad Prism 8軟件作圖.
1.2.8 表型測量和統(tǒng)計學(xué)分析
挑選發(fā)育25 d斑馬魚,比較PD3、GPD、HD、PD7、NC結(jié)構(gòu)域過表達胚胎表型差異,每組不少于42個統(tǒng)計點.質(zhì)量濃度0.25 μg/mL MS222麻醉,放置固體瓊脂糖模具上固定,置于體視鏡下方觀察內(nèi)眥、尾鰭、腹部色素、眼球、頭部和脊椎等部位.在眼球上部,最外側(cè)邊緣的中間為外眥中心點,眼球內(nèi)側(cè)陰影可見最靠近內(nèi)側(cè)邊緣,作為內(nèi)眥中心點.并結(jié)合文獻方法[16]分別測量兩側(cè)眼球的外眥和內(nèi)眥.內(nèi)眥是斑馬魚兩眼球內(nèi)側(cè)距離,外眥是兩側(cè)眼球上方中點間的距離,瞳孔半徑是單側(cè)瞳孔中心到邊緣的距離,眼球半徑是單側(cè)瞳孔中心到眼球邊緣的距離(圖2A).計算公式:
內(nèi)外眥比=x/y×100%
眼瞳面積比=(z/w)2×100%(圖2B).
A:x: 內(nèi)眥;y: 外眥;B:z: 瞳孔;w: 眼球; 標(biāo)尺:100 μm.
A:x: Inner Canthus;y: External Canthus; B:z: Pupil;w: Eyeball; Scan bar: 100 μm.
圖2 斑馬魚內(nèi)外眥和眼瞳面積比示意圖
Fig.2 Diagram of the ratio of inner/outer canthus and eye pupil area of zebrafish
在Pax3a各個結(jié)構(gòu)域cDNA的PCR擴增產(chǎn)物克隆后,PCR檢測陽性克隆.圖3顯示電泳結(jié)果.PCR條帶大小與預(yù)期一致,結(jié)構(gòu)域的堿基對即PD3(375 bp),GPD(468 bp),HD (165 bp),PD7 (138 bp),NC為空載體(陰性克隆),M(marker,DNA堿基對標(biāo)記)、GPD結(jié)構(gòu)域過表達后蛋白免疫印跡,有特異性條帶(圖3).
A:4種結(jié)構(gòu)域PCR電泳結(jié)果;B:GPD-myc融合蛋白免疫印跡結(jié)果.
A: PCR result of gel electrophoresis of four domains; B: Western blot result of GPD-myc.
圖3 4種保守結(jié)構(gòu)域PCR電泳和蛋白免疫印跡圖
Fig.3 PCR electrophoresis and Western blot image ofPax3aconserved domains
2.2.1Pax3a結(jié)構(gòu)域過表達細胞的免疫熒光觀察
將4種結(jié)構(gòu)域過表達質(zhì)粒和空白質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染細胞,過表達72 h后進行抗體免疫熒光.實驗結(jié)果顯示,與對照組NC相比,4種結(jié)構(gòu)域過表達的細胞都有明顯的綠色熒光(圖4).
A:PD3;B:HD;C:GPD;D:PD7;E:NC
2.2.2Pax3a結(jié)構(gòu)域過表達的mRNA相對表達量檢測
為了驗證每個結(jié)構(gòu)域過表達量,本實驗通過qPCR檢測對照組和實驗組每個結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄水平.實驗結(jié)果顯示,每個轉(zhuǎn)染的結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄只在相應(yīng)的樣本中有極顯著上調(diào),證明結(jié)構(gòu)域的過表達載體確實在細胞中表達.因為PD7是GPD結(jié)構(gòu)域中的一部分,所以在GPD結(jié)構(gòu)域過表達時,也顯示PD7高表達(圖5).
A:PD3載體的mRNA相對表達量;B:HD載體的mRNA相對表達量;C:GPD載體的mRNA相對表達量;D:PD7載體的mRNA相對表達量.1)與對照組比較,P<0.01.
A: The mRNA relativity expression of PD3 vector; B: The mRNA relativity expression of HD vector; C: The mRNA relativity expression of GPD vector; D: The mRNA relativity expression of PD7 vector.1)Compare to NCP<0.01.
圖5Pax3a結(jié)構(gòu)域過表達的mRNA相對表達量
Fig.5 RNA level test ofPax3adomain overexpression
為了探索最佳注射量,先向斑馬魚受精胚胎中分別注射質(zhì)量濃度為0、100、200、300 ng/μL的PD3質(zhì)粒各2 nL,每組不少于150個胚胎,3 d后統(tǒng)計結(jié)果.注射質(zhì)量濃度為100 ng/μL的PD3質(zhì)粒胚胎存活率最高并有較高的畸形率(圖6).
A:分別注射質(zhì)量濃度為0、100、200、300 ng/μL的PD3過表達載體,統(tǒng)計3 d內(nèi)胚胎存活率;B:分別注射質(zhì)量濃度為0、100、200、300 ng/μL的PD3過表達載體,統(tǒng)計3 d內(nèi)胚胎畸形率.
A: Statistics of embryo survival ratio in three days of PD3 vector with 0、100、200、300 ng/μL concentrations; B: Statistics of embryo malformation ratio in three days of PD3 vector with 0、100、200、300 ng/μL concentrations.
圖6 PD3結(jié)構(gòu)域過表達載體注射量優(yōu)化
Fig.6 Quantity optimization of PD3 domain overexpression vector injection
然后向斑馬魚胚胎中分別注射2 nL的質(zhì)量濃度為100 ng/μL的PD3、GPD、HD和PD7結(jié)構(gòu)域過表達載體,以NC空白組作為對照,比較存活率.每組不低于150個胚胎,3 d后統(tǒng)計存活率.結(jié)果發(fā)現(xiàn)4種結(jié)構(gòu)域注射胚胎的存活率并非都比空白對照低,其中存活率大小依次是:HD>NC>PD3>GPD>PD7(圖7).
在胚胎顯微注射結(jié)構(gòu)域過表達質(zhì)粒后,觀察發(fā)育25 d的幼魚頭部、腹部、尾鰭、脊椎和眼球等部位都有色素分布變異.發(fā)現(xiàn)PD3過表達組出現(xiàn)眼球花色變異特別明顯(圖8,9).
為了進一步鑒定結(jié)構(gòu)域特異性表型,于是統(tǒng)計斑馬魚頭部、尾鰭、背鰭至側(cè)腹中央部位,側(cè)腹部上邊緣、側(cè)腹部下邊緣、眼球上邊緣等部位色素分布變異數(shù).PD3、GPD、HD、NC和PD7結(jié)構(gòu)域的色素分布變異率分別是55%、29%、21%、17%和14%(圖10).可見PD3和GPD在色素分布變異方面的發(fā)病率相對HD高,而PD7對色素變化偏低.與對照組相比,PD3和GPD結(jié)構(gòu)域過表達對胚胎眼瞳面積比有顯著性差異,也對內(nèi)外眥距離比有極顯著性差異,HD結(jié)構(gòu)域有顯著性差異.而PD7對眼瞳和內(nèi)外眥均無顯著性差異.
圖7 4種結(jié)構(gòu)域胚胎注射存活率
A-B: 眼球;C-D:頭部; E-F: 上腹部;G-H: 中腹部;I-J: 尾鰭;K-L:脊椎;體視鏡顯微鏡拍攝,標(biāo)尺:100 μm
A-B: Eyeball; C-D: Head; E-F:Upper abdomen;G-H: Middle abdomen; I-J: Tail fin; K-L: Vertebration; Shot by stereomicroscope, Scan bar:100 μm
圖8Pax3a結(jié)構(gòu)域過表達的胚胎特異性色素表型
Fig.8 Characteristic pigment phenotypes ofPax3adomain overexpressed embryos
A:實驗組過表達變異眼球色素變異;B:野生型眼球色素;C:實驗組尾部色素變異;D:野生型尾部色素;體視鏡顯微鏡拍攝,標(biāo)尺:100 μm.
A:Eyeball pigment variation of PD3 overexpression;B:Eyeball pigment variation of wildtype;C:tail fin pigment variation of PD3 overexpression; D:Tail fin pigment variation of wildtype; Shot by stereomicroscope, Scan bar:100 μm.
圖9 PD3結(jié)構(gòu)域過表達胚胎特異性表型
Fig.9 PD3 domain overexpressing embryo-specific phenotypes
A:眼球瞳孔距離比值; B:內(nèi)眥距離和外眥距離比值; C:色素變異率.與對照組比較, 1)P<0.05; 2)P<0.01.
A:Distance ratio between eyeball and pupil; B:Distance ratio between canthus and outer canthus; C:Pigment variation rate.Compare to NC, 1)P<0.05; 2)P<0.01.
圖10 斑馬魚胚胎表型變異統(tǒng)計
Fig.10 Statistics of phenotypic variation of zebrafish embryos
為了比較結(jié)構(gòu)域?qū)毎袨榈挠绊?,采用細胞培養(yǎng)結(jié)合劃痕試驗.結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)染和劃痕后距離測量統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn),結(jié)構(gòu)域過表達對劃痕間遷移距離大小依次是:GPD組>NC組>HD組>PD7組>PD3組,并且在16、25、40、48 h 4個時間點的遷移與對照組有顯著性差異.其中GPD結(jié)構(gòu)域過表達顯示促進細胞遷移,而PD3、HD和PD7結(jié)構(gòu)域在細胞中過表達會抑制細胞遷移,且PD3結(jié)構(gòu)域過表達對細胞遷移抑制作用最大(圖11和表2).
圖11 Pax3a結(jié)構(gòu)域?qū)毎w移的影響(×100)
表2 細胞遷移距離統(tǒng)計分析
組別不同時段/h16254048NC1 180.2±42.31 632.0±25.91 977.7±38.72 294.6±28.1PD3674.9±29.31)890.5±32.21)1 043.8±28.51)1 196.7±14.11)GPD1 223.3±23.91)1 697.6±39.31)2 084.6±47.71)2 448.2±43.61)HD1 051.2±28.11)1 406.1±23.01)1 701.1±44.41)1 981.6±25.41)PD7942.2±54.01)1 301.8±40.61)1 573.3±47.91)1 827.5±57.41)
1)與對照組比較,P<0.05
本實驗成功構(gòu)建了斑馬魚Pax3a的4種結(jié)構(gòu)域(PD3、GPD、HD和PD7)的過表達載體.胚胎注射后,觀察發(fā)育25 d的斑馬魚,發(fā)現(xiàn)PD3過表達的色素變異比例達到55%,遠高于其他結(jié)構(gòu)域過表達以及空白對照組,同時眼瞳比和內(nèi)外眥比減小.有報道顯示,Pax3雜合突變的小鼠在其腹部、尾部、四肢也會出現(xiàn)白色的斑點[17].根據(jù)色素減退和眼球發(fā)育變異,本研究認(rèn)為Pax3a結(jié)構(gòu)域過表達引起的表型變異與人類I型瓦氏癥中白斑癥、虹膜異色和內(nèi)眥移位癥狀非常類似[18].
PAX3在色素形成過程中具有高度保守的作用[19].在黑色素細胞中PAX3被認(rèn)為能夠調(diào)節(jié)黑色素生成譜系基因MITF和TRP-1(tyrosinase-related protein-1)[19-21].PAX3通過NCAM1(neural cell adhesion molecule 1)等調(diào)節(jié)黑色素干細胞的遷移和分化[17,22].當(dāng)黑色素干細胞中在Wnt信號肽存在的條件下,PAX3通過β-cat(β-catenin)、Dct(l-dopachrome tautomerase)、SOX10、TRP-1和MITF協(xié)同作用,激活酪氨酸激酶通路,生成黑色素[8,23].據(jù)報道PAX3同源基因Pax3a對黑色素細胞遷移有抑制[11]作用.這些報道可以解釋我們的結(jié)果,即Pax3a結(jié)構(gòu)域過表達會抑制細胞遷移和黑色素生存.
Pax3a每個結(jié)構(gòu)域?qū)毎袨橛胁煌饔?與對照組和其他實驗組相比,PD3和GPD結(jié)構(gòu)域過表達產(chǎn)生的畸形變異最顯著.同樣在Pac2細胞遷移實驗中,PD3和GPD結(jié)構(gòu)域?qū)毎w移影響最明顯.在胚胎發(fā)育初期,表皮黑色素母細胞和頜面部原始的間充質(zhì)細胞起源于神經(jīng)嵴干細胞,具備可塑性和遷移性[12,17,24-25].由Pax3a結(jié)構(gòu)域過表達引起的斑馬魚胚胎色素分布變異,眼球發(fā)育變異,可能是由于結(jié)構(gòu)域?qū)Πl(fā)育初期神經(jīng)嵴細胞遷移異常引起的.而細胞遷移受到TGFβ調(diào)節(jié),且TGFβ信號影響小鼠晶狀體纖維細胞的分化[26].可見Pax3a結(jié)構(gòu)域過表達對細胞行為的影響沒有組織和細胞特異性.
Pax3a4個結(jié)構(gòu)域過表達產(chǎn)生特征性眼球變異表型.有報道顯示,PAX6(paired box 6)的表達水平對眼的發(fā)育極其敏感[27].在眼發(fā)育過程中,PAX6表達于視神經(jīng)、晶狀體、角膜上皮、虹膜、睫狀體、視網(wǎng)膜及色素上皮層[28-29].當(dāng)PAX6活性缺乏時,視泡與表面外胚層的接觸不能維持,神經(jīng)視網(wǎng)膜和視網(wǎng)膜色素上皮不能分化,最終視泡退化,表面外胚層源性的眼結(jié)構(gòu)完全缺失[30].Antosova等[31]發(fā)現(xiàn)Wnt信號對小眼球的形成和纖維細胞分化至關(guān)重要.Yang等[32]發(fā)現(xiàn)PAX6通過調(diào)控Wnt通路調(diào)控晶狀體的發(fā)育,并且發(fā)現(xiàn)FGF信號通路對于晶狀體的形成是必需的,Wnt信號通路與BMP信號通路在晶狀體形成過程中起到相反的作用.因為PAX6也包含PD3和HD結(jié)構(gòu)域,所以推測PD3或者HD結(jié)構(gòu)域通過直接或者間接作用于Wnt/BMP信號通路來調(diào)節(jié)眼球發(fā)育.據(jù)報道,MITF突變對黑素細胞有不同程度的影響,而有些還影響視網(wǎng)膜色素細胞,導(dǎo)致未著色或色素減退的眼睛比正常小(因此稱為小眼炎)[33].本研究結(jié)果顯示4個結(jié)構(gòu)域過表達斑馬魚的眼瞳面積比都小于對照組,同時伴隨色素的變化,這些表型改變類似于小眼炎.
Pax3a4個結(jié)構(gòu)域過表達產(chǎn)生的斑馬魚胚胎表型,類似于PAX3基因突變導(dǎo)致的瓦氏癥WS1和WS3型.WS1和WS3的特征是一種特殊的面部眼球斜視眥(或遠距眥),其眼內(nèi)眥側(cè)位移被認(rèn)為是WS1分類最可靠的特征,有非常高的外顯率[16].雜合PAX3基因突變被認(rèn)為是大多數(shù)WS1病例的病因[5].通?;蛲蛔儼ū磉_量減少或者增多.增加表達量可能會起到劑量效應(yīng),并導(dǎo)致色素或者內(nèi)外眥的變化[16].
人類瓦氏癥表型中,表現(xiàn)為色素、聽力、頜面部肌肉、骨骼、結(jié)腸和心臟功能結(jié)構(gòu)異常[5]等多發(fā)癥狀,且無固定表型.過表達Pax3a結(jié)構(gòu)域不僅造成了色素的變化,同時也造成了眼球發(fā)育異常,這與文獻[33]發(fā)現(xiàn)的PAX3-MITF基因網(wǎng)絡(luò)中,MITF突變導(dǎo)致色素變化和眼球變異表型相一致.與人類瓦氏癥癥狀對比,在體色、瞳孔、內(nèi)外眥和虹膜異色等表型改變都比較符合,因此認(rèn)為Pax3a結(jié)構(gòu)域過表達能夠復(fù)制,至少是部分復(fù)制人類PAX3基因突變引起的瓦氏癥表型.
雖然本實驗中對照組也出現(xiàn)較多的死亡和畸形,4個結(jié)構(gòu)域過表達的特征性表型并不專一,發(fā)生比例也不是很高,但仍然有統(tǒng)計學(xué)差異.一是因為瓦氏癥是屬于雜合多發(fā)基因遺傳性疾病,單個基因突變未必會有明顯的瓦氏癥癥狀出現(xiàn);另一個原因是因為PAX3每個結(jié)構(gòu)域有各自的作用通路,導(dǎo)致PAX3功能和表型多樣,其差異在GPD和PD7之間更明顯(后者是前者結(jié)構(gòu)域的一部分).在生物體特定發(fā)育過程中,基因過表達或者基因突變發(fā)生引起相關(guān)的信號通路的激活,才可能會引起該癥狀.臨床上瓦氏癥的發(fā)生和遺傳是異質(zhì)散發(fā)型的,并非所有的都是顯性遺傳[5].鑒于瓦氏癥病人案例不足,治療手段有限,該類疾病研究在國內(nèi)鮮有報道,在國外有少量報道,因此建立一種斑馬魚瓦氏癥疾病模型,能夠為研究瓦氏癥表型特征和致病機制提供材料基礎(chǔ),也能針對開發(fā)相應(yīng)的診斷方法和治療手段.本研究結(jié)果顯示瓦氏癥的表型呈多樣性可能與結(jié)構(gòu)域相關(guān)的調(diào)控通路密切相關(guān),值得深入研究.
致謝:感謝上海海洋大學(xué)生物系和神經(jīng)科學(xué)研究所老師和徐雨雁同學(xué)對本實驗課題研究上的技術(shù)幫助.