基于高密度連鎖圖譜定位玉米株高QTL

劉敬賢 黃亞群 陳景堂

摘要：為了解析株高性狀的遺傳基礎，以X178和NX531為親本構建的124份RIL群體為研究材料，基于高密度SNP標記構建的包含7 278個bin的bin-map連鎖圖譜，對辛集、保定2個地點RIL群體的株高、穗位高、穗位系數(shù)3個性狀進行QTL定位分析，共檢測到16個QTL位點，有9個QTL的表型貢獻率大于10.00%。其中辛集檢測到7個，單個QTL表型貢獻率范圍4.67%～13.94%;保定檢測到9個，單個QTL表型貢獻率范圍0.35%～25.56%。在2個環(huán)境下檢測到qEHX3和qEHB3的置信區(qū)間存在重疊。在第1連鎖群上289.16～296.77 Mb發(fā)現(xiàn)控制株高的qPHB1和穗位高的qEHB1-2定位區(qū)間相鄰。在bin1.07定位到的qPHX1-1區(qū)間內(nèi)存在br2（brachytic2）基因，bin1.09～1.1定位到的qPHX1-2區(qū)段內(nèi)存在d8（dwarf8）基因，bin3.07定位到的qEHX3區(qū)段內(nèi)存在ccd8基因，這3個基因影響節(jié)間的伸長，與株高、穗位高的發(fā)育相關。該研究結果為株高相關性狀QTL精細定位、克隆提供理論依據(jù)。

關鍵詞：玉米;株高;穗位高;穗位系數(shù);高密度連鎖圖譜

中圖分類號：S513.03 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）13-0038-04

隨著我國農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，全程機械化生產(chǎn)是解決“三農(nóng)”問題的關鍵。玉米倒伏直接影響機械化生產(chǎn)，而品種自身抗倒能力的強弱直接決定了能否采用機械化生產(chǎn)。在玉米的諸多株型性狀中，株高、穗位高與玉米抗倒能力密切相關。Horner等以F44和F6為材料進行7輪回交選擇，發(fā)現(xiàn)穗位降低9%，倒伏率減少25%[1]。張澤民等研究表明，通過降低穗位系數(shù)，可以提高其抗倒性[2]。付志遠等研究發(fā)現(xiàn)，穗上節(jié)間數(shù)與穗位高及穗位系數(shù)顯著相關，可以通過增加穗上節(jié)間數(shù)來減小穗位系數(shù)，增強玉米的抗倒性能[3]。而選育抗倒、適合于機械化收獲的玉米品種，必須了解株高、穗位高等性狀的遺傳機制。

一些研究者已發(fā)現(xiàn)株高、穗位高性狀受主基因+多基因控制，且基因的加性、顯性和上位性效應均起作用;在不同的遺傳群體中這些基因作用的大小有差異，以基因的加性效應為主[4-6]。嚴建兵等利用簡單序列重復（SSR）等分子標記對株高等性狀進行定位研究，發(fā)現(xiàn)了一些與玉米株高、穗位高有關的數(shù)量性狀基因座（QTL）[7-10]。這些相關QTL因其定位區(qū)間大，目前還沒有應用于育種實踐。雖然，楊梅利用所設計的SSR和Indel標記對玉米第3染色體上控制株高的主效QTL qPH3.2.1、qPH3.2.2、qPH3.3進行了精細定位，分別將定位區(qū)間縮小到7.6、7.2、11 Mb，仍無法精準地預測到候選基因[11]。

隨著高通量、操作簡便、成本低廉的第3代測序技術廣泛應用，利用高密度的單點多態(tài)（SNP）標記檢測控制數(shù)量性狀的關鍵位點已成為眾多學者的研究工具[12-13]。在高粱[14]、玉米[15]、水稻[16]、小麥[17]、棉花[18]等多種作物上均有利用SNP標記對株高等性狀進行定位分析的報道。Wang等利用SNP標記對玉米株高進行定位，發(fā)現(xiàn)在控制株高的QTL區(qū)間內(nèi)存在na1、td1和d3[19]。

雖然Sheridan[20]等學者，利用玉米突變體發(fā)現(xiàn)了與株高相關的基因，但對這些基因幾乎未能實現(xiàn)克隆[20-21]。到目前為止，只有Teng等對ZmGA3ox2基因進行了克隆[22]。而利用高通量的SNP標記可將位點定位到較小的區(qū)段，實現(xiàn)目標性狀位點的精細定位和候選基因的有效預測。本研究采用玉米自交系X178和NX531為親本構建的重組自交系（RIL），對株高相關性狀進行調查，并利用高密度的連鎖圖譜對其進行定位，挖掘株高相關性狀緊密連鎖的分子標記，檢測主效QTL區(qū)域，為株高相關性狀QTL克隆和分子標記輔助育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以玉米農(nóng)大108親本之一X178和農(nóng)單5親本之一NX531雜交，以單粒傳法連續(xù)自交構建的124份F9重組自交系（RIL）為試驗材料。農(nóng)大108和農(nóng)單5均為國家審定品種，具有廣泛種植面積。

1.2 試驗設計

RIL群體及其2個親本于2017年分別在國家玉米改良中心河北分中心試驗基地（簡稱保定，BD，38°87′N，115°47′E）和河北農(nóng)業(yè)大學辛集試驗基地（簡稱辛集，XJ，37°94′N，115°22′E）進行春播（4月20日）和夏播（6月18日）。2個試驗點均采用隨機區(qū)組試驗設計，單行區(qū)，2次重復，小區(qū)行長 3.0 m，行間距0.6 m，種植密度設置為 75 000株/hm2，并設置保護行。保定試驗點，無前茬作物，播種前施農(nóng)家肥作為基肥，在播種前和拔節(jié)期各澆灌1次水;辛集試驗點，前茬作物為小麥，施用三元（N ∶ P2O5 ∶ K2O=18 ∶ 20 ∶ 5）復合肥做基肥，播種后進行澆水。其他田間管理同大田生產(chǎn)。

1.3 株高相關性狀測定指標及方法

在玉米成株期，對辛集和保定2個試驗點RIL群體每株系選取3株進行株高（plant height，簡稱PH）、穗位高（ear height，簡稱EH）的測定，并計算穗位系數(shù)（ear height coefficients，簡稱EHC）[18]。株高：地面至雄穗頂部的距離（cm）;穗位高：地面至穗位節(jié)處的距離（cm）;穗位系數(shù)：穗位高與株高的比值。

1.4 表型數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用SPSS 19.0對所調查株高、穗位高和穗位系數(shù)進行描述性統(tǒng)計分析、正態(tài)性Kolmogorov-Smirnov檢驗。

1.5 遺傳連鎖圖譜的構建及QTL定位分析

采用7 278個bin標記構建的覆蓋全基因組2 017.13 Mb bin-map遺傳圖譜[23]，根據(jù)復合區(qū)間作圖法（complex interval mapping，簡稱CIM），使用R/qtl軟件包中的cim_scan命令，對株高、穗位高、穗位系數(shù)進行QTL定位，window設為10 cM。運行參數(shù)為默認值，LOD值設置為2.5，QTL置信區(qū)間用1.5個LOD值衰減方法進行判定，用R命令的1 m來計算每個QTL的加性效應及其對應的表型貢獻率。

2 結果與分析

2.1 RIL群體及其親本株高相關性狀的表型統(tǒng)計分析

保定和辛集2個試驗點RIL群體及其親本株高、穗位高、穗位系數(shù)表型數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析結果見表1。對親本株高、穗位高、穗位系數(shù)3個性狀進行差異顯著性t檢驗發(fā)現(xiàn)，親本X178的株高、穗位高在辛集環(huán)境下極顯著低于親本NX531（P<0.01），親本X178的穗位高在保定環(huán)境下顯著高于親本NX531（P<0.05）。RIL群體株高、穗位高、穗位系數(shù)在2個環(huán)境下的最大值均高于相應的高值親本，最小值均低于相應的低值親本，表現(xiàn)為雙向超親分離，具有較大的變異范圍。對RIL群體株高、穗位高、穗位系數(shù)的分布狀況進行單樣本K-S檢驗，P值為0.796～0.997，說明3個性狀均服從正態(tài)分布。RIL群體株高、穗位高、穗位系數(shù)3個性狀表現(xiàn)典型的數(shù)量性狀特征，符合QTL定位的要求。

2.2 高密度遺傳連鎖圖譜的構建

利用已獲得的7 278個重組bin標記，構建的高密度bin標記遺傳圖覆蓋全基因組2 017.13 Mb，相鄰的2個bin之間的物理距離最大為3.28 Mb，最小為80.00 kb，平均為 277.00 kb;構建的遺傳連鎖圖譜總長為2 569.00 cM，相鄰的bin標記之間平均遺傳距離為0.35 cM。

2.3 RIL群體各個株型相關性狀的QTL分析

對玉米RIL群體株高、穗位高、穗位系數(shù)3個性狀進行QTL定位分析，共定位到16個QTL（表3），其中在辛集檢測到7個，分布在1、2、3、4號染色體上，單個QTL表型貢獻率為 4.67%～13.94%，其中有4個QTL的表型貢獻率大于10.00%，單個QTL的遺傳圖距為4.27～17.79 cM，物理距離為1.67～10.21 Mb，其中有2個QTL的物理距離在5.00 Mb以內(nèi);在保定檢測到9個，分布在1、3、4、7號染色體上，單個QTL表型貢獻率范圍為0.35%～25.56%，其中有5個QTL的表型貢獻率大于10.00%，單個QTL的遺傳圖距為2.07～18.83 cM，物理距離為1.14～10.35 Mb，其中有6個QTL的物理距離在 5.00 Mb 以內(nèi)。

株高定位到5個QTL，分布在1、7染色體上，可解釋 7.23%～19.44%的表型變異。在第1染色體269.04 Mb位置上的qPHX1-2可解釋13.94%的表型變異，在第7染色體147.51 Mb位置上的qPHB7-2可解釋19.44%的表型變異，并且qPHX1-2和qPHB7-2的增效等位基因均來自母本X178。穗位高定位到6個QTL，分布在第1、2、3、7染色體上，可解釋0.35%～25.56%的表型變異，其中定位到4個QTL的表型貢獻率大于10.00%，qEHX2和qEHB3的增效等位基因均來自父本NX531，qEHX3和qEHB7的增效等位基因均來自母本X178，其中bin3.07（204.75 Mb）位置上的qEHX3和bin3.07～3.08（207.74 Mb）位置上的qEHB3的峰值物理位置相距5.98 Mb，其置信區(qū)間存在重疊，說明該區(qū)段上控制穗位高的QTL具有較強的穩(wěn)定性與可靠性。第1連鎖群上在289.16 Mb～296.77 Mb之間發(fā)現(xiàn)控制穗位高和株高QTL定位區(qū)間臨近，可能是存在緊密連鎖的控制株高、穗位高的基因，也可能是一因多效。穗位系數(shù)檢測到6個QTL，分布在2、4、7染色體上，可解釋4.67%～17.55%的表型變異，3個QTL的表型貢獻率大于10.00%，其中在第4染色體bin 4.05（71.63 Mb）位置上的qEHCB4可解釋的表型貢獻率最大。

3 結論與討論

本研究發(fā)現(xiàn)辛集、保定2個環(huán)境下株高、穗位高和穗位系數(shù)表型值間相關關系與QTL定位相關性近似一致。如株高與穗位高表現(xiàn)出高度的相關關系，在第1連鎖群上 289.16 Mb～296.77 Mb發(fā)現(xiàn)控制株高的qPHB1和穗位高的qEHB1-2定位區(qū)間臨近。這一研究結果也證實了其他研究試驗[24]。李清超等在多個區(qū)域同時檢測到控制株高和穗位高的QTL，并且株高和穗位高具有較強的相關關系[24]。

株高、穗位高是重要的農(nóng)藝性狀，是抗倒、機械化收獲的重要指標參數(shù)。本研究利用高密度連鎖圖譜，檢測到16個與株高、穗位高、穗位系數(shù)相關的QTL。該定位結果與前人研究進行比較，發(fā)現(xiàn)本研究在第1染色體17.66～19.60 Mb區(qū)段檢測到的控制穗位高的qEHB1-1，位于李浩川等定位到的穗位高QTL區(qū)間內(nèi)[25];在第3染色體194.77～204.98 Mb區(qū)段檢測到控制穗位高的qEHX3和202.53～208.51 Mb區(qū)段檢測到控制穗位高的qEHB3，在第3染色體上檢測到控制穗位高的QTL與楊曉軍等[9]、Guan等[21]、Li等[26]的定位結果存在重疊，并且qEHX3和qEHB3的峰值物理位置相距 2.99 Mb;在第7染色體133.38～137.80 Mb區(qū)段檢測到控制穗位高的qEHB7，該QTL位于楊曉軍等在第7染色體上檢測到控制穗位高的QTL定位區(qū)間內(nèi)[9];在第2染色體39.27～47.46 Mb區(qū)段檢測到控制穗位系數(shù)的qEHCX2-1，與李浩川等定位到的穗位高QTL區(qū)間存在重疊[25]。Guan等在qEHX3定位區(qū)間內(nèi)發(fā)現(xiàn)ccd8基因，通過影響玉米節(jié)間的伸長，影響玉米穗位高[21]。依據(jù)這些位點在不同的群體、不同試驗環(huán)境均被檢測到這一結果，認為qEHB1-1、qEHX3、qEHB3、qEHB7、qEHCX2-1是真實存在的，為遺傳穩(wěn)效QTL，是控制株高的重要位點。

本研究在bin1.07（201.23～202.9 Mb）區(qū)段定位到株高的qPHX1-1，其定位區(qū)間僅有1.67 Mb，生物信息學研究發(fā)現(xiàn)在該區(qū)域內(nèi)存在br2（brachytic2）基因。玉米中br2基因編碼ABC轉運體，參與生長素的極性運輸，玉米br2的突變主要影響下部莖節(jié)間的生長[27]。在bin1.09-1.10（264.11～274.14 Mb）位置上定位到株高的qPHX1-2，在這一區(qū)段內(nèi)存在d8（dwarf8）基因。擬南芥、小麥、玉米中的GAI，Rht-1和d8為直系同源基因，GAI、Rht-1和d8基因編碼含有SH2結構域，類似于核轉錄因子的蛋白質，可能參與赤霉素信號轉導[28]。在bin3.07（194.77～204.98 Mb）位置上定位到株高的qEHX3，在這一區(qū)段內(nèi)存在ccd8（carotenoid cleavage dioxygenase8）基因。Guan等發(fā)現(xiàn)ccd8基因參與獨角金內(nèi)酯的信號轉導途徑，Zmccd8突變會顯著降低莖直徑，影響植株節(jié)間的伸長，使不定根發(fā)育遲緩[21]。

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