董建國 饒丹 李迎曉

摘要：為了解河南地區(qū)豬德爾塔冠狀病毒（PDCoV）的遺傳變異情況，采用RT-PCR方法對2015—2017年采自河南省南部地區(qū)豬場疑似PDCoV豬腸道內(nèi)容物中的S和N基因進(jìn)行擴(kuò)增和測序，并進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果表明，本次擴(kuò)增基因間同源性較高，單獨(dú)成一支，且與我國分離的CH/Sichuan/S27/2012毒株、泰國分離的Swine/Thailand/S5011、美國近些年分離的毒株位于同一分支。近年我國大陸分離的其他毒株和我國香港早期分離的HKU15-44、HKU15-155均位于另一分支，故結(jié)果提示河南地區(qū)PDCoV發(fā)生了一定的變異，該研究結(jié)果為本地區(qū)PDCoV疫情的防控提供了一定的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：豬德爾塔冠狀病毒;S基因;N基因;變異分析

中圖分類號： S852.65+1 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）13-0052-03

冠狀病毒能感染多種動(dòng)物甚至人類，引起呼吸道和腸道疾病。冠狀病毒一般可分為α冠狀病毒、β冠狀病毒和γ冠狀病毒3個(gè)群，最近國際病毒分類委員會(huì)在原有基礎(chǔ)上增加了δ冠狀病毒群。豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）和豬流行性腹瀉病毒（PEDV）為α冠狀病毒，均能引起豬腹瀉、嘔吐甚至死亡。2009年，在豬腸道腹瀉樣品中，研究人員檢測出豬冠狀病毒，經(jīng)鑒定為豬δ冠狀病毒（PDCov），屬于δ冠狀病毒群[1]。目前，由冠狀病毒引起的豬腸道疾病對我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了重大損失。2009年，我國香港首次報(bào)道在豬腹瀉病料中檢測到2個(gè)豬δ冠狀病毒，命名為HKU 15-44和HKU 15-155[1]。2014年2月，美國俄亥俄州農(nóng)業(yè)部宣布美國存在豬δ冠狀病毒。1個(gè)月后明尼蘇達(dá)大學(xué)首次全基因測序一株豬δ冠狀病毒SDVC/USA/Illinois121/2014[2]。此后不久，愛荷華州立大學(xué)做出了同樣的報(bào)道[3]。至2015年1月，美國至少20個(gè)州暴發(fā)豬δ冠狀病毒[4]。2014年4月，韓國出現(xiàn)豬δ冠狀病毒[5]。2015年，江西農(nóng)業(yè)大學(xué)首次報(bào)道我國大陸出現(xiàn)豬δ冠狀病毒[6]。

近年來，豬腹瀉相關(guān)傳染病對我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了重大損失。針對此次豬δ冠狀病毒的爆發(fā)，河南地區(qū)還未有相關(guān)分子流行病學(xué)調(diào)查。因此，本研究以豬δ冠狀病毒為研究對象，針對纖突蛋白（S）基因和核蛋白（N）基因進(jìn)行分子流行病學(xué)調(diào)查，以掌握我國豬δ冠狀病毒的流行現(xiàn)狀，為豬δ冠狀病毒的防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料

針對2015—2017年河南省駐馬店和信陽地區(qū)豬場疑似暴發(fā)豬德爾塔冠狀病毒的自然發(fā)病豬，采集發(fā)病豬腸道組織及腹瀉樣品于-80 ℃凍存?zhèn)溆?，所有試?yàn)均在信陽農(nóng)林學(xué)院牧醫(yī)工程學(xué)院動(dòng)物疾病檢測實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2 主要試劑

病毒DNA/RNA提取試劑盒，購自Magen公司產(chǎn)品;反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購于Promega公司產(chǎn)品;RT-PCR相關(guān)試劑盒，購自ToYoBo生物科技有限公司和Vazyme公司;DNA Marker DL 2000等，購自TaKaRa公司;EB替代染料，購自廣州華奇盛生物科技有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中發(fā)布的CH SXD12015等豬德爾塔冠狀病毒毒株全基因組序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，根據(jù)S基因、M基因和N基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)擴(kuò)增其全長的特異性引物序列。引物由江蘇蘇州金維智生物公司合成。引物信息見表1。

1.4 S和N基因的擴(kuò)增及克隆

將小腸內(nèi)容物加入1 mL滅菌PBS混勻，按TRIzol試劑盒操作說明書提取病料組織總RNA。以提取的總RNA為模板，采用AMV反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄制備cDNA。然后以cDNA為模板，S1F/R、S2F/R、S3F/R、MF/R和NF/R為引物，使用TOYOBO生物科技有限公司高保真酶對目的片段進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增體系為50 μL，KOD-Plus-Neo 1 μL，10×PCR Buffer for KOD-Plus-Neo 5 μL，2 mmol/L dNTP 5 μL，25 mmol/L MgSO4 3 μL，cDNA模板4 μL，上游引物2 μL，下游引物2 μL，RNase Free H2O 28 μL。PCR擴(kuò)增循環(huán)條件：94 ℃ 預(yù)變性2 min;98 ℃變性10 s，62 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s/kb，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。取5 μL的PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳觀察。PCR陽性樣品用凝膠回收后克隆于pEASY-Simple T1 Cloning Vector載體上，陽性重組質(zhì)粒由江蘇蘇州金維智生物公司測序。

1.5 序列比對與分析

利用Lasergene及Mega 5.0軟件對不同病毒株的S基因和N基因序列構(gòu)建進(jìn)化樹，PDCov代表毒株的基因序列均下載自GenBank。

2 結(jié)果與分析

2.1 病料的RT-PCR檢測

采用S和N基因特異性引物擴(kuò)增出S的3個(gè)片段S1、S2、S3和N基因片段，瓊脂糖凝膠電泳分析表明，擴(kuò)增片段大小與預(yù)期一致，測序結(jié)果表明擴(kuò)增片段是PDCov，編號分別為ZMD1、ZMD2、ZMD3、XY1、XY2，ZMD代表駐馬店地區(qū)，XY代表信陽地區(qū)（圖1、圖2、圖3、圖4）。

2.2 PDCoV S基因進(jìn)化樹的構(gòu)建

運(yùn)用分子生物學(xué)軟件Mega 5.0對測定的S基因序列和國內(nèi)外具有代表性的序列構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果（圖5）顯示，整個(gè)遺傳進(jìn)化樹可分為兩大分支， 其中擴(kuò)增的PDCoV S基因與我

國大陸毒株CH/Sichuan/S27/2012、我國臺灣毒株Swine/Thailand/S5011和美國毒株P(guān)DCoV/USA/Ohio137/2014、8734/USA/IA/2014、SD3424和PDCoV/USA/Illinois121/2014處于同一分支Group Ⅰ，且擴(kuò)增的S基因單獨(dú)形成一支。2015年我國分離的PDCoV毒株以及2004年分離的CHN/AH/2004、2014年分離的CHN/HB/2014和2009年我國香港分離的HKU15-44、HKU15-155處于同一分支Group Ⅱ。

2.3 PDCoV N基因進(jìn)化樹的構(gòu)建

運(yùn)用分子生物學(xué)軟件Mega 5.0對測定的N基因序列和國內(nèi)外具有代表性的序列構(gòu)建進(jìn)化樹，結(jié)果（圖6）顯示，整個(gè)遺傳進(jìn)化樹可分為兩大分支，其中擴(kuò)增的PDCoV N基因與我國大陸毒株CH Sichuan/S27/2012、我國臺灣毒株Swine/Thailand/S5011和美國毒株P(guān)DCoV/USA/Ohio137/2014、8734/USA/IA/2014、SD3424和PDCoV/USA/Illinois121/2014處于同一分支Group Ⅰ，且擴(kuò)增的N基因單獨(dú)形成一支。2015年中國分離的PDCoV毒株以及2004年分離的CHN/AH/2004、2014年分離的CHN/HB/2014和2009年香港分離的HKU15-44、HKU15-155處于同一分支Group Ⅱ。

3 討論

冠狀病毒能夠引起人、哺乳動(dòng)物和禽類發(fā)病，對公共安全具有潛在威脅。δ冠狀病毒是冠狀病毒家族的新成員，于2009年首次在香港的野禽中被發(fā)現(xiàn)[7]。2014年2月美國在俄亥俄州發(fā)現(xiàn)首例PDCoV，隨后在20多州的豬群中發(fā)現(xiàn)PDCoV[4]。近幾年，我國多省份均有PDCoV的報(bào)道[8]。筆者所在實(shí)驗(yàn)室從2015年9月起對來自河南省不同地區(qū)的腹瀉病料樣品進(jìn)行PDCoV檢測，共檢測出5份陽性。

PDCoV基因組全長約25 kb，依次編碼3個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白：纖突蛋白（S）、包膜蛋白（E）和核衣殼蛋白（N）[2-3]。PDCoV具有冠狀病毒的一般特性，S蛋白在病毒和宿主結(jié)合和產(chǎn)生中和抗體等方面起著重要的作用，是冠狀病毒主要的抗原蛋白和新型疫苗研究的首選蛋白[8]。N蛋白是冠狀病毒的核衣殼蛋白，在細(xì)胞因子產(chǎn)生方面發(fā)揮作用。根據(jù)S蛋白和N蛋白的進(jìn)化樹分析可知，本次擴(kuò)增的基因之間同源性較高，單獨(dú)成一支，且與我國大陸分離的CH/Sichuan/S27/2012毒株和我國臺灣、美國近些年分離的毒株位于同一分支。與近些年中國分離的其他毒株不在一個(gè)分支，這些結(jié)果表明河南地區(qū)PDCoV發(fā)生了一定的變異。

PDCoV與另外2個(gè)豬冠狀病毒PEDV[9]和TGEV一樣，均能引起豬腸道疾病。研究表明，PDCoV感染仔豬后，能夠引起仔豬嚴(yán)重腹瀉、嘔吐、脫水和明顯的腸道病變，致死率高達(dá)40%[10]。與PEDV不同的是，PDCoV不僅感染腸道，還能夠感染肺臟、腎臟和肝臟等多個(gè)器官，并引起相應(yīng)器官不同程度的病變，說明豬PDCoV比PEDV有更高的組織嗜性，并且，PDCoV和PEDV之間沒有交叉免疫反應(yīng)。因此，研制有效的疫苗用于該病的防控是急需解決的問題。目前還沒有針對PDCoV的商品化疫苗與診斷試劑。隨著研究的深入，相信不久的將來，會(huì)有效果很好的PDCoV疫苗和診斷試劑用于控制該病的發(fā)生與流行。

參考文獻(xiàn)：

[1]Woo P C Y，Lau S K P，Lam C S F，et al. Discovery of seven novel mammalian and avian coronaviruses in the genus Deltacoronavirus supports bat coronaviruses as the gene source of Alphacoronavirus and Betacoronavirusand avian coronaviruses as the gene source of Gammacoronavirus and Deltacoronavirus[J]. J Virol，2012，86（7）：3995-4008.

[2]Douglas M，Yin J，Jim C，et al. Complete genome sequence of strain SDCV/USA/Illinois121/2014，a porcine Deltacoronavirus from the United States[J]. Genome Announcements，2014，2（2）：e00214-e00218.

[3]Li G W，Qi C，Harmon K M. Full-length genome sequence of porcine Deltacoronavirus strain USA/IA/2014/8734[J]. Genome Announcements，2014，2（2）：e00214-e00278.

[4]Ma Y M，Zhang Y，Liang X E，et al. Origin，evolution，and virulence of porcine Deltacoronaviruses in the United States[J]. mBio，2015，6（2）：e00015-e00064.

[5]Lee S，Lee C. Complete genome characterization of korean porcine Deltacoronavirus strain KOR/KNU14-04/2014[J]. Genome Announcements，2014，2（6）：e01114-e01191.

[6]Song D，Zhou X，Peng Q，et al. Newly emerged porcine Deltacoronavirus associated with diarrhoea in swine in China：identification，prevalence and full-length genome sequence analysis[J]. Transboundary and Emerging Diseases，2015，62（6）：575-580.

[7]Ujike M，Taguchi F. Incorporation of spike and membrane gltcoprotens into coronavirus virions[J]. Viruses，2015，7（4）：1700-1725.

[8]Dong N，F(xiàn)ang L R，Zeng S L，et al. Porcine Deltacoronavirus in mainland China[J]. Emerging Infectious Diseases，2015，21（12）：2254-2255.

[9]俞正玉，逢鳳嬌，孫 冰，等. 豬流行性腹瀉病毒變異株RT-PCR檢測方法的建立[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，46（1）：116-118.

[10]Chen Q，Gauger P，Stafne M，et al. Pathogenicity and pathogenesis of a United States porcine Deltacoronavirus cell culture isolate in 5-day-old[J]. Virology，2015，482：51-59.