王倩倩 張麗輝 趙驥民

摘要：由鹽生植物根際土中分離得到含ACC脫氨酶的PGPR（植物根際促生菌）嗜麥寡養(yǎng)食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia），研究其在中性鹽與堿性鹽條件下對高粱種子萌發(fā)的促生效應。結果表明，從30、60、90、120 mmol/L的鹽堿脅迫處理條件下，PGPR處理對高粱種子在各項萌發(fā)參數上均有顯著促生效果。其中接菌的高粱種子的胚芽、胚根比未接菌的要長，長勢更好;接菌的比不接菌的根冠比高，說明促生菌在一定程度上促進了植株根部的營養(yǎng)吸收。據此可推測，含ACC脫氨酶的植物促生菌可緩解混合鹽脅迫（中性鹽與堿性鹽）對高粱植株的抑制作用，提高高粱抗鹽性，從而促進高粱種子的萌發(fā)力。

關鍵詞：植物促生菌;中性鹽脅迫;堿性鹽脅迫;高粱種子萌發(fā);促生效應

中圖分類號： S514.01;Q945.78 ?文獻標志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）13-0091-04

現如今，由于全球氣候變化，人口不斷增長，工業(yè)化急劇發(fā)展，環(huán)境污染逐漸升級等各種因素的影響，導致了土壤鹽堿化程度日益加重。在我國，東北地區(qū)的松嫩平原鹽堿化土地面積達373.3萬hm2，而且土壤鹽分組成非常復雜，既含有NaHCO3、Na2CO3等堿性鹽，又含有NaCl、Na2SO4等中性鹽[1]。目前國內外主要集中在NaCl對植物毒害的研究，很少有研究不同鹽類混合而引起的混合鹽脅迫對植物生長的傷害[2]。

植物促生菌（plant growth promoting rhizobacteria，PGPR）是一類能夠促進植物生長、防治病害、增加作物產量的微生物[3-4]。PGPR對土壤中有害病原微生物與非寄生性根際有害微生物（deleterious rizosphere microorganisms，簡稱DRMO）都有一定的生防作用，而且對植物吸收利用礦物質營養(yǎng)也有促進作用，并可以產生有益植物生長的代謝產物，從而促進植物的生長發(fā)育[5-6]。近年來已有很多學者研究表明，植物生長促生菌可以間接通過產生抗生素和分泌鐵載體等方式抑制或減輕植物病害對植物產生的不良影響，還能通過解磷、固氮、產生植物激素、酶解降低乙烯水平等方式直接刺激和調節(jié)植物生長[7-8]。許多植物根際促生菌可以產生吲哚乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）、維生素（antibiotic）等，以及利用并降解植物產生的乙烯合成前體1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸（1-aminocyclopropane-1-carboxylate，ACC）），使ACC分解成A-丁酮酸和氨，從而降低了逆境條件下植物體內產生大量的乙烯，促進植物的生長發(fā)育[9-10]。所以植物生長促生菌，特別是含ACC脫氨酶的植物促生菌備受各界關注，尤其被認為在逆境條件下能有效促進植物生長。

如今，國內外已有越來越多的專家學者從事植物促生菌的研究，大量實踐證明通過接種含ACC脫氨酶的植物生長促生菌，能夠大大提高植物的抗逆性[11-13]。含ACC脫氨酶的PGPR的主要作用機制是通過降低逆境乙烯的濃度，促進植物根的伸長，提高植物的抗逆性。故本研究參考Penrose等的研究，采取定向富集分離方法，并只挑取占競爭優(yōu)勢的菌落，篩選出含ACC脫氨酶的PGPR。又根據東北地區(qū)的現狀，采用高粱這種耐鹽植物作為研究對象，再通過種子萌發(fā)試驗來決速評價PGPR的促生性能，得出PGPR對不同鹽堿濃度下高粱的萌發(fā)期表現出來的一系列積極影響。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：以ACC為唯一氮源，從生長于高pH鹽堿脅迫下的白城地區(qū)燕麥根際土中自行篩選分離得到的PGPR菌株。經16S rDNA序列分析，初步確定此種促生菌為嗜麥寡養(yǎng)食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）。

供試植物：高粱吉雜83，由吉林省農業(yè)科學院作物育種研究所1993年以不育系“352A”為母本，恢復系“116-2-5”為父本雜交育成。1999年經吉林省農作物品種審定委員會審定通過。屬中早熟品種，出苗至成熟118 d左右，需≥10 ℃積溫2 400～2 500 ℃?？购?、抗倒、耐密植，抗葉病，抗蚜蟲，高抗絲黑穗病。適宜在吉林省的長春、松原、白城地區(qū)及熬雜1號的栽培區(qū)種植。

培養(yǎng)基：TSB、DF等培養(yǎng)液按文獻[14]配方配制。

1.2 材料處理

種子消毒：將吉雜83高粱種子用自來水清洗3遍，在 0.1% HgCl2中消毒3 min，之后用無菌水洗滌5次。

菌懸液制備：供試菌株在TSB培養(yǎng)液中室溫（21±1） ℃過夜振蕩培養(yǎng)，4 ℃離心收集，菌體細胞用無菌0.03 mol/L MgSO4溶液洗滌，重新懸浮于無菌0.03 mol/L MgSO4溶液制成菌懸液（D600 nm=0.5±0.02）浸種用。

1.3 方法

室溫下將消過毒的高粱種子分為2份。一份浸于 0.03 mol/L MgSO4菌懸液（D600 nm=0.5±0.02），一份浸于無菌0.03 mol/L MgSO4溶液中1 h后，放于標記好的培養(yǎng)皿中。

利用2種中性鹽氯化鈉和硫酸鈉（物質的量之比9 ∶ 1）模擬鹽脅迫，利用2種堿性鹽碳酸氫鈉和碳酸鈉（物質的量之比9 ∶ 1）模擬堿脅迫，每種脅迫設置4個梯度，每個梯度5次重復，每個重復50粒高梁種子放在3層濾紙的培養(yǎng)皿中。鹽堿脅迫設置的4個濃度梯度為30、60、90、120 mmol/L。將培養(yǎng)皿置于光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件為溫度25 ℃/15 ℃，光照14 h/d。每天記錄正常發(fā)芽的種子個數以計算發(fā)芽率和發(fā)芽速率，以胚根露出種皮作為發(fā)芽標準。連續(xù)3 d發(fā)芽數不再變化，用刻度尺測量胚根和胚芽長度將未萌發(fā)的種子轉移到蒸餾水中，進行復萌試驗，每天記錄發(fā)芽數。試驗結束計算相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽指數、相對發(fā)芽活力指數、相對生長指標。

在發(fā)芽試驗的最后一天統計發(fā)芽個數，每皿隨機測量10個幼苗的胚芽長和胚根長，精確到0.01 cm。

2 結果與分析

2.1 含ACC脫氨酶的PGPR對中性鹽脅迫下高粱種子萌發(fā)的影響

2.1.1 含ACC脫氨酶的PGPR對中性鹽脅迫下高粱種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢與集中度的影響 由圖1可以看出，隨著中性鹽脅迫濃度的升高，高粱種子的發(fā)芽情況呈逐漸降低趨勢。但同一濃度梯度鹽脅迫下，接菌的高粱種子的相對發(fā)芽率、發(fā)芽勢、集中度都比未接菌的對照有顯著提高（P<0.05）。在鹽濃度達到120 mmol/L的時候，未接菌發(fā)芽率為67.33%，發(fā)芽勢為67.33%，集中度為60.67%，而接菌后高粱種子要高于未接菌的指標，發(fā)芽率為73.33%，發(fā)芽勢73.33%，集中度70.00%。并且由7 d后高粱發(fā)芽照片也可以看出接菌的高粱種子的胚芽、胚根比未接菌的要長，長勢更好。據此可推測，含ACC脫氨酶的PGPR可一定程度上提高高粱種子的萌發(fā)率。

2.1.2 含ACC脫氨酶的PGPR對中性鹽脅迫下高粱種子萌發(fā)指數與活力指數的影響 種子的發(fā)芽指數和活力指數可以比發(fā)芽率、發(fā)芽勢更靈敏地表現出種子活力，可以比較全面地

反映植物種子與環(huán)境的作用結果，發(fā)芽指數和活力指數越高，說明發(fā)芽所用時間越短，長勢越好。如圖2可見，在鹽濃度逐漸上升的情況下，種子的發(fā)芽指數與活力指數都呈遞減，且除鹽脅迫30 mmol/L濃度外接菌處理后的高粱種子都要顯著高于對照的萌發(fā)指數和活力指數（P<0.05）。在鹽脅迫60、90、120 mmol/L時，接種PGPR的萌發(fā)指數比不接菌顯著高 5.39%（P<0.01）、3.11%（P<0.05）、3.61%（P<0.01）;接菌的活力指數比不接菌分別高了40.56%（P<0.01）、5.55%（P<0.05）、18.37%（P<0.01）。從以上數據可推測含ACC脫氨酶的PGPR在一定程度上提高了高粱種子的發(fā)芽指數和活力指數，與最終發(fā)芽率觀察結果相吻合。

2.1.2 含ACC脫氨酶的PGPR對中性鹽脅迫下高粱種子根冠比與相對鹽害率的影響 相對鹽害率是表明植株受到鹽堿脅迫的程度。如圖3可見，中性鹽脅迫對高粱種子的萌發(fā)有明顯的抑制作用，接菌后的高粱種子比對照對高粱傷害小的多（P<0.05）。根冠比是反映幼苗生長狀況的一項指標，一般生長健壯的幼苗有較高的根冠比。中性鹽處理的高粱種子接菌的比不接菌的根冠比高，說明促生菌在一定程度上促進了植株根部的營養(yǎng)吸收。

2.2 含ACC脫氨酶的PGPR對堿性鹽脅迫下高粱種子萌發(fā)的影響

2.2.1 含ACC脫氨酶的PGPR對堿性鹽脅迫下高粱種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢與集中度的影響 由圖4可見，從30～120 mmol/L 的堿脅迫濃度條件下，高粱種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、集中度整體要低于鹽脅迫，且接菌的要整體稍高于未接菌的。在試驗最高濃度堿脅迫處理（120 mmol/L）尤其明顯，未接菌的發(fā)芽率為73.33%、發(fā)芽勢為66.00%、集中度為57.33%，而接菌處理后的發(fā)芽率為82.00%、發(fā)芽勢為70.67%、集中度為63.33%。同濃度堿脅迫接菌可以在很小程度上促進高粱的萌發(fā)，因此說明，堿脅迫對高粱的萌發(fā)傷害作用要高于鹽脅迫的影響，盡管隨著混合鹽堿的濃度升高，延緩了發(fā)芽時間，但最終發(fā)芽率仍維持較高的水平，這一結果說明高粱是一種優(yōu)質的作物。

2.2.2 含ACC脫氨酶的PGPR對堿性鹽脅迫下高粱種子萌發(fā)指數與活力指數的影響 由圖5看出，堿性鹽脅迫處理高粱種子均引起種子萌發(fā)指數和活力指數降低，而且隨著堿脅迫濃度的增加，抑制作用逐漸增強。在低堿濃度下 30 mmol/L 接菌和不接菌處理高粱種子的萌發(fā)指數和活力指數均不明顯，在濃度60～120 mmol/L，對高粱種子萌發(fā)的抑制作用明顯增大，當濃度為120 mmol/L時，接菌處理的高粱種子比對照的萌發(fā)指數和活力指數分別提高了3.74百分點和16.19百分點。由此看出，接菌處理后的高粱種子可緩解堿脅迫對其的傷害作用，萌發(fā)指數和活力指數都有顯著提高。

2.2.3 含ACC脫氨酶的PGPR對堿性鹽脅迫下高粱種子根冠比與相對鹽害率的影響 隨著堿脅迫濃度的升高，高粱所受的毒害亦隨之增強，高粱種子的相對鹽害率隨之升高，同時

其根冠比由于抑制增強而降低（圖6）。當處于低堿脅迫時（30 mmol/L）接菌處理和對照高粱的根冠比無顯著性差異，隨著堿濃度的上升，尤其在120 mmol/L時，接菌處理的高粱植株根冠比比對照提高了7.22百分點，且接菌處理后的相對鹽害率比對照降低了8.67百分點。從以上試驗結果得出，含ACC脫氨酶的植物促生菌可緩解堿性鹽對高粱植株的抑制作用，提高高粱抗鹽性，從而促進高粱種子的萌發(fā)力。

3 討論

以ACC為唯一氮源，從白城地區(qū)鹽生植物根際土自行篩選出的菌株，經過16S rDNA序列分析，鑒定得出為一種嗜麥寡養(yǎng)食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）。經無菌育種萌發(fā)試驗研究表明，含ACC脫氨酶的PGPR均能不同程度地顯著緩解中性鹽和堿性鹽脅迫對高粱種子的影響，促進植物生長;在無鹽脅迫情況下，對高粱種子生長無顯著促進作用。從30～120 mmol/L的堿性鹽脅迫處理條件下，高粱種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、集中度整體要低于中性鹽脅迫，且接菌的要整體稍高于未接菌的指標。在鹽濃度逐漸上升的情況下，種子的發(fā)芽指數與活力指數都呈遞減趨勢，且除鹽脅迫 30 mmol/L 濃度外接菌處理后的高粱種子都要明顯高于對照的萌發(fā)指數和活力指數（P<0.05）。隨著脅迫濃度的升高，堿性鹽比中性鹽對高粱的毒害更強，相對鹽害率更高，PGPR處理的高粱種子比沒有處理的根冠比高，說明促生菌在一定程度上促進了植株根部的營養(yǎng)吸收。從以上試驗結果得出，含ACC脫氨酶的SM菌株可緩解中性鹽和堿性鹽對高粱植株的抑制作用，提高高粱抗鹽性，從而促進高粱種子的萌發(fā)力。

總之，通過人工模擬試驗在混合性復雜鹽堿脅迫下，含ACC脫氨酶的S. maltophilia菌株浸種高粱后可以在一定程度上促進高粱植株根長、芽長等途徑使植株獲得更多養(yǎng)料，以改善植株生長狀況、改善植物所處的不良環(huán)境。但本試驗未全面考慮植物促生菌在不同植物根際的定殖能力和利用生物修復土壤的有機結合，還需進一步在野外進行苗期的研究。

參考文獻：

[1]劉興土，何 巖，鄧 偉，等. 東北區(qū)域農業(yè)綜合發(fā)展研究[M]. 北京：科學出版社，2002：352-353.

[2]金 虎，王宏富，王玉國，等. 種子引發(fā)對高粱幼苗耐鹽性的生理效應[J]. 中國農業(yè)科學，2009，42（10）：3713-3719.

[3]Lee S W，Lee S H，Kotnala B，et al. Growth promotion and induced disease suppression of four vegetable crops by a selected plant growth-promoting rhizobacteria （PGPR） strain Bacillus subtilis 21-1 under two different soil conditions[J]. Acta Physiologiae Plantarum，2014，36（6）：1353-1362.

[4]Yao T. Research progress of plant growth promoting rhizobacteria[J]. Grassland and Turf，2002，4（2）：3-5.

[5]Rong L Y，Tao T，Feng J，et al. Effect of partly replacing chemical fertilizer by PGPR biofertilizer on pea growth[J]. Grassland and Turf，2014，34（1）：7-12.

[6]Chen L，Yao T，Chai Q，et al. Effect of chemical fertilizer partly replaced by microbial fertilizer on maize growth and quality[J]. Grassland and Turf，2016，36（1）：20-25.

[7]胡江春，薛德林，馬成新，等. 植物根際促生菌（PGPR）的研究與應用前景[J]. 應用生態(tài)學報，2004，15（10）：1963-1966.

[8]馬劍敏，李 今，張改娜，等. Hg2+與POD復合處理對小麥萌發(fā)及幼苗生長的影響[J]. 植物學通報，2004（5）：531-538.

[9]馬驄毓，張 英，馬文彬，等. 黃芪根際促生菌（PGPR）篩選與特性研究[J]. 草業(yè)學報，2017，26（1）：149-159.

[10]張 蕾，徐慧敏，朱寶利. 根際微生物與植物再植病的發(fā)生發(fā)展關系[J]. 微生物學報，2016，56（8）：1234-1241.

[11]Dell Amico E，Cavalca L，Andreoni V. Improvement of Brassica napus growth under cadmium stress by cadmium-resistant rhizobacteria[J]. Soil Biology and Biochemistry，2008，40（1）：74-84.

[12]Glick B R，Cheng Z Y，Czarny J，et al. Promotion of plant growth by ACC deaminase-producing soil bacteria[J]. European Journal of Plant Pathology，2007，119（3）：329-339.

[13]賈鳳安，甄麗莎，常 帆，等. 黃土高原新造耕地1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸脫氨酶（ACCD）活性菌株的篩選及其功能特性[J]. 江蘇農業(yè)科學，2017，45（19）：289-294.

[14]Penrose D M，Glick B R. Methods for isolating and characterizing ACC deaminase-containing plant growth-promoting rhizobacteria[J]. Physiologia Plantarum，2003，118（1）：10-15.