葛文雪，陳潤，白嘉誠，狄玉昌，張雪蓮

復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院遺傳工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200433

結(jié)核病仍然是威脅人類健康的重大疾病，世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO) 2018年數(shù)據(jù)顯示，2017年度全球共有 1 010 萬新發(fā)病例及160萬死亡病例[1]。結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,M.tuberculosis)是結(jié)核病的病原菌，其感染致病機(jī)制復(fù)雜，是該領(lǐng)域研究的難點(diǎn)[2]。近年來有研究表明, 結(jié)核分枝桿菌結(jié)構(gòu)域蛋白的乙酰化修飾可能與其毒力和潛伏感染相關(guān)[3-4]。Nε-Lys乙?；堑鞍追g后修飾的一種方式，對細(xì)菌的生長和代謝具有重要作用[5]。從結(jié)核分枝桿菌基因組信息分析得知結(jié)核分枝桿菌中有20余種具Gcn5 N-acetyltransferase(GNAT)結(jié)構(gòu) 域的蛋白，硫醇乙?；D(zhuǎn)移酶(mycothiol acetyltransferase, MshD)是其中一個較重要的酶。該酶參與催化硫醇合成的最后一步反應(yīng)，將乙酰CoA的乙酰基轉(zhuǎn)移至硫醇前體，進(jìn)而形成完整的硫醇。硫醇是結(jié)核分枝桿菌中主要的低相對分子質(zhì)量醇，對維持細(xì)菌內(nèi)的氧化還原穩(wěn)態(tài)起重要作用[6-7]。

本實(shí)驗(yàn)以無毒的H37Ra菌株作為研究對象，根據(jù)同源重組原理，利用噬菌體侵染技術(shù)[8-9]構(gòu)建mshD基因敲除株，并對其生物學(xué)特性進(jìn)行分析，以期為后續(xù)深入開展該基因的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 引物設(shè)計與合成根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)中結(jié)核分枝桿菌減毒株H37Ra的基因位置及序列分別設(shè)計mshD基因及其同源臂的引物，詳見表1。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 試驗(yàn)用PCR引物

Tab.1 PCR primer sequences used in this study

PrimeSequence(5′→3′)Ampliconsize/bpNotemshDLSTTTTTTTTCCATAAATTGGAACTGGGAGACGCCTTTCCC850Van91ⅠmshDLATTTTTTTTCCATTTCTTGGCTGCGCTGCTCGTCGGCGGTVan91ⅠmshDRSTTTTTTTTCCATAGATTGGACCACCTACAGCGTCGATAC850Van91ⅠmshDRATTTTTTTTCCATCTTTTGGATGTAGTCCTCGGTGGCCTTVan91ⅠmshDFATAGAATTCGTGACGGCGCTTGACTGGCG948EcoRⅠmshDRTATAAGCTTTCAGTTATCCGTGCCAGCCAGCGHindⅢ

1.1.2 菌株、試劑大腸埃希菌DH5α、結(jié)核分枝桿菌減毒株H37Ra、恥垢分枝桿菌mc2155、pMV361質(zhì)粒均為本實(shí)驗(yàn)保存；大腸埃希菌TOP10、HB101菌株，p0004S、phAE159質(zhì)粒均由美國W. R. Jacobs實(shí)驗(yàn)室提供；prime STAR DNA polymerase、Van91Ⅰ 限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、PacⅠ 限制性內(nèi)切酶、CIP堿性去磷酸化酶均購自美國New England Biolabs公司；plasmid DNA extract kit 、DNA gel extraction kit購自美國Axygen公司；噬菌體包裝試劑盒MaxPlax lambda packaging extract 購自美國Epicentre生物技術(shù)公司；hygromycin、ampicillin、kanamycin購自德國Sigma公司；RT-qPCR所用試劑購自日本Takara公司；MP 緩沖液﹝包含25 mL 1 mol/L Tris-HCl (pH 7.4)、5 mL 1 mol/L MgSO4、1 mL 1 mol/L CaCl2、15 mL 5 mol/L NaCl﹞購自上海生工生物工程有限公司；OADC(100 mL)包括5 g bovine albumin fraction V(上海艾研生物科技有限公司)、0.03 g catalase(德國Sigma公司)、2 g glucose、0.85 g NaCl、12 μL oleic acid(上海生工生物工程有限公司)。

1.1.3 儀器宏觀變倍體式顯微鏡(型號：Stereo Discovery. V20)購自德國卡爾蔡司公司。

1.2 敲除株與回補(bǔ)株的構(gòu)建

1.2.1mshD基因敲除株的構(gòu)建[10]用mshDLS mshDLA、mshDRS mshDRA兩對引物分別擴(kuò)增mshD基因上下游各800 bp的同源臂序列，限制性內(nèi)切酶Van91Ⅰ 酶切同源臂及p0004S質(zhì)粒，連接酶切產(chǎn)物并將重組質(zhì)粒通過熱激法轉(zhuǎn)入大腸埃希菌TOP10感受態(tài)，挑取單菌落過夜培養(yǎng)并抽取質(zhì)粒，將質(zhì)粒送至上海生工生物工程有限公司測序驗(yàn)證。將成功構(gòu)建的mshD-p0004S質(zhì)粒連接至分枝桿菌類穿梭質(zhì)粒phAE159，使用限制性內(nèi)切酶PacⅠ及噬菌體包裝試劑盒完成穿梭質(zhì)粒mshD-phAE159的構(gòu)建。將穿梭質(zhì)粒mshD-phAE159通過電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入恥垢分枝桿菌感受態(tài)，待長出噬菌斑后，收集噬菌斑，置于MP 緩沖液中，4 ℃放置過夜。吸取100 μL噬菌體、300 μL新鮮培養(yǎng)的恥垢分枝桿菌與溫?zé)岬? mL Top Agar，混勻，平鋪在LB固體培養(yǎng)基上，于30 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)3 d后，將上層培養(yǎng)基收集到適量MP 緩沖液中，4 ℃放置過夜。重復(fù)上述擴(kuò)增步驟，直至噬菌體滴度達(dá)到1010PFU/mL及敲除菌株與噬菌體濃度比例達(dá)到1∶10以上。高滴度噬菌體與H37Ra感受態(tài)于37 ℃孵育3～4 h后，再加入10 mL 7H9 OADC培養(yǎng)基復(fù)蘇16～24 h，離心收集菌體并涂布于7H10 OADC固體培養(yǎng)基(75 μg/mL hyg)，37 ℃培養(yǎng)4～6周。挑取單菌落，置于5 mL 7H9 OADC液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)20 d，抽取菌體基因組并以基因組為模板PCR擴(kuò)增目的基因。引物：mshDLS、mshDRA(表1)；程序： 98 ℃ 3 min；98 ℃ 10 s，64 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，29個循環(huán)。PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測序。

1.2.2mshD基因回補(bǔ)株的構(gòu)建使用引物mshDF、mshDR(表1)對H37Ra基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得mshD基因，用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和Hind Ⅲ同時酶切mshD基因片段及pMV361質(zhì)粒。連接酶切產(chǎn)物，并將重組質(zhì)粒通過熱激法轉(zhuǎn)入大腸埃希菌DH5α感受態(tài)，涂布于LB固體培養(yǎng)基(50 μg/mL Kana)，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜。挑取單菌落，置于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min過夜培養(yǎng)并抽取質(zhì)粒，質(zhì)粒送至上海生工生物工程有限公司測序驗(yàn)證。將構(gòu)建成功的mshD-pMV361質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入H37RamshD基因敲除株感受態(tài)，待長出單菌落后，挑取并置5 mL 7H9 OADC液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)20 d。最后收集菌體，抽取其基因組，并以基因組為模板PCR擴(kuò)增目的基因。引物：mshDF、mshDR(表1)；程序：98 ℃ 3 min；98 ℃ 10 s，64 ℃ 15 s，72 ℃ 1 min，29個循環(huán)。PCR產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司測序，同時以野生株基因組為模板做對照。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄水平驗(yàn)證分別收集對數(shù)期野生株、敲除株、回補(bǔ)株菌液各10 mL，并對其進(jìn)行RNA抽提及RT-qPCR驗(yàn)證。RT-qPCR反應(yīng)條件：10 μL 2×T5 Fast qPCR Mix，0.8 μL 10 μmol/L Primer-F，0.8 μL 10 μmol/L Primer-R，1 μL cDNA，0.2 μL 50×ROX Reference DyeⅠ，ddH2O補(bǔ)齊至20 μL。程序：95 ℃ 1 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 5 s，72 ℃ 15 s，40個循環(huán)。

1.3 敲除株生物學(xué)特性鑒定

1.3.1 菌落形態(tài)觀察分別收集WT、KO、COM對數(shù)期菌液各5 mL，低頻水浴超聲，參數(shù)：超聲15 s，停止15 s，8個循環(huán)；靜置20 min，轉(zhuǎn)移上清液至新的無菌離心管，制備菌懸液。用7H9 OADC培養(yǎng)基調(diào)整菌懸液濃度至OD600為0.3，并將菌液進(jìn)行10倍梯度稀釋至菌濃度為10-4。取100 μL稀釋后的菌液涂布于7H10 OADC培養(yǎng)基，封口膜封口，37 ℃ 倒置培養(yǎng)4～6周。使用宏觀變倍體式顯微鏡觀察菌落形態(tài)。

1.3.2 生物膜形成觀察制備菌懸液，4 000 r/min離心收集菌體，用Sauton培養(yǎng)基調(diào)整菌濃度至OD600為0.3，稀釋30倍，于24孔板中分別加入1.3 mL稀釋后的菌液，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個復(fù)孔。最后用封口膜封口，錫箔紙包裹， 37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)4～6周。宏觀變倍體式顯微鏡下觀察生物膜的形成。

1.3.3 生長曲線測定制備菌懸液，4 000 r/min離心收集菌體，用PBS分別調(diào)整WT、KO、COM菌濃度至OD600為0.6，按1∶50比例轉(zhuǎn)接入7H9 OADC培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。每隔1 d定點(diǎn)取樣，測定OD600的值，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個復(fù)孔。

1.3.4 敲除株與野生株抗脅迫能力檢測制備菌懸液，4 000 r/min離心收集菌體，用PBS調(diào)整菌濃度至OD600為0.2，用5 mmol/L H2O2、0.05% SDS在50 ℃熱激處理菌液1.5 h以及低氧處理5、10、15 d。低氧處理方式：用15 mL離心管，2/3裝液量，石蠟封口，于37 ℃靜置培養(yǎng)。將菌液進(jìn)行10倍梯度稀釋至菌濃度為10-3和10-2，取100 μL菌液涂布于7H10 OADC培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng) 4～6周。最后進(jìn)行菌落計數(shù)，計算存活率。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

上述實(shí)驗(yàn)均設(shè)置生物學(xué)及技術(shù)重復(fù)各3次。其中，菌體存活率為脅迫處理后的菌體CFU與未經(jīng)處理的菌體CFU的比值。

2 結(jié)果

2.1 構(gòu)建出mshD基因敲除株

以敲除株基因組為模板，用mshD基因左臂上游引物和mshD基因右臂下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到mshD基因長度為948 bp，左臂右臂序列長度均為800 bp，表明mshD基因已被敲除，此時mshD基因被sacB和hyg基因替換(圖1A)。以H37Ra基因組為模板，用左臂上游引物和右臂下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到 2 548 bp的序列片段，為同源臂序列長度與mshD基因序列長度的總和。以敲除株基因組為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到 5 200 bp的序列片段(圖1B)，為同源臂序列長度與sacB和hyg基因序列長度的總和。將PCR產(chǎn)物純化后送至上海生工生物工程有限公司測序，結(jié)果顯示目的基因大小與預(yù)測結(jié)果一致。

A: Homologous recombination schematic.mshDgene replaced bysacBandhyggenes. B: PCR electrophoresis identification. M: 12 000 bp marker; 1: genome of knockout strain, the annealing temperature is 62 ℃; 2: genome of knockout strain, the annealing temperature is 64 ℃; 3: genome of H37Ra, the annealing temperature is 62 ℃; 4: genome of H37Ra, the annealing temperature is 64 ℃.

圖1mshD基因敲除株基因組PCR驗(yàn)證電泳圖

Fig.1 PCR identification of themshDgene knockout strain

2.2 構(gòu)建出mshD基因回補(bǔ)株

以回補(bǔ)株基因組為模板，用mshD基因上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時以野生株基因組為模板做對照。結(jié)果得到948 bp的基因片段，與對照結(jié)果一致(圖2)。說明目的基因定點(diǎn)整合到H37Ra基因組上，mshD基因回補(bǔ)株構(gòu)建成功。

M: 10000 bp DNA marker; 1: genome of H37Ra; 2: genome of the knockout strain; 3: genome of the complemented strain.

圖2 H37Ra野生株、mshD基因敲除株及回補(bǔ)株P(guān)CR驗(yàn)證電泳圖

Fig.2 PCR identification of H37Ra,mshDgene knockout strain and complemented strain

2.3 敲除株mshD基因的轉(zhuǎn)錄水平為零

RT-QPCR驗(yàn)證結(jié)果顯示(圖3)，敲除株中mshD基因的轉(zhuǎn)錄水平為零，至此說明mshD基因敲除成功；由于本實(shí)驗(yàn)的pMV361質(zhì)粒上攜帶Hsp60強(qiáng)啟動子，結(jié)果致使回補(bǔ)株中mshD基因的轉(zhuǎn)錄水平近似為野生株的4倍。

圖3 H37Ra野生株、mshD基因敲除株及回補(bǔ)株轉(zhuǎn)錄水平驗(yàn)證

Fig.3 Verification of H37Ra,mshDgene knockout strain and complemented strain at the transcription level

2.4 敲除株菌落偏小

與野生株相比，敲除株菌落褶皺減少，且菌落偏??；回補(bǔ)株菌落扁平，呈白色，無明顯褶皺。野生株和回補(bǔ)株在培養(yǎng)4周時已形成菌落，而敲除株直至6周時才形成大小適宜的菌落(圖4)。

2.5 敲除株生物膜形成較慢

將生物膜置于宏觀變倍體式顯微鏡下觀察(圖5)，結(jié)果顯示4周時，敲除株生物膜并沒有完全形成，而野生株和回補(bǔ)株生物膜已形成，且褶皺明顯；6周時，敲除株生物膜已形成，但膜的厚度<野生株和回補(bǔ)株，且褶皺較少。

圖4 H37Ra野生株、mshD基因敲除株及回補(bǔ)株菌落形態(tài)

Fig.4 Colony morphology of H37Ra,mshDgene knockout strain and complemented strain

圖5 H37Ra野生株、mshD基因敲除株及回補(bǔ)株生物膜

Fig.5 Biofilm formation of H37Ra,mshDgene knockout strain and complemented strain

2.6 敲除株生長速率減緩

從生長曲線的結(jié)果可以看出，mshD基因敲除株的生長曲線始終低于野生株和回補(bǔ)株，而回補(bǔ)株的生長曲線和野生株基本保持一致(圖6)。綜合上述結(jié)果，認(rèn)為此回補(bǔ)株具有一定的參考意義。同時也進(jìn)一步說明了mshD基因?qū)w生長具有重要作用，該基因的缺失明顯抑制了菌體生長。

2.7 敲除株抗脅迫能力下降

抗脅迫實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示(圖7)，在5 mmol/L H2O2和0.05%SDS作用下敲除株存活率略低于野生株和回補(bǔ)株，這種差異在低氧處理及50 ℃熱激作用下更加顯著。在低氧處理5 d時，野生株、敲除株、回補(bǔ)株生長均不受影響；低氧處理10 d時，野生株和回補(bǔ)株生長仍不受影響，但敲除株的存活率驟然下降至約3%；低氧處理15 d時，野生株和回補(bǔ)株的存活率下降至約50%，而敲除株的存活率下降至約2%。

圖6 H37Ra野生株、mshD基因敲除株及回補(bǔ)株生長曲線

Fig.6 Growth curves of H37Ra,mshDgene knockout strain and complemented strain

A: Analysis of antioxidant capacity of different strains. B: Analysis of anti-hypoxia ability of different strains. C: Analysis of anti-detergent ability of different strains. D: Analysis of heat resistance of different strains.**:P<0.01;***:P<0.001.

圖7 H37Ra野生株、mshD基因敲除株及回補(bǔ)株耐H2O2、低氧、SDS和熱激的能力

Fig.7 The ability of H37Ra,mshDgene knockout strain and complemented strain resistant to H2O2, hypoxia, SDS and heat shock

3 討論

硫醇是存在于分枝桿菌和其他多數(shù)放線菌中的小分子醇類，具有維持細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)和抗毒素作用[11]。在結(jié)核分枝桿菌中，硫醇的合成依次需要硫醇糖基轉(zhuǎn)移酶MshA、硫醇去乙?；窶shB、硫醇連接酶MshC、MshD的參與[12]。MshD參與催化硫醇合成的最后一步反應(yīng)，能將acetyl-coenzyme A (CoA) 的乙酰基團(tuán)轉(zhuǎn)移至硫醇前體Cys-GlcN-Ins，進(jìn)而形成完整的硫醇。Vetting等[13]解析了MshD蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該蛋白由2個結(jié)構(gòu)域組成，呈β1α1α2β2β3β4α3β5α4β6拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。Rawat等[14-15]探索了恥垢分枝桿菌中硫醇的合成途徑及MshD缺失對菌體的影響。Buchmeier等[12]對結(jié)核分枝桿菌Erdman株的研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)MshD缺失后，硫醇含量只有野生株含量的1%，硫醇前體的含量處于較高水平。此外有研究表明，MshD可能與結(jié)核病的快速診斷相關(guān)。目前大多數(shù)臨床診斷測試的靈敏度不高，特異性不強(qiáng)，且檢測周期較長[16]。近年來分子生物學(xué)診斷方法的出現(xiàn)為結(jié)核病的治療拓寬了思路，最新研究發(fā)現(xiàn)可通過對菌體抗原的檢測實(shí)現(xiàn)結(jié)核病的精準(zhǔn)診斷[17]。Zeitoun等[18]研究發(fā)現(xiàn)在大量結(jié)核病患者的血清中均檢測出MshD蛋白，因此認(rèn)為MshD可作為一種潛在的新型生物標(biāo)志物用于活動性結(jié)核病的診斷。

結(jié)核分枝桿菌侵染宿主后，需應(yīng)對機(jī)體內(nèi)一系列的逆環(huán)境，其中包括巨噬細(xì)胞內(nèi)的低氧環(huán)境。結(jié)核分枝桿菌在胞外環(huán)境生存時也同樣會遇到壓力刺激，因此菌體的抗脅迫能力與其胞內(nèi)外的生存能力密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，mshD基因敲除株菌落形態(tài)及大小都發(fā)生了變化，生物膜形成能力也相對減弱，生長明顯變慢，抗脅迫能力下降。這說明在結(jié)核分枝桿菌中mshD基因?qū)w生長代謝具有重要的作用，可能原因是MshD的缺失導(dǎo)致硫醇合成受影響，進(jìn)而導(dǎo)致菌體生長及代謝的變化。由于本實(shí)驗(yàn)前期嘗試多次并未構(gòu)建成功攜帶自身啟動子的pMV361質(zhì)粒，故而選擇使用帶有Hsp60啟動子的pMV361質(zhì)粒。雖然回補(bǔ)株mshD基因的轉(zhuǎn)錄水平比野生株高近4倍，但仍然可為后期實(shí)驗(yàn)提供一定的參考價值。本研究結(jié)果為MshD作為新型生物標(biāo)志物用于診斷活動性結(jié)核病提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

結(jié)核分枝桿菌的乙?；揎棇w的生長和代謝具有重要作用，近年來研究表明乙酰化可能與結(jié)核分枝桿菌的毒力和潛伏感染相關(guān)?；蚪M分析表明，結(jié)核分枝桿菌硫醇乙?；窶shD屬于GNAT家族，而與GNAT家族其他蛋白不同，MshD包括兩個乙酰轉(zhuǎn)移酶的結(jié)構(gòu)域，且這兩個結(jié)構(gòu)域的C端序列高度同源。MshD作為乙?；竻⑴c了結(jié)核分枝桿菌硫醇的合成，但其是否會影響菌體蛋白的乙?；揎椉捌渌x通路活性還有待深入研究。在結(jié)核分枝桿菌中，硫醇的缺失導(dǎo)致菌體生長明顯被抑制，且硫醇對維持細(xì)菌內(nèi)的氧化還原穩(wěn)態(tài)起重要作用，作為可在細(xì)胞內(nèi)生存的結(jié)核分枝桿菌，硫醇對其應(yīng)對巨噬細(xì)胞內(nèi)不利微環(huán)境是否起重要調(diào)控作用，尚需進(jìn)一步探索。