諾如病毒的致病機(jī)制及診斷

周弘璐，譚明，汪萱怡,4

1. 復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院教育部、衛(wèi)健委、醫(yī)科院醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032； 2. 辛辛那提兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)中心傳染病室，辛辛那提，俄亥俄州，美國; 3. 辛辛那提大學(xué)醫(yī)學(xué)院兒科系，辛辛那提，俄亥俄州，美國; 4. 復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院，上海 201102

感染性腹瀉為國際上公認(rèn)的5歲以下兒童第2位死因[1]。隨著社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和衛(wèi)生條件及飲水設(shè)施的改善，細(xì)菌和寄生蟲感染得以控制，感染性腹瀉的病原逐漸以病毒為主。由于輪狀病毒(rotavirus,RV)疫苗的推廣，諾如病毒(norovirus, NoV)已取代RV成為病毒性急性胃腸炎的第一病原體，并因此越來越引起全球的關(guān)注[2]。NoV是引起全人群急性胃腸炎(acute gastroenteritis, AGE)流行和暴發(fā)的主要病原體，也是引起食源性疾病的最常見非細(xì)菌性病原體[3]。NoV主要以糞-口途徑傳播，平均潛伏期為12～48 h，典型癥狀包括嘔吐(≥50%的病例)、腹瀉、惡心、腹部絞痛、肌肉痛、低熱等，持續(xù)2～3 d，具有良好的自限性。但在<5歲兒童、>60歲老年人以及免疫功能缺陷患者中可引起嚴(yán)重的疾病，導(dǎo)致脫水、休克甚至死亡[4]。

1 NoV的病毒學(xué)特性

NoV屬于杯狀病毒科NoV屬，為單股正鏈的小RNA病毒，無包膜，直徑為27～40 nm，呈二十面體對稱球形?；蚪M全長約7.7 kb，包含3個開放讀碼框(open reading frame, ORF)ORF1、ORF2和ORF3[5]。ORF1編碼1個多聚蛋白，翻譯后裂解成為6種非結(jié)構(gòu)蛋白(non-structure protein，NS)，在病毒復(fù)制中起重要作用。ORF2和ORF3分別編碼主要結(jié)構(gòu)蛋白(major structural protein，VP1)和次要結(jié)構(gòu)蛋白(minor structural protein，VP2)。X線晶體結(jié)構(gòu)分析顯示，衣殼蛋白VP1包含兩大結(jié)構(gòu)域，分別是殼區(qū)(shell 或 S domain)和突起結(jié)構(gòu)域(protruding 或 P domain)，后者可進(jìn)一步分為提高病毒穩(wěn)定性的P1亞結(jié)構(gòu)域和高度可變的P2亞結(jié)構(gòu)域，P區(qū)和S區(qū)通過柔性的鉸鏈區(qū)連接，高變的P2區(qū)決定病毒的抗原性，但位于P2區(qū)的受體結(jié)合部位相對保守，與宿主受體結(jié)合，啟動感染。成熟的病毒顆粒包含180個VP1蛋白，組成90個二聚體，形成二十面體對稱結(jié)構(gòu)。早期依賴電鏡方法對病毒進(jìn)行描述區(qū)分，NoV在電鏡下顯示杯狀結(jié)構(gòu)(cup-like structure)，故稱杯狀病毒。最近研究表明，NoV和宿主受體結(jié)合后，杯狀病毒的次要衣殼蛋白VP2形成一穿透衣殼的特殊通道，幫助NoV釋放基因組RNA到宿主細(xì)胞[6]。

NoV宿主廣泛，可感染人類、嚙齒動物、貓科動物、犬科動物、海獅、豬、綿羊、牛、蝙蝠等。NoV具有高度的基因多態(tài)性，根據(jù)VP1蛋白序列及其編碼的序列不同，可將其分為7個基因組(GⅠ～Ⅶ)，其中GⅠ、GⅡ和GⅣ能感染人類并致病，所以又稱人源諾如病毒 (human norovirus, HuNoV)，至少包括30種以上的基因型，其中GⅡ.4是造成全球NoV暴發(fā)和流行的主要基因型[7]。但在2014―2015年冬季，日本和中國上海、北京、浙江、江蘇、廣東等東亞地區(qū)都相繼出現(xiàn)新型GⅡ.17，成為AGE暴發(fā)的主導(dǎo)毒株[8]。此外，2016年10―12月，中國NoV病例暴發(fā)數(shù)與前4年同期相比大幅增加，79%由重組株GⅡ.P16-GⅡ.2引起[9]。

2 感染及致病機(jī)制

HuNoV尚未能常規(guī)培養(yǎng)，而且缺乏有效的動物疾病模型，因此對HuNoV的感染及致病機(jī)制仍未十分了解。目前HuNoV感染及致病數(shù)據(jù)主要來源于志愿者攻毒試驗(yàn)，志愿者攻毒試驗(yàn)對HuNoV感染后發(fā)病機(jī)制的研究具有重要意義，但實(shí)踐中受許多因素的限制，如不能針對特定基因缺陷的個體，獲取感染時的組織樣本也頗受限制。因此，考慮到基因和環(huán)境因素的可操作性，動物感染模型多應(yīng)用于NoV與宿主間相互作用的研究，如無菌豬、無菌牛、黑猩猩、免疫缺陷小鼠等。其中應(yīng)用最廣泛的為鼠諾如病毒(murine norovirus, MuNoV)感染系統(tǒng)。

2.1 NoV的細(xì)胞嗜性

近年來，體內(nèi)、外研究顯示NoV對免疫細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞(enterocyte)具有感染性。在體外細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)中，MuNoV能感染巨噬細(xì)胞、樹突細(xì)胞和B細(xì)胞[10-11]；而HuNoV能低程度感染B細(xì)胞[12]，卻不能感染巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞[13]，可見HuNoV與MuNoV的細(xì)胞嗜性不盡相同。更加有趣的是，無論是HuNoV還是MuNoV，在B細(xì)胞中復(fù)制都不會造成明顯的細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect, CPE)，而在巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞中復(fù)制則會引起細(xì)胞裂解。與此發(fā)現(xiàn)相一致的是，MuNoV能在B細(xì)胞卻不能在巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞中持續(xù)感染[14]。這些現(xiàn)象令人頗為驚訝，因?yàn)橛邪さ牟《究梢酝ㄟ^出芽的方式從細(xì)胞內(nèi)釋放，而NoV作為無包膜的病毒理論上需裂解細(xì)胞才能釋放出后代病毒顆粒。

作為感染腸道、引起腹瀉的HuNoV，它們的靶細(xì)胞一直被認(rèn)為是腸上皮細(xì)胞，這些假設(shè)已在早期的人體攻毒實(shí)驗(yàn)和活組織檢查(biopsy)中[15]得到初步證實(shí)。與此類似，在HuNoV感染無菌牛和無菌豬的腸組織中，檢測到NoV陽性的腸上皮細(xì)胞[16-17]。此外，Ettayebi等[18]在體外干細(xì)胞來源的人類類腸細(xì)胞中成功復(fù)制HuNoV，進(jìn)一步證實(shí)腸上皮細(xì)胞是HuNoV的宿主細(xì)胞。最近，Wilen等[19]發(fā)現(xiàn)一種罕見的腸上皮細(xì)胞——叢細(xì)胞(tuft cell)，它能表達(dá)CD300If，是小鼠腸道MuNoV的靶細(xì)胞，且2型細(xì)胞因子通過誘導(dǎo)叢細(xì)胞增殖促進(jìn)MuNoV感染。需要指出的是，盡管NoV能感染腸上皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞，而且基于腸上皮細(xì)胞和免疫B細(xì)胞的HuNoV培養(yǎng)系統(tǒng)[12, 18]已被建立，但其培養(yǎng)條件苛刻、復(fù)雜且隨基因型變化，導(dǎo)致HuNoV復(fù)制效率低下，難以用于中和抗體檢測。所以NoV的體外培養(yǎng)仍是細(xì)胞嗜性研究中的一大挑戰(zhàn)。

病毒感染需要跨越腸上皮屏障，轉(zhuǎn)移至下層免疫細(xì)胞，進(jìn)而有效誘導(dǎo)免疫和炎癥反應(yīng)。在這個過程中，一種特化的腸上皮細(xì)胞——M細(xì)胞發(fā)揮了重要作用。M細(xì)胞位于腸腔的派爾集合(Peyer’s patches)淋巴結(jié)并散布在淋巴濾泡中，雖然其頂端表面缺乏微絨毛，也不分泌黏液，但能選擇性攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)抗原至下層免疫細(xì)胞[20]。很多病原體能利用M細(xì)胞跨越腸上皮屏障，如依賴CXCR4受體蛋白的嗜淋巴細(xì)胞(X4)可與M細(xì)胞上的CXCR4受體結(jié)合，穿過上皮細(xì)胞[21]。研究顯示，NoV也可利用M細(xì)胞穿過腸上皮屏障。首先，即使在沒有病毒復(fù)制和破壞腸上皮細(xì)胞完整性的情況下，M細(xì)胞也能介導(dǎo)HuNoV和MuNoV通過極化的單層腸上皮細(xì)胞，在頂部內(nèi)化，然后在基底部釋放，釋放的病毒仍能有效地感染基室內(nèi)潛在的免疫細(xì)胞[22]。M細(xì)胞表達(dá)的特異性表面蛋白受體如b1整合素和糖蛋白2可能有助于病毒顆粒的黏附而協(xié)助感染活動[23]。此外，Gonzalez-Hernandez等[22]發(fā)現(xiàn)在M細(xì)胞缺失的小鼠中，兩種不同的MuNoV毒株復(fù)制均減少，但僅為減少而不是完全消失，這表明存在額外的病毒攝取途徑，可穿過腸上皮屏障。無論如何，這些結(jié)果直接或間接地支持了NoV利用M細(xì)胞跨越屏障并感染免疫細(xì)胞的假說。

2.2 NoV受體或附著因子及個體易感染性

腸上皮表面的組織血型抗原(histo-blood group antigens，HBGA)被認(rèn)為是NoV的宿主受體或附著因子[24]，與HBGA的相互作用使得NoV得以附著宿主細(xì)胞，啟動病毒感染。HBGA是一類含巖藻糖的復(fù)合糖類，除了分布在紅細(xì)胞表面，還廣泛分布在呼吸道、泌尿生殖道和消化道黏膜細(xì)胞表面，也可以游離寡聚糖的形式存在于生物體液中，如唾液、腸液、乳汁和血液[25]。HBGA包括常見的H/A/B抗原(對應(yīng)O/A/B血型)，以及Lea、Leb、Lex、Ley抗原(對應(yīng)Lewis血型)。H/A/B抗原分別在HBGA前體的基礎(chǔ)上由對應(yīng)的糖基轉(zhuǎn)移酶(分別叫FUT2、A酶和B酶)催化形成，Lewis血型則由FUT3酶催化產(chǎn)生。不同HBGA表型的個體與NoV結(jié)合能力不同。有研究顯示，有些NoV，比如諾瓦克病毒GI.1，與H/A抗原的結(jié)合能力高于B抗原[26]；使得O表型的個體相對于B表型的個體更容易被諾瓦克病毒感染[27]。

FUT2基因編碼α(1,2)-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，該糖基轉(zhuǎn)移酶可在HBGA前體上加上一個α(1,2)-巖藻糖，使之成為ABO抗原的前體H抗原。具備FUT2基因和FUT2酶活性的個體，被稱為“分泌型”(secretor)；約有20%的個體因FUT2基因突變導(dǎo)致FUT2酶失活，從而不能表達(dá)ABO抗原，被稱為“非分泌型”(non-secretor)。在歐美國家，F(xiàn)UT2基因的428 (G→A)純合無義突變最常見，該突變導(dǎo)致無法合成H抗原，所以這些個體被稱為非分泌型；而在亞洲國家，F(xiàn)UT2基因的385 (A→T)錯義突變更普遍，突變后仍可表達(dá)低水平的H抗原，這些個體常被稱為“弱分泌型”[28]。

分泌型個體對大多數(shù)NoV，尤其是常見的 GⅡ.4 NoV易感，而非分泌型個體對大部分NoV耐受，所以NoV感染有基因型特異性，其中基因型GⅠ.1和GⅡ.4表現(xiàn)尤為顯著[29]。然而在分泌型個體中，也有部分抵抗NoV感染，說明HBGA基因遺傳的差異并不能完全解釋NoV的易感性，免疫記憶或其他一些未知的因素也可能對NoV感染提供保護(hù)作用。此外，研究顯示非分泌型個體也對特定基因型的NoV敏感[30-31]。比如，Shirato等發(fā)現(xiàn)GⅠ.2、GⅠ.3、GⅠ.4、GⅠ.8、GⅡ.4和GⅡ.7能夠與Lea抗原(非分泌型個體特有的血型抗原)結(jié)合；在瑞典GⅠ.3 NoV暴發(fā)調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，不同表型的個體之間發(fā)病情況沒有明顯差異，且GⅠ.3也能和Lea抗原結(jié)合[30]；分別由GⅡ.3和GⅡ.4引起的胃腸炎暴發(fā)事件中，都出現(xiàn)了非分泌型個體發(fā)病的情況。這些研究結(jié)果的差異也可能由于地區(qū)、種族、毒株變異等不同引起。因此，NoV的易感和耐受機(jī)制需要進(jìn)一步探索和驗(yàn)證，尤其是那些文獻(xiàn)中不曾記載的基因型。早期研究表明，HBGA結(jié)合位點(diǎn)在P區(qū)結(jié)構(gòu)域內(nèi)[32]，進(jìn)一步通過P區(qū)結(jié)構(gòu)域和HBGA寡聚糖共結(jié)晶及X-射線分析[33]顯示，HBGA結(jié)合位點(diǎn)位于NoV突出區(qū)結(jié)構(gòu)域的頂端(P2區(qū))，即病毒的最外端。該位點(diǎn)屬于構(gòu)象型結(jié)構(gòu)(conformational structure)，由數(shù)個不連續(xù)的氨基酸構(gòu)成。HBGA結(jié)合位點(diǎn)在GⅠ和GⅡ基因組(genogroup)內(nèi)各自保守?？傮w而言，它們大致可分為兩大區(qū)域，分別是中心部位的保守區(qū)和周圍的高變區(qū)[25, 34-35]。中心保守區(qū)為NoV感染宿主關(guān)鍵處，即為病毒存活所必須，而高變區(qū)對NoV進(jìn)化及擴(kuò)展易感人群具有重要意義。

2.3 腸道共生菌對NoV感染的影響

腸道共生菌在調(diào)節(jié)病毒感染方面也發(fā)揮了重要作用。Jones等[11]通過HuNoV感染B細(xì)胞系的體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，腸道共生菌表面表達(dá)的人類HBGA受體能夠促進(jìn)NoV感染B細(xì)胞。此外，腸道菌群可能通過抑制誘導(dǎo)IFN-λ信號，直接或間接促進(jìn)病毒復(fù)制[36]。而利用抗生素消耗小鼠腸道內(nèi)微生物群后發(fā)現(xiàn)，MuNoV的復(fù)制水平降低，從側(cè)面印證了腸道共生菌能夠促進(jìn)NoV感染[37]。相反，Lei等[38]通過HuNoV感染無菌豬的體內(nèi)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，腸道共生菌(E.cloacae)會抑制HuNoV感染，病毒顆粒脫落減少，腸道組織中的病毒滴度降低，且沒有在B細(xì)胞中觀察到HuNoV感染。與此類似，Lee等[39]利用RAW264.7細(xì)胞系體外驗(yàn)證了乳桿菌(Lactobacillus)抗MuNoV感染的作用。由此看來，腸道共生菌對于HuNoV或MuNoV感染的作用并沒有很好的一致性，可能受到體內(nèi)和體外試驗(yàn)條件、實(shí)驗(yàn)動物模型、感染細(xì)胞系種類等多種因素的潛在影響，這些問題有待將來的研究澄清。

2.4 NoV感染導(dǎo)致的病理學(xué)變化

在HuNoV攻毒試驗(yàn)中，給予志愿者諾瓦克病毒(Norwalk; GⅠ.1)或夏威夷病毒 (Hawaii; GⅡ.1)后取其近端小腸活檢標(biāo)本。鏡檢顯示，腸絨毛鈍化變寬，微絨毛縮短，線粒體變大，隱窩細(xì)胞增生，胞質(zhì)空泡形成，多核和單核細(xì)胞滲入固有層，表現(xiàn)出輕微的炎癥浸潤。雖然NoV感染志愿者顯現(xiàn)腸上皮細(xì)胞異常，但細(xì)胞和黏膜卻保持完整狀態(tài)[15, 40-41]， 胃底和胃竇內(nèi)未見組織學(xué)改變[42]。小腸刷狀緣酶活性(堿性磷酸酶、蔗糖酶和海藻糖酶)下降，造成輕度脂肪痢和短暫碳水化合物吸收不良[43]?？漳c腺苷酸環(huán)化酶活性并沒有升高，胃酸、胃蛋白酶的分泌以及其他內(nèi)在因素可能與這些組織學(xué)改變有關(guān)。而胃排空延遲、胃動力減弱可能與胃腸炎的惡心、嘔吐癥狀有關(guān)[44]?？傮w而言，由于缺乏有效的NoV感染致病動物模型，由HuNoV感染引起的AGE的致病機(jī)制目前還不是很清楚，有待進(jìn)一步研究來解釋。

3 NoV感染的診斷學(xué)

雖然在直腸拭子和嘔吐物中都可以檢測到NoV，但糞便中病毒含量相對較高，故將其作為臨床首選標(biāo)本。在1990年NoV基因組成功克隆和測序之前[45]，電子顯微鏡(electron microscopy, EM)是檢測病毒的唯一方式。根據(jù)第1批病毒的收集地點(diǎn)和EM觀察到的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)，將其命名為諾瓦克樣(美國俄亥俄州諾瓦克鎮(zhèn))病毒或小圓結(jié)構(gòu)病毒(small round structural virus)，現(xiàn)正式命名為諾如病毒。由于EM觀察的NoV分辨率低，不易與其他胃腸炎病毒區(qū)分，而且該方法耗時、昂貴，不適宜在日常診斷中使用。此外，由于NoV基因型和抗原性的多樣性以及抗原漂移的存在，對酶免疫試驗(yàn)(enzyme immunoassay, EIA)試劑盒的研發(fā)及應(yīng)用構(gòu)成困難和挑戰(zhàn)。

3.1 分子生物學(xué)診斷

20世紀(jì)90年代，開發(fā)了第1個針對NoV ORF1區(qū)聚合酶基因(region A)的傳統(tǒng)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)[46]。隨著可利用序列的增加，RT-PCR方法被不斷優(yōu)化，特別是改善引物設(shè)計使其具有廣譜反應(yīng)性，現(xiàn)能檢測絕大部分的NoV流行株[47]。NoV廣譜RT-PCR的關(guān)鍵就是找到可用作PCR引物的保守序列，擴(kuò)增特定區(qū)域后可用于測序、分型。這些區(qū)域包括編碼聚合酶的基因(region A和B)以及編碼衣殼蛋白的基因(region C、D和E)，其中最常用的是region A和region C，比較多聚酶和衣殼序列可判斷毒株是否重組[47]。《諾如病毒感染暴發(fā)調(diào)查和預(yù)防控制技術(shù)指南》(2015版)方案推薦利用衣殼蛋白的部分區(qū)域(region C)來對NoV進(jìn)行分型，引物G1SKF、G1SKR和CoG2F、G2SKR分別用于GⅠ和GⅡ的檢測[48]。

與傳統(tǒng)的RT-PCR相比，實(shí)時定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(real-time RT-quantitative PCR assays, RT-qPCR)具有更高的靈敏度和特異度，使用熒光標(biāo)記的寡核苷酸探針，不需要瓊脂糖凝膠電泳分析。一步法RT-qPCR試驗(yàn)中，反轉(zhuǎn)錄和cDNA擴(kuò)增在一個反應(yīng)中進(jìn)行，樣品處理更加簡單，降低了交叉污染的風(fēng)險，更適合于臨床實(shí)驗(yàn)室檢測。雖然目前很多PCR針對病毒的聚合酶基因，但序列分析顯示ORF1-ORF2連接處的保守區(qū)域也可作為引物和探針設(shè)計[49]。盡管美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)還沒有批準(zhǔn)商業(yè)化NoV RT-qPCR檢測試劑盒，但該方法顯然已經(jīng)成為NoV檢測的金標(biāo)準(zhǔn)，用于檢測糞便、嘔吐物、血清、食物、水等多種形式的標(biāo)本。而且，RT-qPCR設(shè)有內(nèi)部質(zhì)控，可以減少假陰性結(jié)果，并能同步檢測GⅠ、GⅡ和GⅣ株[50-51]。同時，RT-qPCR可以半定量方式測定樣本中的病毒載量。研究顯示，病毒載量高的患者病毒脫落時間更長，通常GⅡ基因組的糞便病毒載量高于GⅠ組[52]。但是，RT-qPCR分析靈敏度高，可以檢測到含量極低的病毒，無癥狀的感染者或幾周前感染現(xiàn)已恢復(fù)的個體中仍可能檢測到NoV，因此，若癥狀發(fā)作后超過3～5 d收集樣品并具有高循環(huán)閾值(即低病毒載量)，應(yīng)謹(jǐn)慎分析，以確定AGE的病因。

3.2 多病原體檢測平臺

近年來，多種胃腸道病原體檢測平臺相繼問世，能同時檢測十余種致病性腸道病毒、細(xì)菌和寄生蟲，較傳統(tǒng)方法更加靈敏、快捷，可用于臨床快速診斷。FDA批準(zhǔn)的xTAG Gastrointestinal Pathogen Panel (GPP) (Luminex, Austin, TX)平臺可以同步檢測包括NoV在內(nèi)的3種病毒、3種寄生蟲及7種細(xì)菌，并能區(qū)分NoV GⅠ/GⅡ基因組，其靈敏度>90%，特異度近100%[53]。與此類似，F(xiàn)ilmArray GI panel能夠同時檢測包括NoV在內(nèi)的23種病原，但不能區(qū)分NoV GⅠ和GⅡ基因組，除了個別的病原體，其總體靈敏度同樣>90%，特異度達(dá)100%。與xTAG GPP相比，F(xiàn)ilmArray GI樣品處理更簡單，出結(jié)果的時間更短，缺點(diǎn)是一次只能分析1個樣本，8 h只能處理7～8個樣本。相比之下，xTAG GPP通量更高，8 h能夠處理多達(dá)64個樣本，所以更適合大批量檢測。但是xTAG GPP是一個開放平臺，增加了復(fù)制子污染風(fēng)險，故應(yīng)使用單向工作流并注意實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)范[54]。此外，Life Technologies開發(fā)的TaqMan Array Card (TAC)是點(diǎn)陣芯片卡RT-qPCR平臺，通過空間分布來實(shí)現(xiàn)多病原的檢測。它是由384個孔組成的微流體芯片卡，被分成8個區(qū)域，每個區(qū)域包括48個孔，預(yù)裝有特異性引物和TaqMan探針，每卡可加載8個樣本，同時檢測19種病原。與使用相同引物和探針的RT-PCR Luminex assay相比，TAC的靈敏度為100%，特異度為96.2%[55]。雖然這些檢測平臺可以快速診斷多種病原，但因經(jīng)常出現(xiàn)混合感染和缺乏定量數(shù)據(jù)，故可能無法確定胃腸道疾病是由哪種病原造成，需要通過別的方法進(jìn)一步驗(yàn)證。

3.3 二代測序

二代測序(next-generation sequencing, NGS)技術(shù)因具有高通量、高靈敏度等優(yōu)勢而被廣泛用于基因組學(xué)的研究。NGS可不依賴于特異性引物而得到NoV的全基因組序列，及時發(fā)現(xiàn)異于常見毒株的新突變株，豐富參考序列數(shù)據(jù)庫，追蹤NoV的起源和基因進(jìn)化，從而預(yù)測其潛在的暴發(fā)和流行。NGS一個極大的優(yōu)勢是，所有病毒(高于敏感閾值)都可在產(chǎn)生的序列中表示，為臨床樣本提供重要的共感染數(shù)據(jù)[56]。然而，NGS從文庫制備到測序分析需要至少24～48 h，且需要專門的人員和設(shè)備；另外，價格昂貴，每個樣本需要100～200美元。NGS對于低豐度病毒的測序非常有用，但這也提高了樣本之間發(fā)生交叉污染的風(fēng)險。

4 展望

目前，對HuNoV感染致病機(jī)制的了解大部分來自人體攻毒試驗(yàn)研究，以及主要利用小鼠模型進(jìn)行的替代研究。這些模型受成本、試劑和倫理的限制。盡管小鼠模型成本低廉，但無法繁殖HuNoV。MuNoV和HuNoV在與宿主的相互作用及引起疾病方面有很大差異。因此，未來的致病機(jī)制研究應(yīng)聚焦更能代表人小腸上皮細(xì)胞的體內(nèi)與體外模型的構(gòu)建，包括能感染HuNoV的動物感染與疾病模型，以及人小腸類器官模型。此外，還應(yīng)關(guān)注腸道微生態(tài)與HuNoV感染、復(fù)制和致病的相關(guān)性，以全面理解NoV的致病機(jī)制，為疫苗和治療藥物的研發(fā)，乃至最終治療和預(yù)防NoV胃腸炎提供不可或缺的基礎(chǔ)。