獼猴桃果實中酚類物質(zhì)的分離鑒定及抗氧化活性

張 云，劉 芳，卜范文，陸 英，徐 海，湯佳樂，尹春峰，林文力,,*

（1.中南林業(yè)科技大學食品科學與工程學院，湖南 長沙 410004；2.湖南省園藝研究所，湖南 長沙 410125；3.湖南農(nóng)業(yè)大學園藝園林學院，湖南 長沙 410128）

獼猴桃為多年生的藤本植物，長期以來被稱為“水果之王”，含有豐富的VC、VE、礦物質(zhì)、膳食纖維和酚類物質(zhì)，還具有很高的藥用價值[1-3]。酚類物質(zhì)是植物體重要的次級代謝產(chǎn)物，是日常飲食中含量最為豐富的抗氧化劑，其總膳食攝入量高達1 g/d，遠高于其他各類植物化學物質(zhì)和已知的膳食抗氧化劑[4-6]。酚類化合物作為獼猴桃的重要成分，能夠預防和治療很多氧化應激相關的疾病，如心血管疾病、癌癥、衰老、糖尿病和神經(jīng)退行性病變等，這與其具有很強的抗氧化能力（如自由基清除能力、還原力和金屬螯合活性等）有關[7-10]。目前對獼猴桃果實中酚類物質(zhì)的研究相對較少，已知的酚類物質(zhì)主要包括花青素、酚酸及黃酮類化合物等，例如香豆酸、綠原酸、異槲皮苷，原花青素B2、B3、B4及原花青素二聚體、三聚體、四聚體，兒茶素、表兒茶素、蘆丁、槲皮素糖苷、咖啡酸衍生物等[11-15]。

獼猴桃酚類物質(zhì)的分離純化多采用傳統(tǒng)的方式，難以實現(xiàn)高效的分離純化。本實驗采用高速逆流色譜（high-speed countercurrent chromatography，HSCCC）與制備型高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）聯(lián)用技術，適合于獼猴桃酚類化合物高效、簡便、快速分離。目前，采用HSCCC與制備型HPLC相結合的技術從獼猴桃果實中分離酚類物質(zhì)還鮮見報道。本實驗探究了獼猴桃果實中酚類化合物的分離工藝，對制備得到的單體化合物進行抗氧化活性研究，以期進一步明確獼猴桃果實中酚類物質(zhì)的生理活性功能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

成熟‘紅陽’獼猴桃于2017年9月采摘于湖南省湘西土家族苗族自治州鳳凰縣。

乙腈、正丁醇、正己烷、冰乙酸（均為分析純）恒興化學試劑有限公司；乙醇、甲醇、乙酸乙酯（均為分析純）、乙腈（色譜純） 國藥集團化學試劑有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 東京化成工業(yè)株式會社；2,2’-聯(lián)氮-二-(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽（2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)diammonium salt，ABTS） 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

真空旋轉蒸發(fā)濃縮儀 紫拓儀器設備有限公司；SHZ-D（III）循環(huán)冷卻儀 鞏義市予華儀器責任有限公司；MODULYOD-230冷凍干燥機 美國賽默飛世爾科技有限公司；TBE-300A型HSCCC儀（配備聚四氟乙烯柱，內(nèi)徑1.6 mm，柱容積280 mL，轉速0～1 000 r/min）上海同田生化技術有限公司；TBD-2000紫外檢測器、LX-300恒溫器、TBP-50A恒流泵 北京長流科技儀器公司；分析型LC-20AT HPLC儀、UV-1240紫外分光光度計 日本島津公司；制備型LC-8A HPLC儀日本島津公司；6530 Accurate-Mass Q-TOF LC-質(zhì)譜（mass spectrum，MS）聯(lián)用儀 美國安捷倫公司；Avance 500 MHz核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）儀 德國布魯克光譜儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 獼猴桃多酚提取物的制備

預實驗結果顯示目標組分主要集中于體積分數(shù)70%的乙醇提取物中。取成熟的獼猴桃鮮果8 kg，切片，攪碎，用70%（體積分數(shù)，下同）乙醇超聲15 min，適時攪拌，紗布過濾，濾渣同等條件下再提取一次，合并濾液，離心，55 ℃下減壓濃縮至無醇味，得獼猴桃粗提液。量取800 mL NKA-9大孔樹脂進行預處理（用無水乙醇浸泡過夜），裝柱。量取獼猴桃粗提液2.4 L，調(diào)節(jié)pH 3，以3 BV/h流速上樣，靜置30 min后，用水洗至無色，再以體積分數(shù)70%乙醇洗脫，流速3 BV/h。收集洗脫液，減壓濃縮后冷凍干燥，得純化后的獼猴桃多酚提取物（KPT）干粉9.14 g，冷藏保存?zhèn)溆?，作為HSCCC分析樣品。

1.3.2 HPLC分析

使用ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱。流動相A：水（體積分數(shù)0.2%磷酸），流動相B：乙腈。采用高壓二元梯度洗脫方法按下列方式進行梯度洗脫：0 min，12%流動相A；30 min，40%流動相A；35 min，40%流動相A。檢測波長280 nm，流速1 mL/min，柱溫35 ℃，進樣量10 μL。通過峰面積歸一化法計算各樣品純度。

1.3.3 HSCCC溶劑體系的選擇

將不同溶劑按比例配制，振搖后靜置分層。移取3 mL下層相加入少量冷凍干燥樣品，過0.45 μm有機濾膜，通過HPLC檢測樣品在下層相中各目標峰的面積S1，進樣量10 μL。再取2 mL加入KPT的下層相和2 mL上層相混合，靜置15 min，取分層后的下層相，用HPLC測定樣品經(jīng)上層相萃取后各目標峰的面積S2，進樣量10 μL。按式（1）計算各組分的分配系數(shù)K，選擇K值合適的HSCCC溶劑體系。

1.3.4 HSCCC分離

配制溶劑體系：V（正己烷）∶V（正丁醇）∶V（乙酸乙酯）∶V（乙醇）∶V（水，0.05%冰乙酸）＝1∶1.5∶5∶1∶6，靜置過夜，兩相分離后超聲脫氣10 min。上層相作為固定相，下層相作為流動相。固定相以20.0 mL/min的流速泵滿主機管路后，儀器以900 r/min正向旋轉，柱溫箱25 ℃。流動相以1.8 mL/min的流速泵入主機管路，平衡后取KPT 350 mg，用20 mL下層相溶解，檢測波長280 nm。更換上層相為流動相后，檢測波長調(diào)為254 nm。進樣后進行圖譜采集，根據(jù)峰形手動收集流出液。

用相同方法對KPT干粉進行15 次分離，根據(jù)HSCCC流出圖譜對組分出峰部位分步收集流分。分別取樣經(jīng)HPLC檢測，合并相同流分；若流分中有多種化合物的存在，則需進一步用制備型HPLC進行分離。

1.3.5 制備型HPLC分離

Hplcone 8 C18-100AA（250 mm×10 mm，5 μm）色譜柱。流動相A：水（體積分數(shù)0.5%冰乙酸），流動相B：乙腈。采用高壓二元梯度洗脫方法進行梯度洗脫：0 min，20%流動相A；30 min，40%流動相A；35 min，40%流動相A。檢測波長280 nm。

1.3.6 結構鑒定

化合物MS檢測采用負離子模式，用6530 Accurate-Mass Q-TOF LC-MS聯(lián)用儀完成；化合物NMR檢測用Avance 500 MHz NMR儀完成，以四甲基硅烷為內(nèi)標在氘代二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide-d6，DMSO-d6）中測定。1.3.7 獼猴桃酚類化合物體外抗氧化指標測定

1.3.7.1 DPPH自由基清除能力測定

取2 mL不同質(zhì)量濃度（6.25～100 μg/mL）樣品溶液，分別加入0.1 mmol/L DPPH 2 mL，室溫避光反應30 min，于517 nm波長處測定反應溶液的吸光度[16]。實驗設置3 個重復，以抗壞血酸作為陽性對照。按式（2）計算DPPH自由基清除率（S）。

式中：A0為上述反應體系中樣品溶液用等體積乙醇代替的吸光度；A1為上述反應體系中樣品溶液的吸光度；A2為上述反應體系中DPPH溶液用等體積乙醇代替的吸光度。

1.3.7.2 ABTS陽離子自由基清除能力測定

ABTS工作液：取7 mmol/L ABTS溶液與4.9 mmol/L過硫酸鉀溶液1∶1混合，室溫避光條件下放置12～16 h，ABTS工作液使用前用超純水釋至734 nm波長處吸光度為0.70±0.02，取1 mL不同質(zhì)量濃度（6.25～100 μg/mL）樣品溶液，分別加入2 mL ABTS工作液，室溫避光反應30 min，于734 nm波長處測定吸光度[17]。實驗設置3 個重復，以抗壞血酸作為陽性對照。按式（2）計算ABTS陽離子自由基清除率（S）。式中：A0為上述反應體系中樣品溶液用等體積水代替的吸光度；A1為上述反應體系中樣品溶液的吸光度；A2為上述反應體系中ABTS工作液用等體積水代替的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)用SPSS 17.0、Origin Pro 8.5軟件進行分析與作圖，通過SPSS軟件計算DPPH自由基、ABTS陽離子自由基的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

2 結果與分析

2.1 獼猴桃多酚提取物的HPLC分析

由于獼猴桃果實榨汁提取物中含有較多的糖、蛋白質(zhì)和果膠等雜質(zhì)，在用HSCCC初步分離之前需經(jīng)NKA-9大孔樹脂純化，以達到更好的分離效果。圖1為檢測波長為280 nm和254 nm時KPT的HPLC圖譜。

圖1 NKA-9大孔樹脂純化后KPT的HPLC圖譜Fig. 1 High performance liquid chromatogram of purified KPT with NKA-9 macroporous resin

圖2 獼猴桃果實提取物的紫外吸收光譜Fig. 2 Ultraviolet absorption spectra of 8 phenolic compounds in kiwifruit extract

通過測定紫外光譜特征可對酚類物質(zhì)進行簡單定性，圖2列舉了組分1～8的紫外光譜圖。光電二極管陣列檢測器紫外掃描顯示，HPLC色譜圖中組分1～3在315 nm波長左右有較大吸收，組分4～6在280 nm波長左右有較大吸收，組分7在250 nm波長左右有較大吸收，組分8在250 nm和350 nm波長左右有較大吸收，具有明顯的黃酮及酚酸類物質(zhì)典型的紫外吸收特征。綜上，選擇吸收波長為254 nm和280 nm進行分析。

2.2 HSCCC溶劑體系的篩選

HSCCC分離效果與溶劑體系的選擇密切相關[18-19]。本實驗通過K值選擇合適的溶劑體系，被分離化合物K值的選擇范圍為0.5～2.0。由于HSCCC上樣原料中所含化合物成分較多，無法保證各化合物的K值都在0.5～2.0區(qū)域內(nèi)。表1中列舉了幾組溶劑體系及目標組分的K值。

表1 HSCCC溶劑體系的篩選Table 1 Solvent system screening for HSCCC

由表1可知，各組分在正丁醇-甲基叔丁基醚-乙腈-水體系中的K值較大，會使整體分離時間過長；各組分在正己烷-正丁醇-乙酸乙酯-甲醇-水體系中的K值相近，會導致分離度差。為了盡可能地分離出較多化合物，通過比較多組K值，選擇V（正己烷）∶V（正丁醇）∶V（乙酸乙酯）∶V（乙醇）∶V（水，0.05%冰乙酸）＝1∶1.5∶5∶1∶6的分配體系。由于組分7、8 K值過大，用下層相洗脫所需時間過長，所以待前幾種組分流出后，改用上層相作流動相。

2.3 KPT的HSCCC分離

KPT通過HSCCC分離可手動收集得到6 種流分，如圖3所示。

圖3 KPT的HSCCC分離圖譜Fig. 3 HSCCC pattern of KPT

圖4 HSCCC不同流分的HPLC圖譜Fig. 4 High performance liquid chromatogram of HSCCC fractions

將HSCCC流分分別濃縮后經(jīng)HPLC檢測（圖4），流分IV～VI的純度較高，對應的主要化合物分別記為化合物5、7和8，其純度分別為94.03%、96.45%和95.35%。流分I～III為多種化合物的混合物，需要用制備型HPLC進一步分離并檢測。

2.4 HSCCC流分I～III的制備型HPLC分離

經(jīng)HSCCC分離后純度不高的流分濃縮后，結合制備型HPLC，進一步從流分I中分離得到2 種化合物1、2，純度分別為97.67%、97.26%；從流分II中分離得到2 種化合物3、6，純度分別為97.52%、95.10%；從流分III中分離得到1 種化合物4，純度為97.59%（圖5）。最后得到各酚類單體化合物的質(zhì)量分別為：化合物1：11.43 mg、化合物2：60.38 mg、化合物3：26.51 mg、化合物4：23.79 mg、化合物5：120.72 mg、化合物6：29.93 mg、化合物7：34.55 mg、化合物8：14.89 mg。

創(chuàng)新監(jiān)管機制取得了可喜進展。分局領導班子團結奮進、率先垂范，堅持用嚴格的規(guī)章制度管人管事，制定了監(jiān)管清單、責任清單和廉潔從政風險清單，確保了食品藥品安全監(jiān)管隊伍形成積極向上、團結拼搏、風清氣正的良好風貌。分局建立了“外派學習—頂崗培訓—實戰(zhàn)指導—定期考試考核”以及分局領導帶科、科帶所、直屬所帶鄉(xiāng)鎮(zhèn)所的“4+3”培訓模式，提升了全區(qū)食品藥品監(jiān)管隊伍監(jiān)管技能和業(yè)務水平?？茖W制定了基層監(jiān)管績效評定和“工作經(jīng)費以獎代補”等制度，形成了創(chuàng)先爭優(yōu)的濃厚氛圍。全面建成了27個標準化食品快速檢驗室，完成了4200余批快速檢測，利用“標外”執(zhí)法裝備，為2017年全面完成規(guī)范化建設提供了保障。

圖5 HSCCC流分I～III經(jīng)制備型HPLC分離樣品的HPLC圖Fig. 5 HPLC chromatograms of HSCCC fractions I to III by preparative high performance liquid chromatography separation

2.5 各酚類化合物的結構鑒定

化合物1：白色粉末，電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）-MS m/z：353.0 [M—H]-，ESI-MS2m/z：179.0、135.0。1H-NMR（DMSO-d6，500 MHz）：δH12.12（1H，br s，COOH），9.57（1H，br s，4’-OH），9.17（1H，br s，3’-OH），7.45（1H，d，J＝15.9 Hz，H-7’），7.01（1H，d，J＝1.7 Hz，H-2’），6.96（1H，dd，J＝8.2，1.7 Hz，H-6’），6.75（1H，d，J＝8.2 Hz，H-5’），6.19（1H，d，J＝15.9 Hz，H-8’），5.17（1H，m，H-5），3.83（1H，m，H-3），3.53（1H，m，H-4），1.81～1.99（4H，m，H-2，H-6）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[20]報道的新綠原酸一致，故鑒定為新綠原酸（C16H18O9）。

化合物2：白色粉末，ESI-MS m/z：341.1 [M—H]-，ESI-MS2m/z：179.0、135.0。1H-NMR（DMSO-d6，500 MHz）：δH12.17（1H，br s，COOH），9.15（1H，br s，4-OH），7.45（1H，d，J＝16.0 Hz，H-7），7.44（1H，d，J＝1.6 Hz，H-2），7.19（1H，dd，J＝8.3，1.6 Hz，H-6），6.82（1H，d，J＝8.3 Hz，H-5），6.30（1H，d，J＝16.0 Hz，H-8），4.79（1H，d，J＝7.2 Hz，H-1’），3.72（1H，br d，J＝11.1 Hz，H-6’a），3.11-3.47（5H，m，H-2’，H-3’，H-4’，H-5’，H-6’b）。13C-NMR（DMSO-d6，125 MHz）：δC168.0（s，C-9），149.1（s，C-4），145.6（s，C-3），144.3（d，C-7），125.9（s，C-1），124.1（d，C-6），116.1（d，C-5），116.0（d，C-8），115.7（d，C-2），101.8（d，C-1’），77.3（d，C-5’），76.0（d，C-3’），73.4（d，C-2’），70.0（d，C-4’），60.9（d，C-6’）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[21]報道的咖啡酸-3-O-葡萄糖苷一致，故鑒定為咖啡酸-3-O-葡萄糖苷（C15H18O9）。

化合物3：淺黃色結晶，ESI-MS m/z：297.0 [M—H]-，ESI-MS2m/z：135.0。1H-NMR（DMSO-d6，500 MHz）：δH12.64（1H，br s，COOH），9.65（1H，br s，4’-OH），9.21（1H，br s，3’-OH），7.57（1H，d，J＝15.9 Hz，H-7’），7.05（1H，d，J＝1.5 Hz，H-2’），7.01（1H，dd，J＝8.2，1.5 Hz，H-6’），6.77（1H，d，J＝8.2 Hz，H-5’），6.28（1H，d，J＝15.9 Hz，H-8’），5.06（1H，d，J＝2.0 Hz，H-2），3.97（1H，ddd，J＝8.6，6.0，2.0 Hz，H-3），3.40（1H，dd，J＝10.5，6.0 Hz，H-4a），3.36（1H，dd，J＝10.5，8.6 Hz，H-4b）。13C-NMR（DMSO-d6，125 MHz）：δC170.4（s，C-1），166.1（s，C-9’），148.6（s，C-4’），145.8（d，C-7’），145.6（s，C-3’），125.5（s，C-1’），121.4（d，C-6’），115.8（d，C-5’），114.8（d，C-8’），113.6（d，C-2’），71.9（d，C-2），71.1（d，C-3），61.4（t，C-4）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[22]報道的2-O-咖啡?；K糖酸一致，故鑒定為2-O-咖啡酰基蘇糖酸（C13H14O8）。

化合物5：黃色粉末，ESI-MS m/z：289.1 [M—H]-，ESI-MS2m/z：245.1、203.1、125.0、109.0。1H-NMR（DMSO-d6，500 MHz）：δH9.14，8.92，8.83，8.76（each 1H，br s，5,7,3’,4’-OH），6.88（1H，d，J＝1.5 Hz，H-2’），6.66（1H，d，J＝8.1 Hz，H-5’），6.63（1H，dd，J＝8.1，1.5 Hz，H-6’），5.89（1H，d，J＝2.2 Hz，H-8），5.70（1H，d，J＝2.2 Hz，H-6），4.72（1H，br s，H-2），4.68（1H，d，J＝4.4 Hz，3-OH），3.99（1H，m，H-3），2.67（1H，dd，J＝16.2，4.3 Hz，H-4a），2.47（1H，dd，J＝16.2，3.2 Hz，H-4b）。13C-NMR（DMSO-d6，125 MHz）：δC156.6（s，C-9），156.3（s，C-7），155.8（s，C-5），144.5（s，C-3’，C-4’），130.6（s，C-1’），118.0（d，C-6’），114.9（d，C-5’），114.8（d，C-2’），98.5（s，C-10），95.1（d，C-6），94.1（d，C-8），78.1（d，C-2），64.9（d，C-3），28.3（t，C-4）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[23]報道的表兒茶素一致，故鑒定為表兒茶素（C15H14O6）。

化合物6：淺黃色結晶，ESI-MS m/z：865.1971[M—H]-，ESI-MS2m/z：695.1、577.1、407.1、287.1、161.0、125.0。1H-NMR（DMSO-d6，500 MHz）：δH8.95，8.75，8.70，8.64，8.60，8.58，8.39，7.92，7.62（12H，br s，5,7,3’,4’-OHB,M,T），6.50～7.05（9H，m，HB,M,T-2’,5’,6’），5.81，5.80，5.73（4H，br s，HB-6，HM-6，HT-6，HT-8），5.04，5.00（each 1H，br s，HM,T-2），4.92（1H，br s，HB-2），4.72（1H，br s，3-OHB），4.49～4.55（2H，br s，HM,T-4），4.21（1H，br s，HB-3），4.16，4.02（each 1H，d，J＝3.6 Hz，3-OHM,T），3.80，3.76（each 1H，br s，HM,T-3），2.73（1H，br d，J＝16.2 Hz，HB-4a），2.43（1H，br d，J＝16.2 Hz，HB-4b）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[24]報道的原花青素C1一致，故鑒定為原花青素C1（C45H38O18）。

化合物7：黃色粉末，ESI-MS m/z：367.2 [M—H]-，ESI-MS2m/z：205.1。1H-NMR（DMSO-d6，500 MHz）：δH12.32（1H，br s，COOH），7.73（1H，dd，J＝8.6，1.9 Hz，H-6），7.68（1H，d，J＝1.9 Hz，H-2），7.12（1H，d，J＝8.6 Hz，H-5），5.30（1H，br t，J＝7.5 Hz，H-2’），4.92（1H，d，J＝7.2 Hz，H-1”），3.69（1H，br d，J＝11.9 Hz，H-6”a），3.46（1H，dd，J＝11.9，5.7 Hz，H-6”b），3.25～3.40（5H，m，H-2’，H-2”，H-4”，H-5”），3.17（1H，t，J＝9.0 Hz，H-3”），1.70（3H，br s，H-4’），1.67（3H，br s，H-5’）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[25]報道的Malaxinic acid一致，故鑒定為Malaxinic acid（C18H24O8）。

化合物8：黃色粉末，ESI-MS m/z：447.1 [M—H]-，ESI-MS2m/z：301.0。1H-NMR（DMSO-d6，500 MHz）：δH12.65（1H，s，5-OH），7.29（1H，d，J＝2.1 Hz，H-2’），7.24（1H，dd，J＝8.3，2.1 Hz，H-6’），6.85（1H，d，J＝8.3 Hz，H-5’），6.38（1H，d，J＝2.0 Hz，H-8），6.20（1H，d，J＝2.0 Hz，H-6），5.24（1H，br s，H-1”），3.96（1H，br s，H-2”），3.49（1H，dd，J＝9.3，3.2 Hz，H-3”），3.19（1H，dq，J＝9.3，6.0 Hz，H-5”），3.13（1H，t，J＝9.3 Hz，H-4”），0.80（3H，d，J＝6.0 Hz，H-6”）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻[26]報道的槲皮苷一致，故鑒定為槲皮苷（C21H20O11）。

以上鑒定出的各酚類化合物結構如圖6所示。

圖6 各酚類化合物的化學結構式Fig. 6 Chemical structures of 7 phenolic compounds from kiwifruits

2.6 KPT和各化合物抗氧化活性分析

由于化合物1、3、8制備得到的質(zhì)量有限，所以實驗只測定了KPT和化合物2、5、6、7的DPPH和ABTS陽離子自由基的清除能力。

2.6.1 DPPH自由基清除能力

采用DPPH自由基清除實驗測定物質(zhì)的抗氧化活性是一種簡單、快速、有效的方法。DPPH自由基是一種穩(wěn)定的對稱價電子的氮族自由基，在517 nm波長處有最大吸收，易與具有供氫體的化合物發(fā)生電子轉移反應[28-29]?；衔飳PPH自由基的清除能力取決于其供氫能力。

圖7 KPT和各化合物的DPPH自由基清除能力Fig. 7 DPPH free radical scavenging capacity of KPT and four selected phenolic compounds from kiwifruits

由圖7可知，KPT、化合物5及化合物6有很強的DPPH自由基清除能力，當質(zhì)量濃度達到100 μg/mL時，DPPH自由基清除率接近100%，其中化合物6的DPPH自由基清除能力與抗壞血酸（IC50＝0.01 μg/mL）相當。當質(zhì)量濃度在6.25～100 μg/mL時，化合物2與化合物7的DPPH自由基清除能力隨著質(zhì)量濃度的增加而減小；當質(zhì)量濃度達到100 μg/mL時，化合物2與化合物7的DPPH自由基清除率接近70%。KPT和化合物2、5、6、7清除DPPH自由基的IC50分別是6.73、41.63、0.30、0.01、63.90 μg/mL，即DPPH自由基清除能力排序為：化合物6＞化合物5＞KPT＞化合物2＞化合物7，化合物6的DPPH自由基清除能力最佳。化合物對DPPH自由基的清除能力與酚羥基的數(shù)量有關，由圖6中的化學結構可以看出，化合物6（原花青素C1）含有較多的酚羥基，供氫能力較強。相比之下，化合物7（Malaxinic acid）DPPH自由基清除能力最弱，可能與酚羥基上的氫被取代有關。

2.6.2 ABTS陽離子自由基清除能力

圖8 KPT和各化合物的ABTS陽離子自由基清除能力Fig. 8 ABTS cation radical scavenging capacity of KPT and four selected phenolic compounds from kiwifruits

ABTS陽離子自由基脫色測定法也是一種有效的測定自由基清除能力的方法，ABTS在氧化劑的過氧化作用下會形成一種亞穩(wěn)態(tài)的陽離子自由基，于734 nm波長處有吸收，可用于天然產(chǎn)物抗氧化活性的測定[30-31]。

由圖8可知，KPT和化合物2、5、6的ABTS陽離子自由基清除能力均較好。當質(zhì)量濃度為12.5 μg/mL時，化合物5與化合物6的ABTS陽離子自由基清除率接近100%，并且均比抗壞血酸（IC50＝7.52 μg/mL）的清除效果好。當質(zhì)量濃度為50 μg/mL時，KPT和化合物2的ABTS陽離子自由基清除率也接近100%。而化合物7在質(zhì)量濃度為100 μg/mL時，ABTS陽離子自由基清除率接近75%。KPT和化合物2、5、6、7清除ABTS陽離子自由基的IC50分別是11.84、5.38、3.10、1.00、60.12 μg/mL，即ABTS陽離子自由基清除能力排序為：化合物6＞化合物5＞化合物2＞KPT＞化合物7。ABTS陽離子自由基清除能力主要與游離羥基的數(shù)量和位置有關，化合物6（原花青素C1）的ABTS陽離子自由基清除效果最好，化合物7（Malaxinic acid）的清除能力最弱。

3 結 論

本研究采用HSCCC與制備型HPLC聯(lián)用技術分離制備獼猴桃果實中的酚類化合物，篩選出的HSCCC溶劑體系對KPT具有較好的分離效果，得到的3 種酚類單體化合物分別為表兒茶素、Malaxinic acid、槲皮苷，純度分別為94.03%、96.45%、95.35%。結合制備型HPLC對HSCCC得到的不純流分進一步分離，得到4 種酚類單體化合物，分別為新綠原酸、咖啡酸-3-O-葡萄糖苷、2-O-咖啡酰基蘇糖酸、原花青素C1，純度分別為97.67%、97.26%、97.52%、95.10%。其中2-O-咖啡酰基蘇糖酸的化學結構是一種非常罕見的酚酸性結構。

通過抗氧化活性測定發(fā)現(xiàn)，表兒茶素、原花青素C1、咖啡酸-3-O-葡萄和Malaxinic acid這4 種單體化合物對DPPH和ABTS陽離子自由基都具有良好的清除效果。KPT、表兒茶素（化合物5）和原花青素C1（化合物6）有很強的DPPH和ABTS陽離子自由基清除效果，但KPT對DPPH和ABTS陽離子自由基的清除效果弱于表兒茶素和原花青素C1。與KPT、表兒茶素、原花青素C1和咖啡酸-3-O-葡萄糖苷相比，Malaxinic acid（化合物7）對DPPH和ABTS陽離子自由基的清除效果最弱。酚類物質(zhì)具有很好的抗氧化活性，亦可與其他具有抗氧化活性的物質(zhì)有協(xié)同作用，并且這種協(xié)同作用可能對KPT的DPPH和ABTS陽離子自由基的清除效果產(chǎn)生了影響，其中具體原因有待進一步探究。