抗菌肽Jelleine-I對(duì)采后柑橘果實(shí)綠霉病的控制作用

李心丹，王文軍，鄧麗莉,2，姚世響,2，曾凱芳,2,*

（1.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；2.西南大學(xué)食品貯藏與物流研究中心，重慶 400715）

柑橘屬蕓香科（Rutaceae）柑橘亞科（Aurantioideac）柑橘屬（Citrus）柑橘亞族（Citrinae）果樹(shù)，主要集中分布在中國(guó)、美國(guó)等地區(qū)[1]。因柑橘果實(shí)柔嫩多汁，富含豐富的糖類(lèi)、酸類(lèi)、VC以及礦質(zhì)元素和多種苷類(lèi)物質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，而深受消費(fèi)者喜愛(ài)[2-3]。我國(guó)柑橘以鮮銷(xiāo)為主，在旺季時(shí)需大量貯藏，而采摘后的柑橘果實(shí)在貯藏過(guò)程中易受病原菌侵染而發(fā)生大量腐爛現(xiàn)象，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4]。其中由指狀青霉（Penicillium digitatum）引起的綠霉病是柑橘貯藏期主要病害之一[5]。在現(xiàn)有柑橘類(lèi)果實(shí)侵染性病害防治方法中，化學(xué)殺菌劑的使用是最普遍也是最有效的，如苯并咪唑類(lèi)殺菌劑的代表品種多菌靈以及咪唑類(lèi)殺菌劑的代表品種咪鮮胺[6]。但化學(xué)殺菌劑的長(zhǎng)期使用使環(huán)境及人體健康受到了潛在的威脅，且使病原微生物對(duì)其產(chǎn)生抗性，因而化學(xué)殺菌劑的使用逐漸受到限制[7]。研究者們開(kāi)始致力于尋找對(duì)人體健康無(wú)害的方式和物質(zhì)來(lái)代替或減少化學(xué)殺菌劑的大劑量使用。

抗菌肽是由基因編碼、核糖體合成的能夠抵御外界病原菌的多肽，廣泛存在于各種生物體內(nèi)，具有廣譜抑菌性[8-9]?？咕目赏ㄟ^(guò)與病原微生物的細(xì)胞膜、細(xì)胞壁或胞內(nèi)靶點(diǎn)物質(zhì)作用加速病原菌死亡[10-11]。抗菌肽作用機(jī)制的特殊性使病原菌不易對(duì)其產(chǎn)生抗性。近年來(lái)，抗菌肽的高效抑菌性使其在醫(yī)藥業(yè)、農(nóng)業(yè)、食品工業(yè)及畜牧業(yè)受到越來(lái)越多的關(guān)注[12-13]。在果蔬采后病害控制方面，研究者通過(guò)直接提取、化學(xué)合成以及利用微生物表達(dá)等方式獲取抗菌肽，利用抗菌肽對(duì)病原菌的抑制作用控制果蔬采后病害的發(fā)生[14-19]。其中，陽(yáng)離子短鏈抗菌肽由于較低的合成成本及優(yōu)良的抗菌性能備受研究者關(guān)注?？咕腏elleine-I（PFKLSLHL-NH2）是一種從蜜蜂（Apis mellifera）的蜂王漿中分離得到的陽(yáng)離子短鏈抗菌肽，對(duì)細(xì)菌和酵母具有獨(dú)特的抑菌活性[20-22]。但有關(guān)抗菌肽Jelleine-I控制果蔬采后病害的研究報(bào)道尚少，也鮮見(jiàn)將抗菌肽Jelleine-I應(yīng)用于柑橘果實(shí)采后病害控制的相關(guān)研究報(bào)道。本研究旨在探究抗菌肽Jelleine-I對(duì)引起柑橘果實(shí)綠霉病的病原菌P. digitatum生長(zhǎng)的影響及可能的作用機(jī)理，并評(píng)價(jià)抗菌肽Jelleine-I對(duì)柑橘果實(shí)采后綠霉病的控制效果，從而拓寬抗菌肽Jelleine-I的應(yīng)用范圍，為控制柑橘果實(shí)采后病害提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

使用固相合成方法于南京金斯瑞公司合成純度大于90%的抗菌肽Jelleine-I，貯藏于-40 ℃冰箱中，使用前先用無(wú)菌水配成1 mmol/L的母液，然后稀釋至所需濃度。

指狀青霉（P. digitatum）分離于發(fā)病豐臍果實(shí)，并通過(guò)分子生物學(xué)方法鑒定。用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）于25 ℃培養(yǎng)病原菌，7 d后收集孢子并用無(wú)菌水調(diào)至所需濃度[23]。

實(shí)驗(yàn)所用柑橘品種為豐臍（Citrus Sinensic (L.)Osbeck），11月下旬采摘于重慶市北碚區(qū)馮家槽果園。果實(shí)（可溶性固形物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10.1%，可滴定酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.96%）采收后立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，挑選成熟度一致、大小均一、無(wú)機(jī)械傷、無(wú)病蟲(chóng)害的健康果實(shí)作為實(shí)驗(yàn)材料。

SYTOX Green（SG）熒光染色試劑 美國(guó)Invitrogen公司；Calcofluor White（CFW）熒光染色試劑美國(guó)Sigma Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BXM30R立式高壓滅菌鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SW-CJ-1F超凈工作臺(tái) 蘇凈集團(tuán)安泰有限公司；DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；B203生物顯微鏡 重慶奧特光學(xué)儀器有限公司；SYNERGYH1MG全自動(dòng)酶標(biāo)儀 美國(guó)BioTek公司；TS100熒光顯微鏡 北京長(zhǎng)恒榮創(chuàng)科技有限公司；AvantiTMJ-30I高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Beckman公司；DDS-307A電導(dǎo)率儀 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 抗菌肽Jelleine-I對(duì)P. digitatum的離體抑菌作用

實(shí)驗(yàn)參照J(rèn)ia Fengjing等[21]的方法并進(jìn)行一定的修改。用無(wú)菌的96 孔微量板進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將180 μL 1×104CFU/mL P. digitatum孢子懸浮液（含體積分?jǐn)?shù)5%馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（potato dextrose broth，PDB））、20 μL抗菌肽Jelleine-I，混合后立即加入96 孔板中，抗菌肽Jelleine-I的終濃度分別為3.12、6.25、12.5、25、50、100 μmol/L。設(shè)無(wú)菌水為對(duì)照，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h時(shí)用酶標(biāo)儀測(cè)定其OD600nm。以48 h時(shí)依舊能完全抑制病原菌生長(zhǎng)的最低濃度作為最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）。并從未見(jiàn)菌絲生長(zhǎng)的孔中吸取50 μL液體涂布在PDA培養(yǎng)基上，于25 ℃繼續(xù)培養(yǎng)48 h，以無(wú)任何菌落形成的最低濃度為最低殺菌濃度（minimum fungicidal concentration，MFC）。

1.3.2 同孔損傷接種抗菌肽Jelleine-I對(duì)柑橘果實(shí)綠霉病的控制效果

實(shí)驗(yàn)參照Z(yǔ)hou Yahan等[24]的方法并進(jìn)行一定的修改。柑橘果實(shí)隨機(jī)分組，每組15 個(gè)果實(shí)，以體積分?jǐn)?shù)2%的次氯酸鈉溶液浸泡2 min后用自來(lái)水清洗以除去表面殘留污物，果實(shí)表面赤道部位用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液擦拭消毒后，用滅菌打孔器在果實(shí)赤道部位等距打2 個(gè)孔（深3 mm、直徑4 mm）。每孔接種10 μL新鮮孢子懸浮液（1×104CFU/mL），4 h后，每孔接種10 μL抗菌肽溶液（12.5、100 μmol/L）或無(wú)菌水（對(duì)照組）。待液體完全吸收后，用聚乙烯薄膜袋（170 mm×140 mm）將果實(shí)單果包裝，置于25 ℃、相對(duì)濕度90%～95%的環(huán)境中貯藏，每天統(tǒng)計(jì)發(fā)病率并測(cè)量病斑直徑。

1.3.3 抗菌肽Jelleine-I對(duì)P. digitatum菌絲體細(xì)胞膜透性影響的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)參考Puig等[25]的方法并進(jìn)行一定的調(diào)整。用體積分?jǐn)?shù)5% PDB配制1×104CFU/mL的病原菌孢子懸浮液，取90 μL加入到無(wú)菌的1.5 mL離心管中，25 ℃下培養(yǎng)24 h。然后，加入10 μL抗菌肽溶液，使抗菌肽Jelleine-I終濃度達(dá)到0、6.25、12.5、100 μmol/L，無(wú)菌水為對(duì)照，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。培養(yǎng)完成后，加入4 μmol/L的SG貯備溶液，使其終濃度達(dá)到0.2 μmol/L，樣品在暗環(huán)境下培養(yǎng)5 min；然后加入1 g/L CFW，使其終質(zhì)量濃度達(dá)到50 μg/mL，樣品繼續(xù)在暗環(huán)境下培養(yǎng)5 min。最后，用純水洗凈菌絲，重懸于體積分?jǐn)?shù)20%甘油溶液，制片并在熒光顯微鏡下觀察。SG的熒光檢測(cè)（激發(fā)波長(zhǎng)設(shè)置為450～490 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為515～565 nm）選擇FITC濾光片。CFW的熒光檢測(cè)（激發(fā)波長(zhǎng)為395 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為440 nm）選擇DAPI濾光片。

1.3.4 抗菌肽Jelleine-I對(duì)P. digitatum胞外電導(dǎo)率影響的測(cè)定

采用微型電導(dǎo)儀測(cè)定抗菌肽Jelleine-I對(duì)指狀青霉胞外電導(dǎo)率的影響。實(shí)驗(yàn)參考Zhou Haien等[26]的方法并進(jìn)行一定的修改。100 μL含有1×105CFU/mL病原菌孢子加入到20 mL PDB培養(yǎng)基中，25 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。4 000×g離心15 min，水洗3 次，收集菌絲體，重新懸浮于無(wú)菌水中。然后加入抗菌肽Jelleine-I溶液，使其終濃度分別為0、6.25、12.5、100 μmol/L。在處理0、0.5、1、2、3、6 h和9 h時(shí)測(cè)定胞外電導(dǎo)率，無(wú)菌水為對(duì)照。

1.3.5 抗菌肽Jelleine-I對(duì)P. digitatum菌絲體細(xì)胞成分釋放的影響

采用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)定抗菌肽Jelleine-I對(duì)指狀青霉菌絲體胞內(nèi)核酸物質(zhì)釋放的影響。實(shí)驗(yàn)參照Paul等[27]的方法并進(jìn)行一定的修改。100 μL含有1×105CFU/mL病原菌孢子加入到20 mL PDB培養(yǎng)基中，25 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。然后4 000×g離心15 min，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.0）清洗3 次，收集菌絲體，重新懸浮于PBS（pH 7.0）中。然后加入抗菌肽Jelleine-I溶液，使其終濃度分別為0、6.25、12.5、100 μmol/L。在處理0、0.5、1、2、3、6、9 h時(shí)離心取上清液測(cè)定260 nm波長(zhǎng)處的OD值，無(wú)菌水為對(duì)照。

1.3.6 抗菌肽Jelleine-I溶血性測(cè)試

實(shí)驗(yàn)參照Mu?oz等[28]的方法并進(jìn)行一定的修改。將從醫(yī)院獲得的健康成人新鮮血液放入含有肝素鈉的離心管中混勻，1 000×g離心5 min，棄上清液，用0.1 mol/L PBS沖洗3 次，然后重懸于4 倍體積的PBS中即得到紅細(xì)胞懸浮液。取10 μL濃度分別為12.5、25、50、100 μmol/L的抗菌肽Jelleine-I溶液與90 μL紅細(xì)胞懸浮液混合后于37 ℃培養(yǎng)1 h，以0.1 mol/L PBS為陰性對(duì)照，體積分?jǐn)?shù)0.1% Triton X-100為陽(yáng)性對(duì)照，然后1 000×g離心5 min。轉(zhuǎn)移上清液至無(wú)菌的96 孔微量板，用酶標(biāo)儀測(cè)定OD540nm。按照下式計(jì)算溶血率。

式中：OD樣、OD陰、OD陽(yáng)分別表示樣品、陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照組的OD540nm。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。所有數(shù)據(jù)用Excel 2013軟件處理，運(yùn)用Graph Pad Prism 5軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析并作圖；用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，利用Duncan’s多重比較對(duì)差異顯著性進(jìn)行分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗菌肽Jelleine-I對(duì)P. digitatum的離體抑菌作用

圖1 抗菌肽Jelleine-I對(duì)P. digitatum的離體抑菌作用Fig. 1 Antifungal activity of peptide Jelleine-I against P. digitatum in vitro

由圖1A可知，當(dāng)抗菌肽Jelleine-I濃度高于3.12 μmol/L時(shí)，能抑制P. digitatum的生長(zhǎng)，且濃度越高抑制作用越強(qiáng)。當(dāng)抗菌肽Jelleine-I濃度為6.25 μmol/L時(shí)，P. digitatum的生長(zhǎng)受到完全抑制，因此，抗菌肽Jelleine-I的MIC為6.25 μmol/L。由圖1B、C可知，抗菌肽Jelleine-I濃度越大，對(duì)P. digitatum孢子的致死作用越顯著，當(dāng)抗菌肽Jelleine-I濃度達(dá)到12.5 μmol/L時(shí)，P. digitatum孢子幾乎不會(huì)存活，因此，抗菌肽Jelleine-I的MFC為12.5 μmol/L。

2.2 抗菌肽Jelleine-I對(duì)柑橘果實(shí)綠霉病的控制效果

圖2 抗菌肽Jelleine-I對(duì)柑橘采后綠霉病發(fā)病率和病斑直徑的影響Fig. 2 Effect ofJelleine-I on green mold incidence and lesion diameter of citrus fruit

如圖2所示，經(jīng)同孔損傷接種P. digitatum的柑橘果實(shí)，在接種后的4～6 d內(nèi)，抗菌肽Jelleine-I處理組的發(fā)病率顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。且在接種后的3～6 d內(nèi)，抗菌肽Jelleine-I處理組的病斑直徑也顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）。兩個(gè)不同濃度（100、12.5 μmol/L）的抗菌肽Jelleine-I處理組之間在接種后3～6 d內(nèi)發(fā)病率和病斑直徑均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

2.3 抗菌肽Jelleine-I對(duì)P. digitatum菌絲體細(xì)胞膜的影響

圖3 抗菌肽Jelleine-I對(duì)P. digitatum菌絲體細(xì)胞膜的影響Fig. 3 Effect of Jelleine-I on membrane permeability of P. digitatum

如圖3所示，實(shí)驗(yàn)利用熒光顯微鏡觀察抗菌肽Jelleine-I處理對(duì)P. digitatum的菌絲細(xì)胞膜通透性的影響。當(dāng)細(xì)胞膜破壞后，SG熒光染色劑可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與核酸物質(zhì)結(jié)合，并且呈現(xiàn)出大于未結(jié)合核酸物質(zhì)時(shí)500 倍強(qiáng)度的綠色熒光。但當(dāng)細(xì)胞膜通透性正常時(shí)，其不會(huì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。CFW染色劑可與真菌細(xì)胞壁成分幾丁質(zhì)、纖維素特異性結(jié)合，故由于細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)變化導(dǎo)致的幾丁質(zhì)異常積累可被觀察到。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，對(duì)照組P. digitatum的菌絲經(jīng)SG和CFW染色后，不會(huì)出現(xiàn)明顯的綠色SG熒光，且藍(lán)色CFW熒光在細(xì)胞間明顯較強(qiáng)，表明幾丁質(zhì)在細(xì)胞間積累正常。但是隨著抗菌肽Jelleine-I處理濃度的增大，綠色SG熒光強(qiáng)度變得越來(lái)越強(qiáng)。經(jīng)過(guò)6.25、12.5 μmol/L的抗菌肽Jelleine-I處理后，菌絲上出現(xiàn)較少量不連續(xù)的綠色SG熒光，藍(lán)色CFW熒光貫穿整個(gè)菌絲，但在細(xì)胞間的藍(lán)色CFW熒光減少。當(dāng)抗菌肽Jelleine-I濃度為100 μmol/L時(shí)，菌絲上出現(xiàn)大面積連續(xù)的綠色SG熒光，以及貫穿整個(gè)菌絲的藍(lán)色CFW熒光，但未出現(xiàn)細(xì)胞間的藍(lán)色CFW熒光。

2.4 抗菌肽Jelleine-I對(duì)P. digitatum菌絲體胞外電導(dǎo)率的影響

如圖4所示，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，對(duì)照組和3 個(gè)不同濃度抗菌肽Jelleine-I處理組的P. digitatum菌絲體胞外電導(dǎo)率都逐漸增大。3 個(gè)不同濃度抗菌肽Jelleine-I處理組的胞外電導(dǎo)率值均顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。且在處理時(shí)間內(nèi)，100 μmol/L的電導(dǎo)率顯著高于6.25 μmol/L處理組和12.5 μmol/L處理組（P＜0.05），但6.25 μmol/L處理組和12.5 μmol/L處理組之間沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05）。在處理9 h后，各組胞外電導(dǎo)率達(dá)到最大，對(duì)照組和6.25、12.5、100 μmol/L 抗菌肽Jelleine-I處理組胞外電導(dǎo)率分別為94.8、174.25、158.3、329.67 μS/cm。

圖4 抗菌肽Jelleine-I對(duì)P. digitatum菌絲體胞外電導(dǎo)率的影響Fig. 4 Effect of Jelleine-I treatment on extracellular conductivity of P. digitatum

2.5 抗菌肽Jelleine-I對(duì)P. digitatum菌絲體細(xì)胞成分釋放的影響

圖5 抗菌肽Jelleine-I對(duì)P. digitatum菌絲體細(xì)胞成分釋放的影響Fig. 5 Effect of Jelleine-I treatment on release of intracellular constituents from P. digitatum

P. digitatum菌絲體細(xì)胞外OD260nm能表征細(xì)胞內(nèi)核酸物質(zhì)的泄漏程度。如圖5所示，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，抗菌肽Jelleine-I處理組的P. digitatum菌絲體胞外OD260nm明顯增加，且顯著高于相同處理時(shí)間的對(duì)照組（P＜0.05）。處理0.5 h時(shí)，100 μmol/L抗菌肽 Jelleine-I處理組的OD260nm為0.21，顯著高于12.5 μmol/L處理組（0.13）和6.25 μmol/L處理組（0.11）（P＜0.05）。在處理前2 h內(nèi)，6.25 μmol/L處理組和12.5 μmol/L處理組之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05），在2～9 h內(nèi)，兩處理組間出現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）。

2.6 抗菌肽Jelleine-I溶血性檢測(cè)結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)中，以0.1 mol/L PBS作為陰性對(duì)照，其不會(huì)導(dǎo)致溶血現(xiàn)象；以0.1% Triton X-100作為陽(yáng)性對(duì)照，其有極強(qiáng)的溶血性。如圖6所示，各實(shí)驗(yàn)濃度抗菌肽Jelleine-I組的溶血率顯著低于0.1% Triton X-100（P＜0.05），各濃度抗菌肽Jelleine-I組之間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。當(dāng)抗菌肽Jelleine-I濃度為12.5、25、50 μmol/L和100 μmol/L時(shí)，溶血率分別為0.33%、1.33%、3.34%和2.34%。

圖6 抗菌肽Jelleine-I的溶血性Fig. 6 Hemolytic activity of peptide Jelleine-I

3 討 論

前人研究認(rèn)為，Jelleine-I對(duì)白色念珠菌（Candida albicans）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）等微生物生長(zhǎng)有抑菌作用[21-22]。本實(shí)驗(yàn)研究了在離體條件下抗菌肽Jelleine-I對(duì)P. digitatum生長(zhǎng)的抑制情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗菌肽Jelleine-I能顯著抑制P. digitatum菌絲的生長(zhǎng)，且對(duì)P. digitatum孢子有致死作用，其MIC和MFC分別為6.25、12.5 μmol/L。P. digitatum孢子易通過(guò)環(huán)境傳播，侵染柑橘果實(shí)，導(dǎo)致其發(fā)病[29]。在體內(nèi)條件下，研究了濃度為12.5、100 μmol/L的抗菌肽Jelleine-I對(duì)P. digitatum接種柑橘果實(shí)采后綠霉病發(fā)生的控制效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Jelleine-I能有效控制柑橘果實(shí)采后綠霉病的發(fā)生，這與其在離體條件下兩個(gè)濃度均能夠?qū)㈡咦油耆珰⑺来嬖谝恢滦?。?2.5、100 μmol/L 抗菌肽Jelleine-I組之間差異不顯著。

前人研究表明，抗菌肽作用于病原菌細(xì)胞時(shí)，先于細(xì)胞表面聚集，進(jìn)而破壞細(xì)胞膜、壁，或者直接進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與胞內(nèi)靶點(diǎn)物質(zhì)相互作用，從而影響病原菌細(xì)胞正常生長(zhǎng)繁殖，最終殺死病原菌[12,30-32]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)熒光顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)抗菌肽Jelleine-I能增加P. digitatum菌絲體細(xì)胞膜通透性，同時(shí)破壞P. digitatum細(xì)胞間隔膜，使SG進(jìn)入P. digitatum細(xì)胞內(nèi)，發(fā)出強(qiáng)烈綠色熒光，影響CFW染料在細(xì)胞間的積累，減少細(xì)胞間的藍(lán)色CFW熒光，此結(jié)果與大多數(shù)抗菌肽作用相似，如PAF56[23]、BP21[33]、Thanatin、Ponericin W1、Mastoparan-S[34]。細(xì)胞膜在維持細(xì)胞正常生命活動(dòng)方面起著重要的作用[35]，當(dāng)細(xì)胞膜損壞時(shí)可能會(huì)增加細(xì)胞膜通透性，引起細(xì)胞內(nèi)一些離子和小分子物質(zhì)泄漏[26,36-38]，最終抑制微生物的生長(zhǎng)。為評(píng)定細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)的不可逆損傷，本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了Jelleine-I處理后P. digitatum菌絲體的胞外電導(dǎo)率和胞內(nèi)核酸物質(zhì)泄漏量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)Jelleine-I處理的P. digitatum菌絲體的胞外電導(dǎo)率和胞內(nèi)核酸物質(zhì)泄漏量顯著增加，且100 μmol/L Jelleine-I的影響更加顯著。這也再次證明抗菌肽Jelleine-I能改變柑橘果實(shí)綠霉病病原菌P. digitatum菌絲體細(xì)胞膜的通透性，引起細(xì)胞的不可逆損傷?？咕膶?duì)正常哺乳動(dòng)物紅細(xì)胞的溶解性是阻礙抗菌肽應(yīng)用的主要障礙之一，但抗菌肽Jelleine-I具有特異性細(xì)胞溶解活性，對(duì)人血紅細(xì)胞幾乎不存在溶解性，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。這與Fontana等[20]的研究結(jié)果一致。

4 結(jié) 論

抗菌肽Jelleine-I能通過(guò)增加P. digitatum細(xì)胞膜通透性，引起胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，從而表現(xiàn)出對(duì)P. digitatum生長(zhǎng)的抑制作用和致死作用；此外，抗菌肽Jelleine-I能有效控制柑橘果實(shí)綠霉病的發(fā)生。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽Jelleine-I對(duì)人血紅細(xì)胞有一定的特異性選擇作用。因此認(rèn)為，抗菌肽Jelleine-I在控制柑橘果實(shí)采后綠霉病病害方面具有極大的開(kāi)發(fā)應(yīng)用價(jià)值。