陳路斯 王震 張劍偉 張新黨 王恒志 林貝貝 鄧君明

摘要[目的]闡述虹鱒β-羥-β-甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGCR）基因的mRNA序列，并比較其在虹鱒不同組織器官中的表達(dá)差異。[方法]通過PCR技術(shù)擴(kuò)增虹鱒HMGCR基因的mRNA序列，采用熒光定量PCR技術(shù)，比較HMGCR基因在虹鱒肝臟、腸道、胃、心臟、鰓、脾臟、腎臟、肌肉8種組織器官中的表達(dá)差異。[結(jié)果]虹鱒HMGCR基因的mRNA序列與大西洋鮭的同源性達(dá)97%，其蛋白序列與脊椎動物的同源性都在70%以上，表明該基因在物種進(jìn)化過程中比較保守;該基因在虹鱒肝臟、腸道、胃、心臟、鰓、脾臟、腎臟、肌肉8種組織器官中均有表達(dá);其中，該基因在肝臟和心臟中的表達(dá)量較高，而在胃中的表達(dá)量最低。[結(jié)論]該研究克隆出虹鱒膽固醇合成關(guān)鍵限速酶HMGCR的部分mRNA序列，分析了該基因在不同組織中的表達(dá)情況，為該酶的深入研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞虹鱒;HMG-CoA還原酶;基因克隆;組織差異表達(dá);熒光定量PCR

中圖分類號S?917.4文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號0517-6611（2019）18-0095-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.18.024

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Cloning and Tissue Differential Expression Analysis of HMGCR Gene in Oncorhynchus mykiss

CHEN Lu-si，WANG Zhen，ZHANG Jian-wei et al（College of Animal Science and Technology，Yunnan Agricultural University，Kun-ming，Yunnan 650201）

Abstract[Objective]The purpose of this study was to reveal the mRNA sequence of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase （HMGCR） and compare the gene expression levels in different tissues of rainbow trout （Oncorhynchus mykiss）.[Method]The partial sequence of HMGCR gene was amplified by PCR technology and the gene expression differences among tissues such as liver，intestine，stomach，heart，gill，spleen，kidney and muscle were revealed by fluorescence quantitative PCR technology.[Result]The amino acid sequence shared 97% homology with Salmo salar，and the deduced protein sequence shared more than 70% homology with vertebrate，indicating that the gene was more conservative in the process of species evolution.The gene expression could be detected in the liver，intestines，stomach，heart，gill spleen，kidney and muscle of rainbow trout.The expression level of HMGCR gene in liver and heart was the highest，whereas which was the lowest in the stomach.[Conclusion]We cloned the partial RNA sequence of HMGCR，a key rate-limiting enzyme for cholesterol synthesis in rainbow trout，and analyzed the expression of HMGCR in different tissues，which laid a foundation for further study of the enzyme.

Key wordsOncorhynchus mykiss;HMGCR;Gene cloning;Tissue differential expression;Real-time PCR

膽固醇是一種以環(huán)戊烷多氫菲為母體的固醇類衍生物，主要以游離膽固醇和膽固醇酯的形式存在于動物組織細(xì)胞中。膽固醇不僅是構(gòu)成生物膜的重要成分，同時也是生物體內(nèi)合成多種類固醇激素與維生素D的前體，還可以作為膽汁酸生物合成的原料[1-3]。然而，不同動物合成膽固醇的能力存在顯著差異，蝦蟹等甲殼動物不具備自身合成膽固醇的能力[4-5]，其體內(nèi)膽固醇必須從外界攝取;大部分脊椎動物體內(nèi)膽固醇主要來自于組織細(xì)胞的自身合成[6]。膽固醇合成可分為3個階段：碳單位甲羥戊酸合成、鯊烯合成、膽固醇生成[7]。乙酰CoA是膽固醇合成的直接原料，主要來自于葡萄糖、脂肪以及某些氨基酸的代謝，其中TCA循環(huán)是直接供給途徑[8]。3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A（HMG-CoA）還原生成甲羥戊酸是膽固醇合成的限速步驟，其中催化HMG-CoA發(fā)生還原反應(yīng)的β-羥-β-甲基戊二酰輔酶A還原酶（HMGCR）是這一步驟的關(guān)鍵酶，也是內(nèi)源性合成膽固醇的關(guān)鍵限速酶[9]，其活性將直接影響著膽固醇的合成速度。

HMGCR基因表達(dá)與酶活性受激素水平的調(diào)控[10]。試驗表明，甲狀腺激素[11]、胰島素[12]可以提高HMGCR基因的轉(zhuǎn)錄水平，而胰高血糖素則會降低該基因的轉(zhuǎn)錄[13]。糖皮質(zhì)激素和雌激素通過影響HMGCR的穩(wěn)定性來調(diào)節(jié)膽固醇的合成量[6]。HMGCR酶活性除受到激素影響外，還受自身膽固醇含量的反饋調(diào)節(jié)[14]。當(dāng)細(xì)胞中膽固醇含量較高時，會抑制該酶活性，從而減少內(nèi)源性膽固醇生成量。過高膽固醇含量也會加快該酶的降解，使細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量達(dá)到平衡，這種降解反應(yīng)依賴于跨膜區(qū)的泛素蛋白酶途徑[15]。與此相反，當(dāng)細(xì)胞中膽固醇含量較低時，該酶活性就會被激活，從而促進(jìn)內(nèi)源性膽固醇生成。體外試驗表明，膽固醇能在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)HMGCR[15]，當(dāng)細(xì)胞中膽固醇含量較低時，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的SCAP/SREBP復(fù)合物在SCAP護(hù)送下進(jìn)入高爾基體復(fù)合體，在位點1蛋白酶和位點2蛋白酶的作用下，該復(fù)合物釋放SREBP前體，SREBP進(jìn)入細(xì)胞核中，并與固醇反應(yīng)元件結(jié)合，從而促進(jìn)HMGCR基因的轉(zhuǎn)錄;當(dāng)細(xì)胞中膽固醇含量較高時，SREBP只能停留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，無法進(jìn)入細(xì)胞核中，同時那些已經(jīng)進(jìn)入到細(xì)胞核中的SREBP也會被分解，無法與固醇反應(yīng)元件結(jié)合，從而阻止HMGCR基因的轉(zhuǎn)錄[16-17]。研究表明，不同動物的調(diào)節(jié)方式可能不同，有些是在翻譯水平上調(diào)節(jié)（如大鼠），有些則是在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)（如倉鼠和?小鼠）[17]。

大量研究表明，膽固醇合成代謝與魚類健康有著密切關(guān)系[1]。HMGCR作為合成內(nèi)源性膽固醇的關(guān)鍵限速酶，越來越引起人們的關(guān)注。目前，人、鼠、雞、鴨、鵝等陸生動物以及斑馬魚、草魚等水生動物HMGCR基因序列已被成功克隆[18-19]。該研究應(yīng)用PCR方法克隆出虹鱒膽固醇合成關(guān)鍵限速酶HMGCR的部分mRNA序列，旨在為該酶的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗材料試驗用虹鱒（Oncorhynchus mykiss）來自當(dāng)年人工培育的同一批苗種，同種飼料飼喂。隨機(jī)選取3條規(guī)格一致（80 g左右）虹鱒，于超凈工作臺中采集肝臟（Hep）、腸道（Int）、胃（Sto）、脾臟（Spl）、腎臟（Kid）、肌肉（Mus）、鰓（Gil）、心臟（Hea）8種組織，裝入用0.1%DEPC水溶液預(yù)處理過的凍存管中，快速投入液氮中，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2試驗方法

1.2.1RNA提取及反轉(zhuǎn)錄。使用RNA提取試劑（Trizol Reagent）提取總RNA。試驗過程中應(yīng)嚴(yán)格防止RNase污染。采用1.0%瓊脂糖電泳檢測其完整性，Nano Vue微量紫外分光光度計檢測濃度和純度。為除去總RNA中所摻雜的基因組DNA，取1 μL總RNA，加入2 μL 5×DNA Eraser Buffer，用RNase Free dH2O補(bǔ)足至反應(yīng)體系為10 μL，42 ℃下反應(yīng)?2 min后置于4 ℃中保存。取10 μL上述反應(yīng)液，加入4 μL ?5×Prime script buffer、1 μL Prime Script RT Enzyme Mix和?1 μL RT primer Mix，用RNase Free dH2O補(bǔ)足反應(yīng)體系至?20 μL，37 ℃下反轉(zhuǎn)錄15 min，合成cDNA，85 ℃下反應(yīng)5 s后于4 ℃條件下保存。

1.2.2簡并引物的PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物測序。根據(jù)NCBI網(wǎng)站GenBank數(shù)據(jù)庫中大西洋鮭（Salmo salar）（NP001167390.1）、大菱鲆（Scophthalmus maximus）（AEO44579.1）、歐洲鱸（Dicentrarchus labrax）（AAR02862.2）和斑馬魚（Danio rerio）（AAI55136.1）4個物種的核酸序列，利用引物在線設(shè)計軟件CODEHOP（http：//blocks.fhcrc.org/codehop.html）設(shè)計簡并引物。經(jīng)Blast比對后，挑選簡并度較低的引物送交上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行合成。以HMGCR-U1和HMGCR-D1為引物（表1），進(jìn)行PCR擴(kuò)增。RCR產(chǎn)物經(jīng)?1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用膠回收試劑盒（Gel Extraction UF Kit）進(jìn)行切膠回收。取純化后的PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測序。將擴(kuò)增到的序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST比對，并對其序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。根據(jù)簡并引物PCR擴(kuò)增到的片段在NCBI網(wǎng)站中的Blastn比對結(jié)果，得到第一段mRNA序列。參考大西洋鮭mRNA序列，設(shè)計同源引物HMGCR-F1和HMGCR-R1（表1），進(jìn)行PCR擴(kuò)增取純化后PCR產(chǎn)物送至深圳華大基因進(jìn)行測序。將得到的結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST比對，得到第2段mRNA序列。借助DNASTAR Lasergene7生物軟件，對所得2個片段進(jìn)行合并，并對合并后的片段進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

1.2.3各組織HMGCR表達(dá)量的測定。利用Trizol（Invitrogen）法提取虹鱒肝臟（Hep）、腸道（Int）、胃（Sto）、脾臟（Spl）、腎臟（Kid）、肌肉（Mus）、鰓（Gil）、心臟（Hea）8種組織總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA第一模板鏈，作為熒光定量PCR模板，根據(jù)已獲得的HMGCR基因序列，借助生物軟件DNASTAR Lasergene7 PrimerSelect設(shè)計并篩選HMGCR SYBR Green Ⅱ 實時熒光實時定量 PCR引物，以β-actin為內(nèi)參，進(jìn)行相對定量（表2）。熒光定量 PCR 采用 SYBR Green Ⅱ 嵌合熒光法，所用試劑為SYBR Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time，TaKaRa，日本），反應(yīng)在Thermal cycler （Mastercycler ep realplex，Eppendorf，德國）儀器中進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系（20 μL）：SYBR Premix Ex TaqTM 10 μL，cDNA 1 μL，上下游特異性引物（10 mmol/L）各1 μL，DEPC-H2O 7 μL。熒光定量PCR反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃ 變性30 s，55 ℃ 退火35 s，72 ℃延伸40 s，40個循環(huán);95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。以β-actin為內(nèi)參，其中內(nèi)參其因的退火溫度為60 ℃。每個組織設(shè)3個平行組，基因相對mRNA水平采用 2-ΔΔCt法檢測。所有試驗數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。采用單因素方差分析（ANOVA），當(dāng)各處理組間存在顯著差異（P<0.05）時，采用Duncans檢驗進(jìn)行多重比較分析。數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析均使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行。

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