馬鈴薯瘡痂病鏈霉新變種的分離與生物學(xué)特性分析

馬建榮 余永紅 黎敬鴻 陳力暢 何海林

摘要[目的]研究土壤中分離到C9菌株的種類(lèi)歸屬和生物學(xué)特性。[方法]擴(kuò)增C9菌株的16S rDNA序列，并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育建樹(shù)。檢測(cè)C9菌株對(duì)不同碳源、氮源的利用能力，以及對(duì)不同抗生素、滲透壓的敏感性。利用GC-MS法測(cè)定C9菌株的脂肪酸組分，并擴(kuò)增其脂肪酸合成關(guān)鍵酶——3-酮脂酰ACP合成酶III（FabH）編碼基因，并進(jìn)行序列同源性分析。[結(jié)果]基于C9菌株的16S rDNA序列分析，結(jié)合分析其菌落形態(tài)特征，初步判斷C9菌株為馬鈴薯瘡痂病鏈霉菌（Streptomyces scabies）。但C9菌株的生理生化特征與已報(bào)道的S.scabies菌株有明顯差異，進(jìn)一步盆栽試驗(yàn)結(jié)果顯示C9菌株不能引起馬鈴薯瘡痂病，其染色體上也沒(méi)有擴(kuò)增獲得致病島（PAI）區(qū)域中致病性相關(guān)的基因，說(shuō)明該菌株不具有馬鈴薯瘡痂病致病性，為Streptomyces scabies的一個(gè)新變種。C9菌株的脂肪酸組成測(cè)定結(jié)果顯示其主要合成棕櫚油酸（C?16∶1）和棕櫚酸（C?16∶0），其不飽和脂肪酸總含量達(dá)36.2%，也符合馬鈴薯瘡痂病非致病株的特征。C9菌株基因組中fabH基因序列和編碼的氨基酸序列與Streptomyces scabies都具有極高的一致性。[結(jié)論]C9菌株為馬鈴薯瘡痂病鏈霉菌新變種。C9菌株為進(jìn)一步深入研究馬鈴薯瘡痂病鏈霉菌的基礎(chǔ)代謝機(jī)制或探索其致病機(jī)理提供了良好的材料。

關(guān)鍵詞馬鈴薯瘡痂病鏈霉菌;?16S rDNA;?脂肪酸組成

中圖分類(lèi)號(hào)S?182;Q?93文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611（2019）18-0139-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2019.18.037

開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Isolation and Biological Characteristics Analysis of a New Variety of Streptomyces Potato Scab

MA Jian-rong，YU Yong-hong，LI Jing-hong et al （Guangdong Food and Vocational College，Guangzhou，Guangdong 510520）

Abstract[Objective]To study the biological characteristics and classify the C9 strain isolated from soil.[Method]The 16S rDNA sequence of the C9 strain was amplified and phylogenetical tree was established.The ability of C9 strain to utilize different carbon sources and nitrogen sources，as well as sensitivity to osmotic pressure and different antibiotics，was examined.The fatty acid composition of C9 strain was determined by GC-MS，and the gene encoding the key enzyme for fatty acid synthesis，3-ketoacyl-ACP synthase III （FabH），was amplified and sequence homology analysis was performed.[Results]The C9 strain was classified as Streptomyces scabies based on the 16S rDNA sequence coupled with the colony morphology.However，the physiological and biochemical characteristics of the C9 strain were significantly different from those of the reported S.scabies strains.Moreover，the C9 strain showed no pathogenicity to cause potato scab by the pot tests，and the genes related to pathogenicity in PAI region were not amplified on its chromosome.All the results indicated that C9 strain was a new strain of Streptomyces scabies.The fatty acids composition of the C9 strain was analyzed further.The results showed that the strain mainly synthesized palmitoleic acid （C?16∶1） and palmitic acid （C?16∶0）.The total content of unsaturated fatty acid reached 36.2%，which also accorded with the characteristics of non-pathogenic strain of potato scab.Then the key gene of fatty acid synthesis，coding 3-ketoacyl ACP synthase III （FabH），was amplified and analyzed from the C9 strain genome.The results showed that the fabH gene sequence and the coded amino acid sequence were highly consistent with those of Streptomyces scabies.[Conclusion]The C9 strain was a new strain of Streptomyces scabies.The C9 strain provided a good material for further study on the basic metabolic mechanism of Streptomyces scab and its pathogenic mechanism.

Key wordsStreptomyces scabies;16S rDNA;Fatty acids composition

馬鈴薯是世界上除水稻、小麥和玉米外的第四大糧食作物，在蔬菜、飼料及工業(yè)原料領(lǐng)域均具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]。但隨著種植面積擴(kuò)大，馬鈴薯相關(guān)的微生物病害逐漸凸顯，其中馬鈴薯瘡痂病（potato common scab）是一類(lèi)重要的土傳病害，嚴(yán)重影響馬鈴薯塊莖的外觀品質(zhì)，造成嚴(yán)重的損失[2]。

馬鈴薯瘡痂病病原菌為鏈霉菌屬（Strptomyces spp.），國(guó)內(nèi)外報(bào)道的主要有S.scabies、S.acidiscabies和S.turgidiscabies，3種菌株生理生化特征差異明顯[2-5]。隨著研究深入，越來(lái)越多的鏈霉菌病原菌被發(fā)現(xiàn)，表明馬鈴薯瘡痂病菌種類(lèi)多，分布和組成復(fù)雜。對(duì)我國(guó)不同地區(qū)的瘡痂病原菌分析表明，在分離到的病原菌中除常見(jiàn)的致病菌株外，還發(fā)現(xiàn)S.bobili、S.galilaeus、S.enissocaesilis等新的馬鈴薯瘡痂病菌[6]。黑龍江省不同地區(qū)馬鈴薯瘡痂病病原菌有3種，其中S.scabies為主要病原菌，而且不同病原菌的致病力有明顯差異[7]。因此我國(guó)瘡痂病病原菌種類(lèi)及組成具有明顯的多樣性，不同地區(qū)或同一地區(qū)不同季節(jié)流行不同的病原鏈霉菌，明確特定地區(qū)的病原菌組成對(duì)了解及防治馬鈴薯瘡痂病十分必要，但目前未見(jiàn)對(duì)廣東地區(qū)該病原鏈霉菌的研究[5]。筆者通過(guò)對(duì)土壤中分離到的鏈霉菌進(jìn)行分析，鑒定其中的C9菌株為馬鈴薯瘡痂病鏈霉菌新變種，并分析了該菌株的生理生化?特性。

1材料與方法

1.1病原菌的分離

從廣東省廣州周邊馬鈴薯種植地塊采集土壤，取10 g樣品于90 mL無(wú)菌生理鹽水中，充分振蕩。靜置后去上清液進(jìn)行10倍系列稀釋?zhuān)x10-2、10-2、10-4 3個(gè)稀釋度，分別取0.1 mL涂布于改良高氏1號(hào)平板，30 ℃倒置培養(yǎng)5 d，挑選菌落形態(tài)不同的菌株劃線純化，重復(fù)3次。

1.2致病性測(cè)定

選擇健康馬鈴薯種薯經(jīng)75%乙醇溶液浸泡10 min進(jìn)行表面消毒，無(wú)菌操作切取含有芽眼的薯塊，播入裝有滅菌土的花盆中，每盆3塊。栽種60 d后，用待測(cè)菌株孢子稀釋液接種至花盆土壤，置于室溫中繼續(xù)培養(yǎng)30 d后檢測(cè)新生薯塊的發(fā)病情況[8]。

1.3生理生化特性測(cè)定

參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[9]和《鏈霉菌鑒定手冊(cè)》[10]中測(cè)定方法，對(duì)該菌株進(jìn)行碳源利用、氮源利用、纖維素利用、淀粉利用和蛋白酶產(chǎn)生能力等分析，并進(jìn)一步利用Biolog微孔板對(duì)多種生理生化特性及敏感性等進(jìn)行測(cè)定。

1.416S rDNA序列分析與致病相關(guān)基因分析

病原菌總DNA采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司）的方法提取。PCR擴(kuò)增用引物見(jiàn)表1，擴(kuò)增條件：① 98 ℃預(yù)變性2 min;② 98 ℃變性20 s;③ 56 ℃退火20 s;?④ 72 ℃延伸20 s;⑤ 重復(fù)②～④35個(gè)循環(huán)。將PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)，16S rDNA擴(kuò)增片段送上海生工公司測(cè)序，將得到的序列進(jìn)行Blast比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.5細(xì)胞脂肪酸組成分析

在合成V號(hào)培養(yǎng)基中，培養(yǎng)馬鈴薯瘡痂病鏈霉菌，離心收集菌體，按照文獻(xiàn)[11-12]的方法，提取細(xì)菌的脂肪酸，并轉(zhuǎn)化為脂肪酸甲酯（樣品3個(gè)重復(fù)）。樣品送華南農(nóng)業(yè)大學(xué)測(cè)試中心進(jìn)行脂肪酸組成GC-MS?分析。

2結(jié)果與分析

2.1C9菌株形態(tài)與16S rDNA序列分析

從馬鈴薯栽種土壤中采樣，稀釋后涂布于高氏1號(hào)培養(yǎng)基，培養(yǎng)后獲得多種單菌落。其中C9菌株菌絲為絲狀，革蘭氏染色陽(yáng)性（圖1 a），培養(yǎng)后期生成灰色孢子，孢子鏈成螺旋狀（圖1 b）。

為確定C9菌株種屬歸類(lèi)，利用細(xì)菌16S rDNA通用引物，以C9菌株的總DNA為模板，擴(kuò)增獲得約1.5 kb的16S rDNA序列（圖2 a），連接T-載體后獲得質(zhì)粒pYYH-1，并送樣測(cè)序獲得16S rDNA全序列。進(jìn)一步將測(cè)序結(jié)果在NCBI中GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)Blast分析，結(jié)果顯示該序列與馬鈴薯瘡痂病鏈霉菌同源性最高。選取與比對(duì)序列相似性大于95%的菌株和已經(jīng)報(bào)道的馬鈴薯瘡痂病鏈霉菌菌株16S rDNA序列，利用MEGA 7.0軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析（NJ法）（圖2 b）。結(jié)果顯示C9菌株與馬鈴薯瘡痂病鏈霉菌（Streptomyce scabiei）標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC49173的親緣關(guān)系最近，相似性為?99.7%。這表明C9菌株為馬鈴薯瘡痂病鏈霉菌（Streptomyce scabiei）菌株。

2.2C9菌株生理生化特性分析

進(jìn)一步分析C9菌株的生理生化特征，結(jié)果顯示，C9菌株能以葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、甘露糖、棉子糖、肌酐、肌醇等作為唯一碳源生長(zhǎng)，但不能利用果糖、阿拉伯糖、蔗糖、甘油等為單一碳源生長(zhǎng)。C9菌株能以脯氨酸、甲硫氨酸、甘氨酸等為唯一氮源生長(zhǎng)，但不能以組氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等為唯一氮源。C9菌株對(duì)青霉素、四環(huán)素、林肯霉素、萬(wàn)古霉素等抗生素以及結(jié)晶紫、四唑紫、鹽酸胍等化合物敏感，同時(shí)該菌株在含有10%NaCl培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng)，pH<5.5不能生長(zhǎng)。C9菌株產(chǎn)生黑色素和H2S氣體，不產(chǎn)生可溶性色素，產(chǎn)生淀粉酶和纖維素酶，但不產(chǎn)生蛋白酶。綜合分析以上生理生化特性，顯示C9菌株與已報(bào)道的典型馬鈴薯瘡痂病鏈霉菌有明顯差異，說(shuō)明該菌株為新的菌株[2，13-14]。

2.3C9菌株的致病性分析

為分析C9菌株是否對(duì)馬鈴薯具有致病性，采用致病性盆栽試驗(yàn)，在馬鈴薯種植30 d后觀察新生薯塊發(fā)病情況。結(jié)果顯示，C9菌株不能對(duì)盆栽馬鈴薯致病，未出現(xiàn)瘡痂癥狀（圖3）。

馬鈴薯瘡痂病病原菌多種多樣，寄主范圍也較廣，但致病因子均存在于染色體上的致病島（PAI）區(qū)域。當(dāng)前報(bào)道的PAI區(qū)域基因主要包括txtA基因、txtB基因、txtC基因、壞死誘導(dǎo)蛋白nec1基因和致病因子tomA基因等[15-17]。為研究C9菌株不能使盆栽馬鈴薯出現(xiàn)瘡痂癥狀的原因，分別擴(kuò)增了該菌株基因組上這幾個(gè)致病相關(guān)的基因，但結(jié)果均未擴(kuò)增到目的基因，說(shuō)明C9菌株可能沒(méi)有相關(guān)的致病因子或致病島PAI，這極可能是該菌株不能引物馬鈴薯致病的重要?原因。

2.4C9菌株的脂肪酸組成分析

細(xì)菌采用II型脂肪酸合成機(jī)制合成脂肪酸，每步反應(yīng)都由特定的酶催化完成。而脂肪酸是細(xì)菌細(xì)胞膜的重要組成物質(zhì)，具有靈敏度高、成分高度保守和含量穩(wěn)定等特點(diǎn)[18]。目前在細(xì)菌中已發(fā)現(xiàn)300多種脂肪酸，其碳鏈長(zhǎng)度、雙鍵位置和功能團(tuán)組合的不同使其成為有效的分類(lèi)標(biāo)記，而脂肪酸組成和含量與微生物的遺傳變異、耐藥性、致病性等有極為密切的關(guān)系[19]。研究表明，鏈霉菌的脂肪酸組成可以作為馬鈴薯瘡痂病鏈霉菌是否為致病菌的重要評(píng)價(jià)指標(biāo)[20]。

為此，測(cè)定了C9菌株的脂肪酸組成。結(jié)果顯示，C9菌株的脂肪酸組成較為復(fù)雜，檢測(cè)到約20種不同結(jié)構(gòu)的脂肪酸，包括直鏈飽和脂肪酸、支鏈飽和脂肪酸、直鏈不飽和脂肪酸和環(huán)丙烷脂肪酸等，檢測(cè)到的脂肪酸鏈長(zhǎng)包括12碳到18碳。不同脂肪酸組分含量不同，其中含量最高的棕櫚油酸（C?16：1）占總脂肪酸組分的28.4%，其次是棕櫚酸（C?16：0）占?18.0%。細(xì)菌的支鏈脂肪酸和不飽和脂肪酸在調(diào)節(jié)膜的流動(dòng)性方面發(fā)揮重要作用，C9菌株產(chǎn)生支鏈脂肪酸包括12-甲基十三烷酸（isoC?14：0）、13-甲基十四烷酸（isoC?15：0）和12-甲基十四烷酸（anteisoC?15：0）等，支鏈脂肪酸總含量占比33.6%。不飽和脂肪酸包括棕櫚油酸、順-11-異油酸等，總含量占比36.2%（圖4）。

2.5C9菌株的3-酮脂酰ACP合成酶III的同源性分?析

脂肪酸合成是細(xì)菌的基礎(chǔ)代謝，脂肪酸合成相關(guān)的基因簇往往具有一定的保守性。3-酮脂酰ACP合成酶III（FabH）催化脂肪酸合成的起始反應(yīng)，其編碼基因是細(xì)菌生長(zhǎng)的必需基因[21]。為進(jìn)一步研究C9菌株的種屬歸類(lèi)，以表1中的fabH up和fabH down引物，以C9菌株的總DNA為模板，擴(kuò)增獲得該菌株的fabH基因。測(cè)序結(jié)果顯示，C9菌株的fabH基因與馬鈴薯瘡痂病鏈霉菌（Streptomyces scabies）的fabH基因序列一致性為98.8%，其編碼蛋白的氨基酸序列一致性達(dá)99.7%。這再次證明該研究分離獲得的C9菌株為馬鈴薯瘡痂病鏈霉菌。

3結(jié)論與討論

該研究對(duì)從土壤中分離到的一株鏈霉菌C9菌株進(jìn)行了分析。首先分析了該菌株的16S rDNA序列，結(jié)果顯示C9菌株與馬鈴薯瘡痂病鏈霉菌（Streptomyces scabiei）的16S rDNA序列高度同源，結(jié)合菌落形態(tài)特征，初步確定該菌株為馬鈴薯瘡痂病鏈霉菌。

但進(jìn)一步生理生化分析顯示C9菌株與文獻(xiàn)報(bào)道的馬鈴薯瘡痂病鏈霉菌多種菌株都不完全一致[13-14]，提示該菌株可能是一個(gè)新菌株。采用盆栽法檢測(cè)C9菌株對(duì)馬鈴薯的致病性，結(jié)果顯示該菌株沒(méi)有致病性，致病性相關(guān)的PAI基因檢測(cè)結(jié)果也顯示陰性，進(jìn)一步說(shuō)明該菌株不同于文獻(xiàn)報(bào)道的馬鈴薯瘡痂病的致病菌株。

由于脂肪酸組成可以作為微生物分類(lèi)鑒定的重要指標(biāo)，測(cè)定了C9菌株的脂肪酸組成。結(jié)果顯示，與報(bào)道的鏈霉菌相比，該菌株的支鏈脂肪酸相對(duì)較低，不飽和脂肪酸含量相對(duì)較高，其特點(diǎn)符合Kinkel等[20]報(bào)道的馬鈴薯瘡痂病非致病菌。該結(jié)果與盆栽致病性檢測(cè)結(jié)果相吻合，也表明C9菌株為一個(gè)非致病性菌株。基于細(xì)菌脂肪酸合成途徑的保守性，進(jìn)一步擴(kuò)展了C9菌株的脂肪酸合成關(guān)鍵基因——3-酮脂酰ACP合成酶III（FabH），結(jié)果顯示該基因序列與馬鈴薯瘡痂病鏈霉菌（Streptomyces scabiei）的fabH序列具有高度一致性，而兩者編碼的氨基酸序列也幾乎一致，再次證明C9菌株為馬鈴薯瘡痂病鏈霉菌，但該菌株沒(méi)有致病性，為非致病性變種。該研究發(fā)現(xiàn)的C9菌株可作為研究材料，用于馬鈴薯瘡痂病鏈霉菌的基礎(chǔ)代謝研究，同時(shí)還可通過(guò)比較致病株和非致病株的基因組信息研究，探索馬鈴薯瘡痂病鏈霉菌致病的分子機(jī)制。

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