司愛君 陳紅 余渝 孔憲輝 劉麗 王旭文 田琴

新疆生產建設兵團棉花遺傳改良與高產栽培重點實驗室，新疆石河子 832000）

摘要：干旱、高鹽和低溫等非生物逆境是影響農作物產量的重要因素。WRKY轉錄因子由于其過量表達能夠提高植物抗旱、耐鹽、耐低溫、抗凍甚至抵抗重金屬等逆境脅迫的能力，因此被作為應用基因工程途徑進行植物抗逆性狀改良的理想候選基因。在分子育種中，增加1個關鍵的轉錄因子的調控能力，能同時激活多個功能基因表達，從而提高植株綜合抗逆性。本文主要綜述了WRKY轉錄因子的結構、功能、轉錄調控機制研究以及近年來國內外WRKY轉錄因子新基因的發(fā)現及其在培育抗逆性轉基因植物中的應用，以期為植物抗逆分子育種改良提供參考。

關鍵詞：WRKY;轉錄因子;轉基因;非生物脅迫;抗逆育種

中圖分類號： Q786;S332文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2019）16-0009-05

收稿日期：2018-05-09

通信作者：田琴，碩士，副研究員，主要從事棉花遺傳育種研究。E-mail：tq2005@126.com。干旱、低溫和高鹽等非生物逆境脅迫是農業(yè)生產中嚴重的自然災害，嚴重影響了植物的生長發(fā)育及農作物的產量。為了適應和抵消非生物脅迫對自身的影響，植物體建立了一系列信號傳導和調控的分子機制，通過相關轉錄因子的表達進而調節(jié)下游基因的大量表達，以提高植物應對逆境脅迫的能力。轉錄調控因子在植物的生長發(fā)育和耐逆抗病過程中發(fā)揮著極其重要的調控作用，與逆境相關、參與信號傳遞途徑及基因表達調控過程的轉錄因子主要包括5個家族：MYB、bZIP（basic leucine zippe）家族、AP2/EREBP家族、WRKY（因含有高度保守的核心氨基酸序列WRKYGQK而命名）、NAC（因其N端為保守的大約150個氨基酸NAC結構域命名）[1]。

WRKY是一類鋅指型轉錄因子，主要存在于植物中，不僅在各種生物脅迫防衛(wèi)反應中發(fā)揮作用，也參與調控多種非生物（如機械傷害、低溫、干旱等）脅迫反應，但關于WRKY在非生物脅迫中的研究沒有在生物脅迫中的研究廣泛。WRKY轉錄因子作為干旱、低溫等脅迫應答的主要成分，可與下游基因啟動子中的順式作用元件特異性結合，調節(jié)一系列依賴該順式作用元件的抗逆功能基因以特定的強度在特定的時間與空間表達，進而增強植物對干旱、低溫以及高鹽等逆境的抗性。因此，傳統(tǒng)育種結合轉基因操作等方法用以提高植物的脅迫耐受性，培育抗逆植物新種質，選育抗逆新品種，改良農作物的抗逆性，已成為近年來植物抗逆遺傳育種研究的熱點之一。本文主要綜述WRKY轉錄因子的結構、功能，以及近幾年來國內外對WRKY轉錄因子的研究進展，并對WRKY轉錄因子在農業(yè)培育抗逆轉基因植物中的應用進行概括。

1WRKY轉錄因子的結構特點與功能

1.1WRKY轉錄因子的結構域及W-box（W盒）元件

高等植物典型的轉錄因子一般由4個功能區(qū)域組成，即DNA結合域、轉錄調控域、核定位信號和寡聚化位點。根據轉錄調控因子的DNA結合結構域（DNA-binding domains，DBDs）可將他們分為若干個家族，并以其DNA結構域的名字命名，例如AP2/ERF、WRKY、NAC等[1]。在WRKY家族中，最主要的結構特點是各成員的DNA結合域中都含有至少1個WRKY結構域，是由1段大約60個高度保守的氨基酸殘基組成的多肽序列，在WRKY殘基核心序列之后接有1個C2H2（C-X4-5-C-X22-23-H-X1-H）或C2HC（C-X7-C-X23-H-X1-C）類型的鋅指基序，并且所有成員均含有7個絕對保守的氨基酸殘基WRKYGQK[2-3]，由此得名為WRKY。隨后發(fā)現在該結構域的C端存在鋅指結構。另外，WRKY結構域所對應的編碼序列中都含有1個位置高度保守的內含子，但是其存在的意義目前還不清楚[2，4]。也有研究表明，在保守區(qū)之外，成員中其余氨基酸組成的同源性并不高，這也可能是不同WRKY基因具有調節(jié)不同靶基因的結構基礎[5]。WRKY蛋白質通過特異性地結合靶基因啟動子的W-box而實現其分子生物學功能[6-7]，W-box的特定序列是C/TTGACC/T，是WRKY與DNA特異結合的最小的共有序列，其中TGAC為W-box的核心序列。生物信息學和植物轉錄因子的功能研究都證明與脅迫應答有關的基因啟動子區(qū)域都含有1個或幾個W-box序列[6]。由于WRKY轉錄因子結構的多樣性，因此WRKY蛋白質能夠廣泛地參與植物基因表達的調控。

1.2WRKY轉錄因子的多樣化功能

植物在生長過程中不僅會面臨病害等生物逆境的脅迫，還會遭遇干旱、冷害及高溫等非生物逆境的脅迫。在長期的進化過程中，植物形成了自身防御系統(tǒng)以抵御來自外界的傷害，越來越多的報道表明關于WRKY轉錄因子的這個多基因家族在植物防衛(wèi)反應的轉錄調控中發(fā)揮重要的作用。WRKY基因在植物體內是誘導型表達的，目前已識別和克隆的WRKY基因的表達受多種不同環(huán)境條件的誘導，如病原體、真菌誘導子、高鹽、干旱、低溫、創(chuàng)傷、營養(yǎng)不足、衰老、種子和毛狀體發(fā)育、胚胎發(fā)生、機械脅迫、各種病程相關信號分子、植物不同發(fā)育階段及植物代謝等，其表達具有快速、瞬時等特點，同時還具有組織特異性。針對非生物逆境的脅迫，植物發(fā)展了一套非常復雜而完善的調控網絡，WRKY基因家族在此調控網絡中起著重要的調控作用。然而，WRKY轉錄因子在非生物脅迫中的作用研究得還不夠深入和廣泛，遠遠落后于其在生物脅迫的研究，這可能是由于非生物脅迫信號通路非常復雜，且缺少相關突變體造成的[8]，并且關于WRKY轉錄因子的研究大多集中于擬南芥、水稻和煙草等模式植物，而在重要經濟作物中研究較少。近幾年，對WRKY的非生物脅迫的研究也成為近幾年來生物學研究的熱點。WRKY被證明是許多信號通路重要的成分，包括脫落酸（ABA）、水楊酸（SA）、茉莉酸（JA）/乙烯（ET）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、鈣調蛋白、組蛋白去乙酰酶[9-10]等，在各種應激信號通路中與不同的蛋白質相互作用起著多種功能作用，盡管它們的相互作用方式還有待確定。

2WRKY轉錄因子對非生物脅迫的應答與轉錄調控機制

2.1WRKY轉錄因子在非生物逆境脅迫下的表達模式

植物的非生物脅迫主要包括干旱、鹽害、高溫、低溫等因素，WRKY蛋白質通過復雜的信號轉導途徑參與植物的非生物脅迫應答，并具有重要的調控作用。與生物脅迫研究相比，關于WRKY轉錄因子參與非生物脅迫應答的研究相對較少。最近的研究表明，很多WRKY基因能強烈而迅速地響應某些非生物脅迫，如機械傷害、干旱、鹽害、低溫和滲透脅迫，且單個WRKY基因可能同時參與多種逆境應答反應。

NaCl脅迫處理的基因芯片及qRT-PCR分析顯示，擬南芥根部有18個AtWRKY基因誘導表達[11]。WRKY57在干旱脅迫下表達量提高，它通過提高ABA水平增加擬南芥的耐旱性[12]。用NaCl處理過的擬南芥，AtWRKY25和AtWRKY33的表達量都有所提高，進一步研究表明，無論是AtWRKY25還是AtWRKY33的超表達都能提高擬南芥植株的耐鹽能力[13]。擬南芥WRKY25、WRKY26、WRKY33和WRKY39基因參與植物的熱脅迫應答反應，AtWRKY25和AtWRKY33能夠被ABA、干旱和高鹽誘導，Atwrky25單突變體和Atwrky25Atwrky33雙突變體都對高鹽敏感[14-15];而超表達AtWRKY25和AtWRKY33能夠增加植株的高鹽抗性[15]。在煙草中過量表達TaWRKY10，提高了轉基因植株的干旱及耐鹽受性，表明該基因受多重脅迫的誘導表達[16]。AtWRKY70和AtWRKY54的單突變體能增強其對滲透脅迫的耐受性，雙突變體明顯地增強這一特性，同時它們還表現出對干旱、高鹽、低溫脅迫的耐受性[17]。Hu等發(fā)現AtWRKY8與VQ9通過相互拮抗調控植物的耐鹽性，鹽脅迫使得AtWRKY8基因表達量上調，突變體則表現出對鹽敏感的表型，相反vq9突變體則表現出耐鹽性[18]。在植株的生長和發(fā)育過程中，Atwrky63突變體對ABA處理表現出超敏反應，由于氣孔的閉合對ABA不敏感，該突變體還表現出不耐旱[19]。將TaWRKY79轉入擬南芥，該植株受NaCl和ABA的誘導，表現出對鹽、離子脅迫和ABA的耐受性，并檢測到ABA相關基因ABA1、ABA2、ABIl和ABI5表達量上調，也進一步表明該轉錄因子依賴于ABA信號途徑發(fā)揮作用[20]。Babitha等研究發(fā)現，AtbHLH17和AtWRKY28基因在干旱和氧化應激條件下表達量升高，轉基因株系表現出對NaCl、甘露醇和氧化應激的耐受性增強，過表達轉基因株系的幾個下游靶基因在多種應激條件下上調[21]。另有研究表明，AtWRKYl8、AtWRKY40和AtWRKY60與ABA信號相關，并且在種子萌發(fā)期和萌發(fā)后期，它們作為ABA信號的負調控因子發(fā)揮作用，其中，AtWRKY40是3個WRKY蛋白質的負調控中心，它通過結合幾個重要的ABA響應基因啟動子區(qū)域的W-box從而直接抑制ABA相關基因的表達[22]。越來越多的研究表明，WRKY基因參與傷害、干旱、高溫、低溫等多種非生物脅迫應答反應[7，9，12，14-15，23-26]。

2.2WRKY轉錄因子下游靶基因的鑒定

為了更好地研究WRKY轉錄因子的生物學功能及可能參與的信號通路，鑒定其下游靶基因變得很有必要。通過比較分析基因芯片不同基因型的表達模式，可以從基因組規(guī)模上獲得潛在的WRKY基因的靶基因。舉例來講，Atwrky34-1突變體在4 ℃低溫處理48 h后，有12個基因在成熟花粉中的表達與野生型有顯著差異[24]?；蛐酒治鲆沧C實了與野生型相比，幾個ABA信號通路基因（如AtABI5、AtABI3）的表達在Atwrky2突變體中顯著增強[27]。通過cDNA-AFLP試驗證實了FRK1/SIRK是AtWRKY6的靶基因，這些基因在植物葉片衰老過程中協(xié)同作用[28]。這些方法也可以用來鑒定其他參與非生物脅迫WRKY基因的下游靶基因。然而這些方法只能提供給我們一些候選的靶基因，這些基因是否是WRKY蛋白質的直接靶基因還需試驗確定，所以還需要進一步用其他方法確定其直接靶基因，如染色質免疫共沉淀技術（ChIP），ChIP技術已經被證實是一種有效的動態(tài)條件下檢測生物體內DNA-蛋白質和蛋白質-蛋白質相互作用的方式[29]。通過使用這種技術，已有越來越多的WRKY轉錄因子在非生物逆境脅迫下的靶基因被鑒定。如一些重要的ABA信號通路中的調控基因，AtABF4、AtABI4、AtABI5、AtDREB1A、AtMYB2和AtRAB18已被證實與AtAD1A（AtWRKY40）啟動子上游的W盒序列直接相互作用[22]。AtWRKY6和AtWRKY42都可以通過結合到AtPHO1的啟動子的W盒序列而直接抑制AtPHO的表達[30]。通過染色質免疫共沉淀發(fā)現，早期干旱和ABA誘導旋蒴苣苔（Boea hygrometrica）BhWRKY1在植物體內可以特異地結合到BhGolS1基因啟動子序列4個W盒上[31]。通過鑒定WRKY轉錄因子下游的直接作用基因，可以幫助我們了解脅迫誘導下植物的信號通路作用機制?？紤]到大量的WRKY蛋白質及其在不同信號通路中的不同作用，仍需要大量工作來鑒定其靶基因相應的應答途徑。

值得一提的是，許多研究顯示WRKY轉錄因子可以結合到自身啟動子序列的W盒上進行自調節(jié)和交叉調節(jié)。染色質免疫沉淀（ChIP）研究顯示PcWRKY1能結合其自身以及PcWRKY3啟動子的W盒[32]。凝膠遷移阻滯試驗（EMSA）顯示AtWRKY18和AtWRKY40都可以識別AtWRKY60基因上游啟動子的W盒序列，同時激活AtWRKY60在原生質體中的表達，表明AtWRKY60可能是ABA信號通路中AtWRKY18和AtWRKY40的直接靶基因[33]。最近，ChIP-qPCR試驗又證明AtWRKY33可以通過直接結合在自身的啟動子序列上調節(jié)自身的表達[34]，結果表明，WRKY轉錄因子之間普遍存在著自調節(jié)與交叉調節(jié)。

2.3WRKY轉錄因子互作蛋白質的鑒定

為了研究WRKY轉錄因子是如何參與到復雜的植物逆境脅迫反應中的，利用酵母雙雜交技術篩選或其他技術進行蛋白質相互作用的鑒定是非常有必要的。已有許多WRKY轉錄因子被證實是重要的信號通路中的組成部分，然而它們的相互作用方式還有待確定。到目前為止，已有研究證實WRKY轉錄因子在各種信號通路中與不同的蛋白質結合（如MAP激酶、MAP激酶激酶、組蛋白去乙?；?、鈣調蛋白等），從而行使多種功能作用[8，35]。在脅迫響應和信號轉導過程中，WRKY轉錄因子被各種磷酸化MAPKs，最終調節(jié)植物脅迫應答基因的激活。AtWRKY38和AtWRKY62共同作用于組蛋白脫乙酰酶HDA19，最終調節(jié)植物防御反應。因此，組蛋白脫乙酰酶可能在植物脅迫反應中維持組蛋白的適當乙酰化狀態(tài)上發(fā)揮重要作用。WRKY轉錄因子還能形成具有功能的同源或異源二聚體發(fā)揮它們的作用，不同WRKY轉錄因子之間的異二聚體形成可能對它們DNA結合活性有正面或負面的影響[9，36]。在非生物逆境的研究中，有研究表明WRKY轉錄因子通過蛋白質-蛋白質進行相互作用，如AtWRKY6基因可與同源基因AtWRKY42在內的十幾種蛋白質相互作用，過表達這2個基因都能誘導ProPHO1 ∶GUS強烈表達。此外，在低磷條件下，AtWRKY6與未知蛋白相互作用可被26S蛋白酶泛素化降解[30]。除了蛋白質之間的相互作用，在擬南芥中AtWRKY18、AtWRKY40和AtWRKY60作為ABA受體，也可以與鎂原卟啉IX螯合酶H亞基（CHLH/ABAR）形成復合體[22，36]。綜上所述，鑒定WRKY轉錄因子的互作蛋白質有助于識別WRKY蛋白質在信號通路中所發(fā)揮的作用。

3WRKY轉錄因子在非生物脅迫抗逆育種中的應用

近年來，越來越多的WRKY基因被報道參與非生物逆境應答，不僅包括模式植物擬南芥及煙草，還包括水稻、小麥、大麥、葡萄、大豆、棉花、茄子、黃瓜、甜高粱、甜菜、菜豆、灌木等多種作物，且大多數已通過基因敲除或過表達的方式進一步驗證了其在植物非生物脅迫中的調控作用。從4 ℃處理的水稻cDNA文庫中分離出13個WRKY基因，Northern印跡分析顯示，其中10個OsWRKY基因在NaCl、PEG、低溫（4 ℃）及高溫（42 ℃））非生物脅迫處理中差異表達[37]。在熱擊啟動子Hsp101驅動下OsWRKY11過表達可以提高水稻的耐熱性和耐旱性[38]。OsWRKY45的過表達提高了擬南芥轉化植株的抗鹽抗旱性，同時也提高了植株的抗病能力[39]。OsWRKY74的過表達不僅顯著增強轉基因植株對P缺乏的耐受性，還表現出比WT植物更多的Fe積累及冷應答基因的上調，說明OsWRKY74在調節(jié)磷穩(wěn)態(tài)與鐵缺乏以及水稻冷脅迫中起著重要作用[40]。小麥中分離的15個WRKY基因中有8個在低溫、高溫、NaCl及PEG處理下誘導表達[41]。小麥TaWRKY1和TaWRKY33的過表達能激活逆境脅迫相關的下游基因，不僅能提高發(fā)芽率，而且促進了擬南芥根的生長[42]。大麥WRKY38基因在冷害和干旱脅迫中表達，表明其參與調控冷害和干旱脅迫信號途徑[43]。過表達葡萄VvWRKY11的擬南芥幼苗受甘露醇誘導增加了對水分脅迫的耐受性[44]。將大豆GmWRKY21、GmWRKY54、GmWRKY13在擬南芥中異源表達，與野生型植株相比，GmWRKY21轉基因植株的耐冷性增強，GmWRKY54轉基因植株的抗鹽抗旱能力增強;而GmWRKY13的過表達增加了擬南芥對鹽和旱的敏感性，減少了對ABA的敏感性[45]。與野生型相比，過表達大豆GmWRKY20的擬南芥轉基因植株表現出對ABA更為敏感，并增強了其干旱脅迫耐受性[26]。GmWRKY47和GmWRKY58基因的表達受干旱及高鹽的調節(jié)[46]。GhWRKY41在煙草中過表達能增強煙草的干旱和鹽脅迫耐受性[47]。GhWRKY25在本氏煙草中的過表達降低了植物對干旱脅迫的耐受性，增強了對鹽脅迫的耐受性[48]。GhWRKY34在擬南芥中過表達能增強轉基因植株對鹽脅迫的耐受性[49]。Ding等鑒定出112種雷蒙德氏棉和109種亞洲棉的WRKY基因，并對參與特定纖維發(fā)育過程的WRKY基因及其表達模式進行了分析[50]。Yang等對茄子中（Solanum melongena L.）的50個WRKY基因及水茄（Solanum torvum）中的62個WRKY基因進行了初步功能分析[51]。在棉花中，GhWRKY44不僅正向調節(jié)病原體誘導的植物病害抗性，而且其表達還能被非生物脅迫和不同信號分子誘導[52]?？拙S龍等基于甜菜基因組信息分析了鹽脅迫和熱脅迫下甜菜WRKY基因家族（Bv WRKYs）的組織特異性表達譜和表達模式[53]。水稻OsWRKY71響應于冷脅迫表達量上調，其啟動子受冷誘導表達，并通過調節(jié)下游靶基因在耐冷中起著正調控作用[54]。黃瓜CsWRKY46賦予轉基因植物耐寒性并依賴ABA正向調節(jié)冷信號傳導途徑[55]。甜高粱SbWRKY1和SbWRKY2基因在干旱脅迫時期均表達上調，說明這2個基因可能在甜高粱的干旱脅迫中發(fā)揮作用[56]。Wu等從G19833菜豆的基因組序列草圖中鑒定了88個完整的PvWRKY蛋白質，并使用qRT-PCR檢測了19個對干旱脅迫有反應的WRKY基因，其中11種下調，8種在干旱脅迫下上調[57]。隨著分子生物學技術的發(fā)展及植物遺傳轉化技術的建立，WRKY基因將廣泛應用于農業(yè)育種。

4展望

在過去的十幾年中，相關研究報道詳細闡述了WRKY轉錄因子超家族子參與多種生物脅迫反應、植物生長發(fā)育和生理反應，包括胚胎發(fā)育、種皮形成、毛狀體發(fā)育、葉片衰老調控、生物合成途徑調控和激素信號傳遞等[58]。鑒于WRKY家族的多樣化功能，關于WRKY轉錄因子在非生物逆境如干旱、低溫和營養(yǎng)缺乏條件下的功能研究將會越來越多，且試驗材料不再限于模式植物，而是擴展到了各類植物，尤其是作物中的研究。此外，植物的耐逆性狀是多基因控制的復雜性狀，轉錄因子不僅可以調控多個與同類性狀有關基因的表達，還能通過增強一些關鍵的調節(jié)因子的作用來促進這些耐逆相關基因的作用。因此，通過轉基因技術將轉錄因子轉入植物是一種更為有效的方法和途徑，可使植物獲得綜合抗逆的根本改良，此方法對于培育植物抗逆品種，特別是培育抗旱、抗鹽和抗寒的植物品種具有重要意義。

得益于生理學、化學遺傳學、分子計算學和信息生物學等領域技術的飛速發(fā)展，能詳細了解到WRKY轉錄因子對植物非生物脅迫反應各個方面的復雜機制。借助于基因功能獲得和功能缺失的突變體技術和轉基因技術，WRKY轉錄因子的具體功能將會被人們所熟知。為了更好地了解它們在非生物脅迫中的作用，識別相互作用共同調節(jié)下游靶基因轉錄的WRKY蛋白質非常重要。隨著科學技術的不斷突破，WRKY轉錄因子在植物生命進程的信號調控網絡將逐漸清晰地呈現出來。采用酵母雙元雜交系統(tǒng)及染色質免疫親和沉淀分析等方法，可分析WRKY轉錄因子在應答不同信號途徑的特異性DNA結合位點，解析WRKY蛋白質特異調控靶基因表達的方式，并有效闡明WRKY基因參與調控靶基因表達的分子機制。這方面的研究對植物的分子改良具有重要的理論和實際意義，對農業(yè)生產具有很大益處。

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