肝癌相關(guān)指征在化學(xué)誘發(fā)小鼠肝癌過程中的動態(tài)研究

陳 峰，周 磊，蘇 靜，張大維*

(1.吉林省腫瘤醫(yī)院，長春 130000； 2.長春中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院， 長春 130000； 3.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，長春 130000)

惡性腫瘤作為世界上危害人類生命健康最嚴(yán)重的疾病之一，一直是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)受到廣泛重視的研究課題[1]。肝癌的發(fā)生與免疫功能有著密切的關(guān)系，免疫防御功能的降低和免疫監(jiān)視功能低下易造成體內(nèi)發(fā)生腫瘤[2]。肝癌是一種常見的惡性腫瘤，具有死亡率高、轉(zhuǎn)移性強等特點[3-5]。隨著科學(xué)日新月異的發(fā)展，手術(shù)、TACE(肝動脈化療栓塞)、局部治療、靜脈化療、生物靶向治療等多種治療方式能夠顯著提高肝癌患者的生活質(zhì)量，延長部分患者的生命，但適應(yīng)者數(shù)量有限，且術(shù)后恢復(fù)效果不佳，綜合而言，肝癌的病死率仍居高不下，治療效果欠佳[6]。因此深入研究肝癌的發(fā)生機制，了解肝癌發(fā)生過程中機體的變化，能夠為后續(xù)肝癌的監(jiān)控和治療提供重要的依據(jù)和治療策略[7-9]。建立肝癌動物模型是深入肝癌研究的前提條件，化學(xué)誘導(dǎo)法、原位移植法、基因修飾法是常見的三種建模方式[10]。其中化學(xué)誘發(fā)以操作便捷、價格低廉、易成型且肝癌發(fā)生過程與人類相似等特點，被廣泛應(yīng)用，而化學(xué)誘發(fā)中尤以DEN(二乙基亞硝銨)的效果最佳，DEN 是一種屬于N-亞硝基的有機物質(zhì)，能夠誘導(dǎo)很多組織形成腫瘤，例如：肝、胃、造血系統(tǒng)、肺等多種組織[11-13]。利用DEN進(jìn)行誘導(dǎo)，可對肝產(chǎn)生嚴(yán)重的損傷，具有較強的致癌性、致畸性和突變性，最直接的表現(xiàn)是中性粒細(xì)胞浸潤，廣泛的小葉出血性壞死，肝細(xì)胞異常分裂，膽管增生，纖維化，和橋接壞死，并最終導(dǎo)致肝癌[14]。據(jù)研究表明，DEN致癌劑聯(lián)合CCL4(四氯化碳)促癌劑能夠縮短誘導(dǎo)周期，同時能夠減少模型動物的死亡率，大大提高成模率[15]。因此，本次試驗選擇DEN聯(lián)合CCL4共同誘導(dǎo)小鼠肝癌發(fā)生，以達(dá)到高效建立小鼠肝癌模型的目的[16-18]。判斷肝癌模型的相關(guān)指征主要有模式動物體重變化，形態(tài)特征，肝組織結(jié)構(gòu)，肝脾指數(shù)，血液中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、肌酐和總膽紅素的含量及血清中總蛋白、白蛋白和尿素氮含量變化等[19]。本實驗主要從這幾個方面進(jìn)行不同時間點的監(jiān)測，以呈現(xiàn)出小鼠肝癌模型構(gòu)建過程中相關(guān)指征的動態(tài)變化趨勢，為肝癌模型構(gòu)建及其病理研究提供參數(shù)和技術(shù)依據(jù)[19]。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

實驗動物：SPF級30日齡雄性C57BL/6J小鼠42只，體重18～22 g，購自長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司[SCXK(吉)-2016-0003]，在吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心屏障環(huán)境下飼養(yǎng)[SYXK(吉)-2018-0001]，并按照3R原則給予人道關(guān)懷。該研究已經(jīng)通過吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院倫理委員會審批，審批編號：2019年49號。

1.2 主要試劑與儀器

二乙基亞硝胺(DEN， Sigma)；四氯化碳(天津市富宇精細(xì)化工有限公司)；橄欖油(成都市科龍化工試劑廠)。

多功能酶標(biāo)儀(型號：HBS-1096)，電子分析天平(型號：FA2204B)，恒溫箱(型號：DHP120)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物分組及造模

對照組(control group)：正常雄性C57BL/6J小鼠21只，常規(guī)喂養(yǎng)；模型組(model group)：正常雄性C57BL/6J小鼠21只，常規(guī)喂養(yǎng)。

1.3.2 給藥方法

小鼠購入后在屏障環(huán)境下進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)1 d，第2天針對模型組小鼠首先用DEN進(jìn)行1次腹腔注射100 mg/kg(生理鹽水配制)；第2周再用DEN進(jìn)行一次腹腔注射100 mg/kg(生理鹽水配制)，第3周后開始以CCl4和橄欖油(配制體積比20∶80)灌胃，0.05 mL/10 g，每周2次；持續(xù)灌胃至第20周，其中從第8周開始，CCl4和橄欖油溶液劑量增加為0.10 mL/10 g。

1.3.3 常規(guī)觀察指標(biāo)及檢測指標(biāo)

DEN誘發(fā)肝癌的過程大概要經(jīng)過3個階段，即肝硬變前期(1～8周)、肝硬變期(8～14周)、癌變期(14～20周)；分別于造模后4、8、12、16、20、24、28周檢測各項指標(biāo)，基本能反映出肝癌誘變不同時期的變化特點。

誘癌開始后，每周稱量小鼠體重；分別于造模4、8、12、16、20、24、28周后，隨機選擇模型組小鼠3只，對照組小鼠3只脫頸致死；觀察兩組小鼠肝的形態(tài)、顏色、質(zhì)地和肉眼可見的肝表面癌結(jié)節(jié)數(shù)(拍照留存)；取肝、腎稱重并計算肝、腎/體重比，即肝脾指數(shù)。并于20周開始計算小鼠存活率和誘癌成功率，存活率=每組存活的小鼠數(shù)/各組小鼠總數(shù) × 100%，誘癌成功率=誘癌成功小鼠數(shù)/各組小鼠數(shù) × 100%。

將造模4、8、12、16、20、24、28周后處死的3只小鼠，取肝、腎和脾組織，一部分送去病理檢測，一部分用作轉(zhuǎn)錄組測序，剩余組織的凍存液氮中以備后續(xù)使用。提取血液測定其中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、肌酐和總膽紅素的含量及血清中總蛋白、白蛋白和尿素氮含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠表征及肝癌發(fā)生狀況

42只小鼠在肝癌誘發(fā)過程中，模型組小鼠死亡2只，一只在建模后的第6周死亡，另一只在建模后的第8周死亡。存活率為90.5%。死亡小鼠進(jìn)行病理檢測主要表現(xiàn)在肝水腫、充血、有大量炎細(xì)胞浸潤。在建模的過程中，對照組小鼠肝無異常變化，肝色澤紅潤，表面光滑(見圖1-1)。模型組小鼠普遍出現(xiàn)食欲下降、毛色暗淡、脫毛、整體狀態(tài)差、體重降低等現(xiàn)象，相比對照組小鼠，模型組小鼠的肝組織在不同時期呈現(xiàn)出不同狀況：在建模早期肝體積逐漸增大，顏色仍舊紅潤、質(zhì)軟、表面光滑，未見結(jié)節(jié)(圖1-2)；建模中期，小鼠肝重量增加，顏色逐漸變暗、變硬，表面凹凸不平、粗糙，有大小不等的結(jié)節(jié)，(圖1-3)；建模后期，小鼠肝表面出現(xiàn)大小不一、直徑在1.0～3.0 mm之間的灰白色肝結(jié)節(jié)(圖1-4)。建模成型后，肝表面粗糙、質(zhì)硬，可見諸多結(jié)節(jié)，既有4.0～15.0 mm的單發(fā)大結(jié)節(jié)，也有1.5～3.0 mm的多發(fā)灰白色小結(jié)節(jié)(圖1-5)。模型組存活的19只小鼠中，誘癌成功15只，成功率為78.95%。

圖1 肝癌模型小鼠各階段肝的形態(tài)變化Figure 1 Changes of gross appearance of the mouse livers

2.2 各組小鼠體重變化

與對照組小鼠比較，造模前各組組小鼠體重?zé)o明顯差異?；瘜W(xué)誘導(dǎo)建模第4周時，模型組小鼠平均體重開始下降。造模 4～12周，模型組小鼠體重均低于正常組；造模第12～28周，模型組小鼠均明顯低于正常組小鼠(P<0.05，圖2)。

圖2 各組小鼠體重變化對比Figure 2 Comparison of the changes of body weight in the mice

2.3 各組小鼠肝、腎功能和肝中蛋白含量的變化

實驗測定、分析了不同時期建模組和對照組小鼠的肝腎功能變化，結(jié)果表明：模型組小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、肌酐和總膽紅素顯著升高，說明模型組小鼠肝受到嚴(yán)重?fù)p傷。與對照組小鼠比較，模型組小鼠血清中總蛋白、白蛋白和尿素氮含量顯著降低，模型小鼠血清中尿素氮可能與小鼠體內(nèi)低蛋白水平有關(guān)，而γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(γ-GT)和堿性磷酸酶(ALP)雖有輕微增高的變化，但變化不明顯(圖3)。

2.4 各組小鼠肝、脾指數(shù)變化

模型組小鼠的肝、脾指數(shù)均明顯高于對照組，同時，隨著建模時間的延長，肝脾指數(shù)逐漸增加，表明建模組小鼠的肝脾受到一定程度的損傷(表1)。

2.5 各組小鼠肝、腎病理結(jié)果

成模結(jié)束后，選取肝癌模型小鼠和對照組小鼠進(jìn)行HE染色病理分析，結(jié)果顯示：對照組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)無異?，F(xiàn)象，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞索以中央靜脈為中心向四周整齊排列；而模型組小鼠肝組織逐漸出現(xiàn)異常，建模12周以前，肝的變化主要表現(xiàn)在細(xì)胞變大，并呈現(xiàn)空泡狀變化，細(xì)胞排列混亂，細(xì)胞核都擠向細(xì)胞一側(cè)，同時能夠觀察到有部分炎性細(xì)胞的浸潤，可以看到為數(shù)不多的由于肝細(xì)胞凝固壞死形成的嗜酸性小體。在建模16周后，模型組小鼠的肝小葉結(jié)構(gòu)逐漸消失不見，形成假小葉，中央靜脈缺失或偏離原來位置，肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)紊亂，并出現(xiàn)肝細(xì)胞越來越多的壞死，有些會出現(xiàn)空泡狀的變化，細(xì)胞核出現(xiàn)大小不一的現(xiàn)象，同時很容易觀察到嗜酸性小體，細(xì)胞形狀出現(xiàn)明顯變化。建模20周后，模型組小鼠肝細(xì)胞狀態(tài)明顯表現(xiàn)出肝癌特征，細(xì)胞排列非常紊亂并擁擠，細(xì)胞的大小、形態(tài)各異，可見巨核，核異型性非常明顯，間質(zhì)間可見較明顯的炎細(xì)胞浸潤(圖4)。

圖3 各組小鼠肝、腎功能和肝中蛋白含量的變化Figure 3 Changes of liver and kidney functions and liver protein contents in the mice

時間Time組別Groups肝指數(shù)Liver index脾指數(shù)Spleen index4周4 weeks對照組Control group0.59±0.1280.086±0.028模型組Model group0.58±0.1280.085±0.0288周8 weeks對照組Control group0.60±0.1260.084±0.027模型組Model group0.70±0.153?0.093±0.02612周12 weeks對照組Control group0.59±0.1260.086±0.027模型組Model group0.93±0.197?0.101±0.026?16周16 weeks對照組Control group0.58±0.1290.085±0.029模型組Model group1.06±0.226?0.116±0.026?20周20 weeks對照組Control group0.59±0.1260.086±0.027模型組Model group1.20±0.359?0.136±0.030?24周24 weeks對照組Control group0.60±0.1250.086±0.023模型組Model group1.38±0.359?0.140±0.031?28周28 weeks對照組Control group0.58±0.1290.086±0.027模型組Model group1.45±0.412?0.147±0.038?

注：與對照組比較，*P<0.05。

Note. Compared with the control group,*P<0.05.

圖4 肝病理圖(HE染色，×200)Figure 4 Pathological changes in the liver tissues of the mice at different stages.HE staining

3 討論

肝癌動物模型的建立是肝癌研究的基礎(chǔ)，而化學(xué)誘發(fā)小鼠肝癌模型是基礎(chǔ)科學(xué)研究和臨床研究中經(jīng)常使用的模型建立方式，同時由于其類似人類肝癌形成過程，因此，是目前進(jìn)行肝癌研究的首選建模方式[20-22]。

DEN作為比較常用的化學(xué)致癌劑，致癌率較高，因此，常被用作肝癌動物模型的啟動劑和致癌劑[23]。另外，有研究表明，CCL4對肝也具有較大的毒性，也會對肝造成損傷，因此，本實驗通過以DEN為啟動劑進(jìn)行腹腔注射，在這里經(jīng)過改良，將一次注射，改為兩次注射，以增加啟動刺激性，為成功建模奠定基礎(chǔ)[19]。而后通過以CCl4和橄欖油混合液進(jìn)行灌服，聯(lián)合誘發(fā)小鼠肝癌模型的建立，通過這種方式建立模型的病理變化會經(jīng)過肝炎、肝硬化、非典型性增生，最后肝癌形成的過程，這些變化過程與人類肝癌形成的變化過程非常相似，另外，此種模型的重復(fù)性和穩(wěn)定性都較好，因此，該模型的建立對研究人類肝癌具有重要作用，為肝癌的治療奠定基礎(chǔ)[19-22]。本實驗以C57BL/6J小鼠為實驗對象，在誘癌實驗早期觀察到模型小鼠的病理改變主要為肝細(xì)胞的炎性損傷、增生浸潤引起肝組織的變性和腫大。在誘癌的中-晚期則出現(xiàn)嗜酸性結(jié)節(jié)小體、空泡結(jié)構(gòu)和肝硬化、肝癌的發(fā)生[10,23]。本實驗組肝細(xì)胞性肝癌陽性率為78.95%，肝組織均呈明顯肝硬化改變。這些病理改變與人類肝癌在肝硬化的基礎(chǔ)上發(fā)生有一定的相似之處[24-25]。小鼠在誘癌實驗過程中死亡的主要原因在早期和中期為誘癌劑的毒性作用引起的中毒性死亡，而在晚期則主要是因為腫瘤晚期動物體質(zhì)衰竭引起的死亡[26]。

由于致癌劑二乙基亞硝胺(DEN)的化學(xué)毒性作用，傳統(tǒng)一次性給藥方法后小鼠在誘癌階段的實驗性死亡明顯增加，影響了誘癌數(shù)量及誘癌周期，導(dǎo)致實驗觀察結(jié)果的誤差[27]。在本研究中筆者采用化學(xué)誘癌劑DEN分次飼喂法結(jié)合后期添加一定配比CCl4/橄欖油建模方法，這樣可緩解誘癌劑對建模小鼠的毒副作用，有效地降低了建模小鼠的實驗性死亡率。

本實驗中，通過對模型組小鼠和對照組小鼠體重、肝脾指數(shù)、病理、血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT)、肌酐和總膽紅素及血清中總蛋白、白蛋白和尿素氮含量的檢測獲得了建模不同時期的動態(tài)數(shù)據(jù)。在建模初期各項指標(biāo)與對照組相差無幾，隨著建模時間的延長，模型組小鼠逐漸表現(xiàn)出肝癌的癥狀。實驗結(jié)果顯示，在建模16周左右，建模小鼠各項指標(biāo)表現(xiàn)出較為顯著的變化，24～28周均表現(xiàn)出明顯的肝癌癥狀，實驗對不同時間節(jié)點檢測分析的表征數(shù)據(jù)能夠很好體現(xiàn)肝癌模型的發(fā)展變化。

通過本肝癌小鼠建模實驗，筆者認(rèn)為：①建模小鼠的分組要合理，每籠動物7～8只，盡可能給動物充足的活動空間；②保證每只動物同時進(jìn)食，藥量均勻；③飼料、飲水要清潔充足；④由于小鼠有啃食死鼠的習(xí)性，如發(fā)現(xiàn)精神狀態(tài)差、不好動、不進(jìn)食的動物，要分籠喂養(yǎng)，以防患病小鼠死后被同類吃掉；⑤誘癌劑DEN應(yīng)按照所需配制濃度充分溶解于生理鹽水。

本實驗結(jié)果表明，隨著誘癌時間的延長，小鼠肝硬化程度逐漸加重，肝癌的發(fā)生率明顯上升。發(fā)生腫瘤的模型小鼠肝表面見有大小不等的灰白色結(jié)節(jié)，腫塊增大、數(shù)量增多并相互融合。說明本實驗所誘發(fā)的小鼠肝癌與人類肝癌相似，本模型可以模擬人類肝癌發(fā)生、發(fā)展的基本過程[28]。