比格犬生理遙測系統(tǒng)的建立

劉艷菊，葛 鵬，徐德璐，鐘 飛，蘭天龍，周博宇，胡 雷*

(1.天津藥物研究院新藥評價有限公司，天津 300301； 2.天津市新藥非臨床評價技術工程中心，天津 300301)

比格犬血壓的檢測方法包括傳統(tǒng)的麻醉動物插管法和新興的生理遙測技術。插管法是通過插管手術檢測麻醉動物的生理信號，由于手術創(chuàng)傷和麻醉劑的作用，容易引起動物應激，導致血壓、心電、呼吸等生理信號產生較大波動，并且監(jiān)測時間很受限制，很難實現(xiàn)對血壓等生理參數(shù)進行長期有效監(jiān)測[1]。應用生理遙測技術可以同時對動物在清醒狀態(tài)下的心電、血壓、呼吸等指標[2]進行檢測，由生理遙測技術所采集數(shù)據的可靠性已經得到各國專家的認可，因此《藥物安全藥理學研究技術指導原則》建議采用遙測技術進行清醒動物心血管系統(tǒng)指標的測定。

目前國內通過遙測技術檢測比格犬血壓的方法主要分為尾套法和植入法。尾套法是在比格犬尾根部綁上壓力綁帶，應用遙測技術通過周期性循環(huán)充放氣間接檢測動物血壓。相較于傳統(tǒng)的插管法，尾套法檢測的是清醒動物的血壓，排除了麻醉藥對生理指標的干擾，但是該方法只能間斷性的、間接的檢測動物血壓，無法持續(xù)、直觀的觀察血壓的變化，數(shù)據離散度大、重復性差[1-3]，并且受充氣放氣時間限制，測量數(shù)值少，不適合應用于對血壓影響較敏感的藥物實驗[4]。植入法是通過手術方法將生物傳感器植入動物體內，再由接收和顯示等一系列裝置來測定清醒狀態(tài)下實驗動物的生理指標，如血壓、心率、心電圖、呼吸等。目前國內比較常用的生物傳感器為DSI公司生產的植入子[5-7]，但是DSI植入子造價較高，限制了其在GLP實驗室的廣泛應用。

本研究旨在建立一種數(shù)值更加穩(wěn)定、可靠，并且造價更為低廉的模型犬生理遙測系統(tǒng)，為我國安全藥理學研究提供技術支撐與參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

普通級10～11月齡比格犬，體重為9～11 kg，上海新岡實驗動物場提供[SCXK(滬)2017-0006]。飼養(yǎng)于天津藥物研究院新藥評價有限公司動物實驗樓[SYXK(津)2016-0009]，單籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)間溫度控制在16℃～26℃，濕度40%～70%，換氣次數(shù)每小時不少于8次全新風，光照為12 h明12 h暗交替。實驗動物的使用完全遵守中華人民共和國的相關實驗動物福利的管理規(guī)定，動物使用前向本中心的動物福利委員會(IACUC)提出申請，經動物福利委員會批準后使用。

1.2 主要試劑與儀器

戊巴比妥鈉(每瓶25 g，德國默克)；注射用氨芐西林鈉(每瓶0.5 g，石藥集團中諾藥業(yè))；硫酸阿米卡星注射液(2 mL∶0.2 g，齊魯制藥有限公司)；硫酸阿托品注射液(1 mL∶0.5 mg，天津金耀氨基酸有限公司)；肝素鈉注射液(1 mL∶1.25萬單位，天津生物化學制藥有限公司)。

生理信號遙測系統(tǒng)(型號EMKApack8A-6E-2RESP-ACT-TEMP-NIBP-VAP，法國EMKA公司生產)；VAP血管通路(產品編號INLINEPORT-AC-7IS，美國Norfolk醫(yī)藥生產)；手術器械、注射器、敷料等。

1.3 實驗方法

1.3.1 術前準備

術前1 d，剃除犬頸部至背部之間的被毛，并用紗布蘸取溫水擦拭裸露皮膚，隔夜禁食。為避免麻醉或手術過程中發(fā)生嘔吐，麻醉前30 min肌注1支硫酸阿托品注射液。

(一)VAP植入手術(見圖1)

圖1 VAP植入示意圖Figure 1 Schematic diagram of the VAP implantation

動物麻醉后剝離一側頸動脈，在動物背部做一切口，從背部切口向頸部切口做一皮下隧道，將注滿生理鹽水的VAP血管通路穿過皮下隧道，一端置于背部切口，另一端置于頸部切口。將分離出的頸動脈近心端用靜脈夾夾住，遠心端結扎并在近心側剪一小口，將頸部切口處的通路導管從動脈切口處向近心端方向插入4～8 cm，雙側結扎，將埋在背部皮下的通路導管套上硅膠塞固定，并用生理鹽水沖洗導管，1000 IU/mL的肝素鈉溶液封管，最后縫合包扎，放回籠內飼養(yǎng)。

1.3.2 術后護理

(一)抗感染處理

術后應給予常規(guī)抗感染治療，肌注2支注射用氨芐西林鈉和1支硫酸阿米卡星，抗生素治療至少5 d，視動物恢復情況可適當延長療程。每天用碘伏涂抹創(chuàng)口消毒并及時更換紗布，保持創(chuàng)口的清潔。如發(fā)生創(chuàng)口感染，應用大量生理鹽水沖洗傷口，涂抹碘伏，并適當加大抗生素劑量或更換抗生素品種。通常7～10 d可拆除縫合線，拆線后根據創(chuàng)口情況予以消毒。

(二)抗凝處理

術后連續(xù)3 d，每天用注射器插入硅膠塞抽取導管內陳舊血液，然后用生理鹽水沖洗導管，最后用2 mL∶1.25萬單位的肝素鈉注射液封管，之后每隔3 d進行一次抗凝處理，連續(xù)3周后改為每周1次。

(三)減壓處理

術后部分動物頸部創(chuàng)口會有血性滲出導致局部腫脹、內壓增高，此時要及時穿刺抽取滲出物，以減輕局部壓力，利于手術恢復。穿刺時，動物采取站位，專人保定，局部消毒，選擇低位作為進針點。觀察抽出液體的顏色、澄明度和體積，穿刺完畢要及時消毒。

(四)術后營養(yǎng)補充

由于受到手術的刺激與損傷，有些動物會出現(xiàn)食欲下降的情況，可以適當通過靜脈推注葡萄糖注射液和生理鹽水來補充能量，對于飲食正常的動物可適當增加喂食量，使動物多攝入營養(yǎng)，盡快恢復體力，以利于創(chuàng)口愈合。

(五)模型犬數(shù)據采集

動物創(chuàng)口愈合后，將模型犬胸腹部被毛剃出，分別在左、右兩側第6肋間與胸骨的連接處和第1對乳頭下緣的皮膚表面粘上心電電極貼，然后將模型犬固定于輸液架上的布兜內；將呼吸綁帶系于動物胸腔劍突處，連接呼吸換能器；將壓力換能器上的采集針與埋入動物體內的VAP血管通路的硅膠塞相連接，最后將心電電極、呼吸換能器和壓力換能器與采集盒連接，打開采集盒即可檢測血壓、心電和呼吸指標。

(六)觀察指標

血壓指標：舒張壓(DBP)、收縮壓(SBP)、平均動脈壓(MBP)；心電指標：心率、PR間期、QRS波群、R波電壓、P波電壓、S-T段電壓、QT間期、QTc間期；呼吸指標：呼吸頻率和呼吸幅度。心電指標采樣頻率為500 Hz，血壓指標采樣頻率為200 Hz，呼吸采樣頻率為200 Hz。應用EMKA生理信號遙測系統(tǒng)的iox軟件采集數(shù)據，ecgAUTO軟件分析各指標。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 比格犬生理遙測系統(tǒng)穩(wěn)定性的驗證

6只VAP模型犬每周檢測一次血壓、心電和呼吸指標，數(shù)據采集時間限定在08:00～10:00之間，避開飼養(yǎng)員喂食和清掃時間，檢測周期為四周，將比格犬四次的生理指標進行多重比較可見：模型犬四周的血壓平穩(wěn)、心率較齊、心電各指標未見明顯波動，盡管呼吸頻率和呼吸幅度出現(xiàn)輕微波動，但是未出現(xiàn)統(tǒng)計學差異(見表1～3)。

2.2 清醒犬與麻醉犬生理指標的比較

應用EMKA生理信號遙測系統(tǒng)采集24只VAP模型犬清醒狀態(tài)下和24只麻醉犬穩(wěn)定狀態(tài)下的生理指標。從數(shù)據上看，麻醉犬舒張壓、收縮壓和平均動脈壓均明顯高于模型犬；與清醒模型犬比較，麻醉犬心率明顯加快，P-R間期縮短，QTc間期顯著延長，并且R波、P波和S-T段電壓也出現(xiàn)統(tǒng)計學差異；此外，麻醉犬呼吸頻率和呼吸幅度均低于模型犬(見表4～6)。

表1 VAP模型犬血壓

表2 VAP模型犬心電

表3 VAP模型犬呼吸

表4 清醒犬與麻醉犬血壓的比較

注：與清醒犬組相比，*P<0.05。

Note.Compared with the conscious dog group，*P< 0.05.

表5 清醒犬與麻醉犬心電的比較

注：與清醒犬組相比，*P<0.05。

Note. Compared with the conscious dog group，*P< 0.05.

表6 清醒犬與麻醉犬呼吸的比較

注：與清醒犬組相比，*P<0.05。

Note. Compared with the conscious dog group，*P< 0.05.

2.3 比格犬生理遙測系統(tǒng)敏感性的驗證

6只VAP模型犬灌胃給予阿齊沙坦酯，與給藥前比較，藥后1、2小時動物舒張壓(DBP)、收縮壓(SBP)和平均動脈壓(MBP)降低(見圖2)，與文獻[8-10]報道的阿齊沙坦酯降壓的藥理作用一致，說明本系統(tǒng)能靈敏檢測到血壓指標的的相關變化。特非那定為典型的QT 間期延長藥物[11-12]，4只模型犬灌胃給予特非那定，與給藥前比較，藥后比格犬心率下降，PR間期、QRS波群延長，QTc 間期明顯延長，結果與文獻[13]報道基本一致(見圖3)。

注：給藥后與給藥前比較，*P<0.05，** P <0.01。圖2 VAP模型犬給藥前后血壓的比較Note. Compared after administration with before administration, *P<0.05，** P <0.01.Figure 2 Comparison of the blood pressure before and after drug administration in the VAP model dogs

注：給藥后與給藥前比較，*P<0.05，**P <0.01。圖3 VAP模型犬給藥前后心電的比較Note. Compared after drug administration with before administration, *P<0.05，**P <0.01.Figure 3 Comparison of the ECG before and after drug administration in the VAP model dogs

3 討論

要想獲得成功的VAP動物模型，首先要有合格的實驗動物作為保證，術前在挑選動物時，應選擇體格健壯、比例勻稱的成年比格犬，便于統(tǒng)一VAP血管通路的植入及位置固定；由于檢測的是動物清醒狀態(tài)下的指標，因此應選擇性格溫順、依從性強的動物。其次，在手術過程中要做好消毒工作，盡量接近無菌條件；頸部和背部的創(chuàng)口不宜過大，以免破壞皮下小血管造成失血，影響術后恢復；不同動物導管植入位置盡量統(tǒng)一，例如均植入右側頸動脈，硅膠塞埋入皮下位置不宜過深，否則影響血壓采集針的進入，而且埋入位置應避開創(chuàng)口，以防影響創(chuàng)口愈合，導管在皮下的走形應盡量避免出現(xiàn)多次回彎和折疊，否則會影響血壓的傳導，導管進入血管的深淺和結扎線的松緊同樣會影響血壓信號的傳導。最后，術后一定要做好抗感染治療，根據動物恢復情況適當延長抗生素給藥時間，或者及時更換抗生素，若皮下有滲出液應及時引流；術后抗凝處理是模型成功的關鍵，應定時對模型進行抗凝處理，針對個別容易產生血栓的動物可適當增加抗凝頻率，在日常一般觀察中應密切觀察模型動物是否出現(xiàn)栓塞癥狀，對于栓塞動物酌情進行溶栓治療，對于無搶救價值的動物應實施安樂死并進行剖檢，便于總結積累經驗，更好的指導下次手術。此外，在模型犬的使用過程中一些內外界的干擾因素也不容忽視，例如動物的指標存在正常生理波動、動物進食、人員靠近、外界噪音等也可以影響動物的生理活動，因此在動物進入正式實驗前應對動物進行馴化，提高動物抗干擾能力，并且在采集數(shù)據時應盡量減少人工干預和外來刺激，例如減少實驗人員的輪換、增強實驗室的隔音效果等。

在VAP模型犬穩(wěn)定性研究中可見，模型犬四周之內血壓、心電基本上無差異變化，數(shù)據穩(wěn)定，具有可重復性；四次呼吸指標兩兩比較均未出現(xiàn)統(tǒng)計學差異，但是從數(shù)據上看，與第一次檢測結果比較，后三次模型犬的呼吸頻率輕微降低，呼吸幅度略有增大，推測可能是由于動物在進行第一次指標檢測會出現(xiàn)緊張、不適、應激[14]等情況，因此出現(xiàn)呼吸頻率加快、呼吸幅度減小的現(xiàn)象，提示可以通過對動物進行多次馴化，提高動物抗干擾能力，以保證呼吸數(shù)據的準確性和穩(wěn)定性。

與清醒的模型犬比較，麻醉狀態(tài)下比格犬呼吸頻率降低、呼吸幅度減小，分析可能是由巴比妥類麻醉劑呼吸抑制作用[15]引起的。在本研究中還發(fā)現(xiàn)麻醉犬血壓明顯高于模型犬，究其原因除了與血壓檢測部位不同有關，還可能與動物的麻醉程度有關，動物處于淺麻醉狀態(tài)下交感神經興奮，會出現(xiàn)血壓升高和心率加快的情況，反之亦然。QTc間期是用心率校正后的QT間期，是反映心臟去極化和復極作用的指標，QTc間期延長表示心臟復極延遲，反映了心電異常，通常與心律失常敏感性增高密切相關，因此QTc間期是評價藥物心臟毒性的重要指標。國內學者蔣文燕等[16]將動物麻醉后與麻醉前進行自身對照，發(fā)現(xiàn)QT間期在麻醉45 min后明顯延長，在本研究中也發(fā)現(xiàn)麻醉動物的QTc間期明顯大于清醒犬。若用麻醉動物評價藥物心臟毒性，容易對評價結果產生干擾，產生假陽性，以致誤殺具有研發(fā)價值的受試物。24只模型犬心率平均值為(116.37±25.58) bpm，接近文獻報道值66～130 bpm[17-18]的上限，舒張壓和收縮壓平均值分別為(90.87±14.35)mmHg、(129.72±18.80)mmHg，與國外學者Nakagawa等[19]采用Telemetry方法所報道結果基本一致，但是略低于國內實驗動物學教材所列舉的舒張壓和收縮壓的值(100 mmHg、148 mmHg)，分析原因可能是該方法對犬的刺激干擾較小，因此更加接近動物正常生理狀態(tài)下的平穩(wěn)血壓。

VAP模型犬生理遙測系統(tǒng)應用于藥物安全性評價具有諸多優(yōu)勢：(1)與傳統(tǒng)的麻醉插管法比較，排除了麻醉藥的干擾和限制，數(shù)據更接近動物自然狀態(tài)下的數(shù)值，適合多種給藥方式，可較長時間連續(xù)監(jiān)測生理指標，洗脫后仍可重復使用多次，減少了動物的使用，更加符合AAALAC對動物福利的要求，同時也降低了藥物研發(fā)成本；(2)尾套法采集的是外周血壓，屬于間接檢測法，而本方法是直接檢測大動脈的血壓，數(shù)值更加準確、連續(xù)、穩(wěn)定，在評價降壓藥時具有明顯優(yōu)勢；(3)與DSI植入式遙測法比較， VAP模型犬的植入子更加低廉，較大程度上節(jié)約了研究成本。

目前遙測技術受到各地方GLP實驗室的青睞，已廣泛應用于藥物安全性評價當中，然而將VAP植入手術與遙測技術相結合的試驗方式在我國尚無充足的經驗可借鑒，因此仍存在一些問題有待進一步研究和探索，例如導管植入的深淺、導管在皮下的走形、結扎線的松緊以及導管內的抗凝處理目前尚無統(tǒng)一標準。其中導管的抗凝處理是模型成功的關鍵，抗凝劑量過低，容易引起血栓形成，影響血壓信號的傳輸；抗凝劑量過高，動物凝血功能異常，容易與具有抗凝作用的受試物產生協(xié)同作用，因此不建議將VAP模型犬應用于抗凝藥的安全性評價中。

綜上所述，本研究建立的比格犬生理遙測系統(tǒng)數(shù)值穩(wěn)定、可靠、重復性好、靈敏性高，并且成本低廉、動物利用率高，將其應用于藥物安全藥理學評價中具有可行性。