王芳，肖雷，朱沛，朱建波

(1.云南省畜牧獸醫(yī)科學院，云南 昆明 650224； 2.開遠市動物疫病預防控制中心，云南 開遠 661600)

藍舌病是由藍舌病病毒(Bluetongue Virus，BTV)引起的一種通過媒介昆蟲庫蠓傳播的非接觸性病毒性傳染病。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為法定報告的多種動物共患傳染病，我國將其列為一類動物傳染病[1]。BTV 屬于呼腸弧病毒環(huán)狀病毒屬病毒，目前已確認存在至少27 種血清型[2，3]，其中，BTV-8(藍舌病歐洲8型)近年來曾在比利時、荷蘭、法國、德國等歐洲國家暴發(fā)，引起綿羊和牛大量發(fā)病，造成了嚴重的經濟損失。我國自1979 年在云南省師宗縣首次分離出BTV[4]后，至今在全國范圍內已分離到11 個血清型的BTV 毒株[5]，在我國31個省(市、自治區(qū))都發(fā)現有藍舌病抗體陽性動物。為進一步了解2018年藍舌病在我國的流行分布情況，對來自重慶、新疆、吉林、湖北、內蒙古、貴州、河北、廣西和云南等9個省(市、自治區(qū))93個縣(市、區(qū)、旗)的牛羊血清進行藍舌病C-ELISA抗體檢測及BTV-8型中和抗體檢測。

1 材料與方法

1.1 血清樣本來源

血清樣品由各省(市、自治區(qū))的動物疫病預防控制中心負責采集，送云南省畜牧獸醫(yī)科學院熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室-20℃保存。樣品采集情況見表1。

1.2 試驗試劑

BTV C-ELISA抗體檢測試劑盒、BTV-8標準株均由云南省畜牧獸醫(yī)科學院熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室提供。

1.3 BTV C-ELISA試驗方法

在ELISA板中每孔分別加入10μL的待測血清、陽性血清、弱陽性血清、陰性血清(每份加2孔)，置37℃溫育30min；用試劑盒提供的樣品稀釋液按照1:100倍稀釋兔抗BTV抗體 (競爭抗體)，每孔加50μL競爭抗體，在37℃溫箱里溫育60min；用PBST洗液洗板2次，拍干，按1:1000稀釋羊抗兔IgG-HRP酶標抗體，每孔加50μL，在37℃溫箱里溫育30min；用PBST洗液洗板5次，拍干，每孔加入50μL底物反應液，37℃避光溫育10min，每孔加入終止液50μL終止反應，15min內在酶標儀450nm波長下讀取OD值。結果判定：抑制率(PI)=(陰性對照OD450平均值-樣品血清OD450) / 陰性對照OD450平均值×100%,抑制率≥50%時判為抗體陽性，否則為陰性。

1.4 BTV-8標準毒株毒價測定

96孔板中每孔加入細胞懸液100μL，將病毒按100-10-10倍比稀釋，依次加入96孔板中，每孔加50μL，每個稀釋度做8孔，吸附1h后，接毒孔中加入50μL維持液，剩余對照孔中加入100μL維持液，37℃培養(yǎng)5d，觀察細胞病變的情況，用Reed and Mench法計算毒價。

1.5 微量中和試驗

將C-ELISA陽性的待檢血清做1:10倍稀釋來中和100個TCID50的病毒，存在中和作用時，再對這些血清進一步稀釋為1:20和1:40做微量中和試驗，中和滴度大于1:40的判定為陽性。

表1 血清樣本采樣地點及數量統(tǒng)計表

2 結果

2.1 BTV C-ELISA結果

圖1 各省(市、自治區(qū))BTV血清抗體陽性率比較

對5 721份血清樣本進行BTV C-ELISA抗體檢測，其中1769份血清樣本為BTV抗體陽性，平均陽性率為30.92%，被調查的省份均檢出BTV抗體陽性樣品，結果見表2。其中，以云南省的抗體陽性率最高，達75.90%，吉林省的陽性率最低，僅為4.33%，各省(市、自治區(qū))陽性率差異明顯，見圖1。在所檢測的樣品中，云南的樣品全是牛血清樣品，其他省、市、自治區(qū)牛和羊血清樣品都有，合計檢測牛血清樣品1827份，陽性率為44.12%，羊血清樣品3894份，陽性率為23.73%，各省(市、自治區(qū))牛、羊血清樣品BTV抗體檢測結果見表3。

表2 血清樣本BTV C-ELISA抗體檢測結果

2.2 中和試驗定型

將1769份BTV抗體陽性的血清做微量中和試驗，其中有1540份作1:10倍稀釋時有中和作用，將這1540份血清進一步稀釋為1:20、1:40再次進行微量中和試驗，這1540份血清對BTV-8均無中和保護，全判定為BTV-8抗體陰性。

3 討論

BTV 主要通過庫蠓吸血傳播，其分布受庫蠓活動影響極大。庫蠓孳生于水塘、沼澤、湖泊附近的草叢、樹林、洞穴等避風、避光潮濕處。庫蠓活動常常受環(huán)境因素的影響，特別是溫度、濕度、降雨量等，有明顯的季節(jié)性和地域性[6]。

表3 牛、羊血清樣品BTV C-ELISA抗體檢測結果

通過對2018年我國9個省(市、自治區(qū))93個縣(市、區(qū)、旗)牛、羊血清樣品進行BTV C-ELISA抗體檢測，平均陽性率高達30.92%。在9個省(市、自治區(qū))都檢出抗體陽性樣品，在93個縣(市、區(qū)、旗)檢出陽性樣品，表明BTV在我國的感染已相當普遍，這與我國庫蠓種類多、分布廣泛相對應。

此次云南省樣品的BTV抗體陽性率高達75.90%，與這些樣品均來源于云南南部與緬甸、老撾和越南接壤的10個邊境縣，而且全部是牛血清樣品密切相關。云南的南部緯度低，氣候高熱高濕，適宜庫蠓的生存、繁殖，庫蠓活動頻繁。同處低緯度具有相似氣候特點的廣西的牛血清樣品的抗體陽性率也高達75%。

我國北方的河北、內蒙古和吉林等地樣品的BTV抗體陽性率都不到10%，與這些地方緯度較高、冬季嚴寒漫長、年均氣溫低、庫蠓活動受限有關。

新疆樣品的BTV抗體陽性率也較高，其中牛的陽性率為35.23%，羊的陽性率為41.68%，這是一個值得重視的情況。新疆位于亞歐大陸深處，雖然大部分地區(qū)常年降雨量小，冬季寒冷，夏季炎熱，不利于庫蠓的生存繁殖。但新疆地域廣闊，除有大面積的沙漠戈壁等不利于庫蠓生存的環(huán)境外，也有一些森林、草原和濕地為庫蠓提供了繁衍生息所需的適宜條件，這些地方也是主要的牛羊放牧場所，為BTV的傳播提供了良好條件。

本研究對我國多地的牛羊進行了BTV血清學調查，覆蓋我國不同氣候類型地區(qū)，樣本量較大，較好的反映了2018年度藍舌病在中國的分布情況，為該病的防控提供了流行病學依據。